不同環(huán)境因素和食品基質(zhì)對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響

單增李斯特菌，是一種革蘭氏陽性菌，在環(huán)境中分布較為廣泛，具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，能在干燥、低溫、高鹽和極端pH等條件下長時間存活[1]。單增李斯特菌是一種人畜共患病食源性致病菌，主要以食物為媒介進行傳播，可感染禽、蛋、肉類、乳制品、海產(chǎn)品、水果、蔬菜等食品，其產(chǎn)生的生物膜在食品加工和貯藏過程中長期存在，對食品工業(yè)和消費者都構(gòu)成了安全威脅[2]。誤食被單增李斯特菌污染的食物可導(dǎo)致人類感染李斯特病，致死率高達25%～30%；對老人、孕婦、嬰兒及免疫力低下人群的影響較大，臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、自然流產(chǎn)等癥狀[3]。因此，防治單增李斯特菌的污染問題是食品安全領(lǐng)域的研究重點之一。

乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種小分子抗菌肽，由34個氨基酸組成；在細菌素分類中屬于第Ⅰ類細菌素(羊毛硫抗生素)，對多種革蘭氏陽性菌(包括芽孢)具有良好的抑制作用[4]。Nisin的抑菌機制主要分為2種模式，第一種是Nisin與細菌細胞膜結(jié)合后，其碳端與脂質(zhì)通過靜電相互作用插入細胞膜形成孔洞，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)容物泄露，細胞迅速死亡；第二種是Nisin與脂質(zhì)Ⅱ(肽聚糖亞基從細胞質(zhì)到細胞壁的主要轉(zhuǎn)運體)結(jié)合，阻止了正常的細胞壁合成，干擾了細胞的正常代謝，從而導(dǎo)致細胞死亡[5]。作為一種微生物來源的天然防腐劑，Nisin具有安全、高效、無毒副作用等特點，進入人體后能快速被水解成氨基酸并被進一步吸收，不會在胃腸道殘留，克服了使用化學(xué)防腐劑的安全隱患問題。MCMANAMON等[6]將Nisin應(yīng)用于鮮切萵苣中，有效地減少了90%的單增李斯特菌，并將貨架期延長2 d。KARINA等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮牛肉糜中加入Nisin后，與對照組相比，單增李斯特菌增長到107 CFU/g的時間從1 d延長至8 d。OSHIMA等[8]發(fā)現(xiàn)Nisin在牛奶布丁中對3種芽孢桿菌都具有良好抑制作用，延長保質(zhì)期的同時減少了熱處理對牛奶布丁風(fēng)味和香氣的影響。盡管Nisin已被廣泛應(yīng)用于果蔬、肉類、乳制品等多種食品體系中，但環(huán)境因素和食品基質(zhì)對食品體系中Nisin抑制單增李斯特菌效果的影響有待進一步研究。

本研究以單增李斯特菌為指示菌，采用2倍梯度稀釋法測定了Nisin的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，通過雙層瓊脂擴散法探究了不同環(huán)境因素(溫度、pH和NaCl濃度)和食品基質(zhì)(脫脂奶粉、卵磷脂和蔗糖)對Nisin抑菌活性的影響，以期為Nisin在食品加工和貯藏中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

單增李斯特菌，揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院肉制品實驗室保藏。

腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)，青島海博生物技術(shù)有限公司。

Nisin(效價為1 163 IU/mg)，山東福瑞達生物科技有限公司；瓊脂粉、脫脂奶粉、大豆卵磷脂、蔗糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯仿(均為分析純)，上海焱晨化工實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，Tomy Digital生物技術(shù)公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SPX-250B-D恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；IN FINITE 200 PRO多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；DT-00電子天平，美國雙杰兄弟有限公司；ZHJH-21093超凈工作臺，上海誠智分析儀器有限公司；FE20K pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 單增李斯特菌菌懸液的制備

將100 μL甘油保藏的單增李斯特菌接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)基中，在37 ℃和150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h后，使用無菌水稀釋至107 CFU/mL，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.2 Nisin MIC的測定

參考MOTA-MEIRA等[9]的方法，配制2 mg/mL的Nisin溶液，采用2倍梯度稀釋法測定Nisin的MIC。分別取50 μL菌懸液與50 μL Nisin梯度稀釋液混合，混勻后于37 ℃培養(yǎng)18 h，在600 nm處測定OD值。以50 μL BHI培養(yǎng)基和50 μL無菌水混合溶液作為陰性對照，以50 μL菌懸液與50 μL無菌水混合溶液作為陽性對照。

1.3.3 抑菌活性的測定

參考DE AZEVEDO等[10]的方法，通過雙層瓊脂擴散法測定抑菌活性。在培養(yǎng)皿底層倒入10 mL 1.8%純瓊脂，凝固后，均勻放置適量的無菌牛津杯，然后將200 μL單增李斯特菌菌懸液接種于20 mL BHI瓊脂培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿，干燥后拔出牛津杯，在孔中加入不同處理的Nisin溶液100 μL，分別以對應(yīng)的溶劑為空白對照。4 ℃冰箱預(yù)擴散8 h，再于37 ℃培養(yǎng)8 h后測定抑菌圈直徑。

1.3.4 溫度對Nisin抑菌活性的影響

取5份相同量的Nisin溶液(4 mg/mL)分別置于25、65、85、100、121 ℃處理30 min，待冷卻后備用，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.3.5 pH對Nisin抑菌活性的影響

配制4 mg/mL的Nisin溶液，分別調(diào)節(jié)pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10，混勻于室溫下靜置4 h后備用。以各個pH梯度的水溶液為空白對照，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.3.6 NaCl濃度對Nisin抑菌活性的影響

分別添加不同質(zhì)量的NaCl于4 mg/mL的Nisin溶液中，使NaCl濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L?；靹蛴谑覝叵蚂o置4 h后備用，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.3.7 脫脂奶粉質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

向4 mg/mL的Nisin溶液中添加不同質(zhì)量的脫脂奶粉，使溶液中脫脂奶粉質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80、100、120 g/L。常溫搖勻30 min后備用，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.3.8 卵磷脂質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

將Nisin加入氯仿中，配制成4 mg/mL的溶液，再加入不同質(zhì)量的卵磷脂，使溶液中卵磷脂質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8、10、12 g/L。常溫搖勻30 min后備用，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.3.9 蔗糖質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

向4 mg/mL的Nisin溶液中添加不同質(zhì)量的蔗糖，使溶液中蔗糖質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 g/L。常溫搖勻30 min后備用，以單增李斯特菌為指示菌測定抑菌活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗指標設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標準差表示。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，均值間采用Duncan法進行多重比較，在0.05水平上進行顯著檢驗(P<0.05)；采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nisin的MIC

不同Nisin質(zhì)量濃度(1.95～1 000 μg/mL)對單增李斯特菌的抑菌曲線如圖1所示。當Nisin溶液質(zhì)量濃度為1.95～250 μg/mL，隨著Nisin濃度的減小，培養(yǎng)液OD值呈上升趨勢，說明該濃度范圍內(nèi)Nisin對單增特菌的生長抑制不足或無抑制作用；當Nisin質(zhì)量濃度在250～1 000 μg/mL時，OD值的增長接近于零，說明單增李斯特菌的生長完全受到抑制。因此，Nisin的MIC為250 μg/mL。王雙童等[11]研究2種天然抗菌肽對單增李斯特菌的抑菌作用，其中Nisin 的MIC為500 μg/mL。馮林慧等[12]研究了Nisin 對幾種常見細菌和真菌的抑制效果，得到Nisin對單增李斯特菌的MIC為500 μg/mL。上述Nisin對單增李斯特菌的MIC均比本研究所得的MIC高，這可能與Nisin的來源、組分和效價存在差異有關(guān)。

圖1 Nisin對單增李斯特菌的MIC
Fig.1 The minimum inhibitory concentration of Nisin against Listeria monocytogenes

2.2 環(huán)境因素對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響

2.2.1 溫度對Nisin抑菌活性的影響

食品的加工及殺菌過程通常需要加熱，Nisin的抑菌穩(wěn)定性與溫度存在聯(lián)系，因此需要考察其對溫度的耐受能力。本研究設(shè)置了室溫(25 ℃)、巴氏殺菌溫度(65、85 ℃)、正常煮沸溫度(100 ℃)及高溫滅菌溫度(121 ℃)作為不同溫度梯度，探究了不同溫度對Nisin抑菌活性的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同溫度對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響
Fig.2 Effects of different temperatures on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes
注：不同小寫字母代表不同處理組在P<0.05 水平下具有顯著性差異(下同)

與常溫25 ℃處理的Nisin溶液的抑菌圈直徑(14.30 mm)相比，經(jīng)過65、85、100 ℃處理30 min后的Nisin溶液的抑菌圈直徑無顯著降低(P>0.05)，說明Nisin的熱穩(wěn)定性良好。在121 ℃處理30 min后的Nisin溶液的抑菌圈直徑顯著降低到11.75 mm(P<0.05)，說明Nisin的抑菌活性受到損失，但仍保留一定的抑菌效果。上述實驗結(jié)果表明，Nisin具有良好的熱穩(wěn)定性，可以適應(yīng)100 ℃以內(nèi)的熱加工處理，與吳雅萍等[13]的研究結(jié)果一致。

2.2.2 pH對Nisin抑菌活性的影響

不同的食品存在不同的酸堿性環(huán)境，為了探究pH變化對Nisin抑制單增李斯特菌效果的影響，選擇常見的食品酸堿性范圍(pH 2～10)進行試驗，結(jié)果如圖3所示。在pH=2時，抑菌圈最大，達到14.87 mm；在pH 為2～5時，Nisin的抑菌活性沒有明顯變化(P>0.05)；pH=6時，Nisin的抑菌圈直徑顯著下降至11.43 mm(P<0.05)；在pH 7～10，抑菌圈直徑隨著pH值的繼續(xù)升高而顯著降低(P<0.05)，pH=10時達到最低值8.73 mm。結(jié)果表明，酸堿性對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響較大；Nisin在偏酸性條件下可以更好發(fā)揮抑菌作用，在中性及堿性條件下其抑菌活性被削弱。

圖3 不同pH對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響
Fig.3 Effects of different pH values on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

Nisin的抗菌活性很大程度上取決于其水溶性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性又取決于酸堿度[5]。ROLLEMA 等[14]研究表明，Nisin的溶解度和化學(xué)穩(wěn)定性均隨著pH的升高而降低。LIU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin 中特殊氨基酸脫氫殘基的結(jié)構(gòu)完整性是其發(fā)揮抑菌作用的主要因素。在高pH條件下，溶液中的親核基團和脫氫殘基之間發(fā)生反應(yīng)，形成多聚體，導(dǎo)致脫氫基團的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆修飾，抑菌活性下降。此外，單增李斯特菌的最適生長pH為中性至弱堿性，酸性條件下，單增李斯特菌的生長受到抑制。本研究中Nisin 在酸性條件下抑菌效果比中性至堿性條件下抑菌效果好，可能還存在酸與Nisin的協(xié)同抗菌效應(yīng)[16]。

2.2.3 NaCl濃度對Nisin抑菌活性的影響

大部分食品及食品環(huán)境中通常含有鹽離子，對食品保鮮劑的作用存在一定的影響。本研究選擇了食品中最常添加的鹽離子Na+作為考察對象，將NaCl濃度控制在0.8 mol/L以內(nèi)[17]，測定不同離子強度對Nisin作用的影響，結(jié)果如圖4所示。

空白組不添加NaCl的Nisin溶液抑菌圈為14.10 mm，隨著NaCl濃度升高，Nisin抑菌活性呈先上升后下降的趨勢。NaCl濃度為0.2 mol/L時抑菌圈直徑最大，達到15.07 mm，NaCl濃度0.4 mol/L時，抑菌圈直徑為14.87 mm，與空白組相比，2組抑菌圈直徑均顯著升高(P<0.05)。當NaCl濃度升高到0.6 mol/L時，增強效果不明顯(P>0.05)；NaCl濃度升高到0.8 mol/L時，抑菌活性被抑制，抑菌圈直徑小于空白組。說明適當增加離子強度可以增強Nisin對單增李斯特菌的抑制。劉麗莉等[17]研究了不同食鹽濃度對Nisin溶液抑制金黃色葡萄球菌效果的影響，結(jié)果表明，NaCl濃度在0.8 mol/L以內(nèi)，抑菌效果隨著離子強度的增大而增強，可能是由于NaCl引起的滲透壓增大而增強了指示菌對Nisin的敏感性。GNZLE等[18]以彎曲乳桿菌、無害李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌為指示菌，研究了食品成分及環(huán)境因素對3種細菌素(Nisin、sakacin P和curvacin A)抑菌活性的影響，添加NaCl后Nisin對無害李斯特菌的抑菌作用表現(xiàn)為中濃度升高，高濃度有所降低，并發(fā)現(xiàn)NaCl對細菌素抑菌作用的影響具有菌種特異性。

圖4 不同NaCl濃度對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響
Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3 食品基質(zhì)對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響

2.3.1 不同脫脂奶粉質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

為了探究食品中的蛋白質(zhì)對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響，用脫脂奶粉作為富含蛋白的食品模擬體系，測定不同脫脂奶粉質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響，可以反映Nisin在不同蛋白含量的食品中可能受到的影響。不同脫脂奶粉濃度對Nisin抑菌活性的影響如圖5所示。

在脫脂奶粉質(zhì)量濃度為0～120 g/L，隨著濃度的增加，抑菌活性逐漸減小。與空白組相比，當脫脂奶粉質(zhì)量濃度達到120 g/L時，抑菌圈直徑從14.62 mm減小到10.53 mm，抑菌活性顯著受到抑制(P<0.05)。杜琨[19]的研究表明，酪蛋白對Nisin抑制金黃色葡萄球菌的活性具有負面影響，抑菌效果隨著酪蛋白濃度的升高而降低，與本研究結(jié)果一致。AASEN等[20]研究了sakacin P和Nisin與冷熏三文魚、冷切雞肉和生雞成分的相互作用，結(jié)果表明，由于抗菌肽的兩親性，添加的sakacin P和Nisin有一部分能被食物基質(zhì)蛋白迅速吸附，抗菌肽被吸附在食物大分子蛋白上以后，可能會發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，導(dǎo)致抑菌活性被抑制。

圖5 不同脫脂奶粉質(zhì)量濃度對Nisin抑制單增李斯特 菌活性的影響
Fig.5 Effects of different mass concentrations of skimmed milk powder on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3.2 不同卵磷脂質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

磷脂是一類重要的油脂伴隨物，主要存在于蛋黃、牛奶、動物內(nèi)臟、動物肌肉以及動植物油脂中[21]。Nisin主要通過與細菌細胞膜上的磷脂結(jié)合而發(fā)揮抑菌作用，本研究以添加不同質(zhì)量濃度的卵磷脂作為模擬體系，探究食品體系中的磷脂對Nisin抑菌活性的影響，結(jié)果如圖6所示。

未添加卵磷脂時，Nisin抑菌圈直徑為14.20 mm；質(zhì)量濃度增加到2 g/L，抑菌圈直徑顯著降低至11.87 mm，且隨著卵磷脂濃度的增加，Nisin抑菌活性不斷減?。毁|(zhì)量濃度達到12 g/L時，抑菌圈直徑為9.10 mm，說明卵磷脂的存在對Nisin的抑菌效果具有顯著的不利影響(P<0.05)，與杜琨的研究結(jié)果一致[19]。DEEGAN等[22]提出，Nisin的活性可能會受到肉類成分(如磷脂)的干擾，脂肪含量高干擾會更明顯，可能是因為部分Nisin與磷脂結(jié)合，與細菌細胞膜結(jié)合的機會減少，導(dǎo)致抑菌效率下降。AASEN等[20]使用粗三文魚油、魚肝油、三丁酸甘油酯以模擬肉制品中的脂肪，將Nisin水溶液與3種油脂混合處理，探究脂肪對Nisin抑菌活性的影響。結(jié)果表明，處理2 h后，水相中的Nisin抑菌活性下降到理論添加量的60%～70%，說明脂肪可能會使液體食品和肉制品中的細菌素失活。BHATTI等[23]研究表明，脂肪含量>2%的均質(zhì)化巴氏殺菌乳中存在的磷脂可以結(jié)合大部分添加的Nisin，導(dǎo)致可用于與單增李斯特菌細胞膜反應(yīng)的Nisin減少，從而降低了抗菌活性。

圖6 不同卵磷脂質(zhì)量濃度對Nisin抑制單增李斯特菌 活性的影響
Fig.6 Effects of different mass concentrations of lecithin on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

2.3.3 不同蔗糖質(zhì)量濃度對Nisin抑菌活性的影響

糖類是大多數(shù)食品的重要組成成分之一，因此添加抗菌劑時，需要考慮其對抗菌效果的影響。圖7顯示了不同蔗糖質(zhì)量濃度(0～60 g/L)對Nisin抑菌活性的影響?？瞻捉M抑菌圈直徑為14.77 mm，質(zhì)量濃度升高至20 g/L時，抑菌圈直徑幾乎沒有變化，說明質(zhì)量濃度為0～20 g/L，蔗糖對Nisin的抑菌活性無影響；質(zhì)量濃度為30～60 g/L，抑菌活性逐漸降低；質(zhì)量濃度達到60 g/L時，抑菌圈直徑為12.97 mm，與空白組相比有顯著的降低(P<0.05)，抑菌活性受到抑制。

圖7 不同蔗糖質(zhì)量濃度對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響
Fig.7 Effects of different mass concentrations of sucrose on the antibacterial activity of Nisin against Listeria monocytogenes

蔗糖作為碳源可以提供能量，促進細菌的生長代謝。鄭正男等[24]以多種微生物為指示菌，研究了蔗糖濃度對單寧酸抑菌效果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著蔗糖濃度的增加，其中2種指示菌的生長加快，影響了單寧酸的抑菌效果，其他指示菌沒有顯著變化。因此，蔗糖濃度的增加可能促進了單增李斯特菌的生長，增強其對Nisin的抵抗作用，導(dǎo)致抑菌圈直徑減小。杜琨[25]以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定了蔗糖濃度對Nisin抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著蔗糖濃度的增加，Nisin的抑菌效果增強，與本文研究結(jié)果不一致，可能是因為不同菌種對相同抗菌劑的敏感性不同，導(dǎo)致糖類對抗菌劑活性的影響存在菌種特異性。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Nisin對單增李斯特菌的MIC為250 μg/mL，121 ℃高溫處理30 min后仍保留一定活性，熱穩(wěn)定性較好；而Nisin受到pH的影響較大，在中性至堿性條件下活性損失較大；在添加不同濃度NaCl后，發(fā)現(xiàn)一定濃度的NaCl溶液有增強Nisin抑菌活性的作用，抑菌圈直徑增大?？疾炝?種食品基質(zhì)對Nisin抑制單增李斯特菌活性的影響，脫脂奶粉和卵磷脂對Nisin的抑菌活性有較大的抑制作用，蔗糖的添加有利于微生物的生長，影響了Nisin作用的效果。因此在使用Nisin作為保鮮劑時，可以承受100 ℃以內(nèi)的加工溫度，高溫殺菌產(chǎn)品需要考慮添加順序。Nisin可以在酸性食品中發(fā)揮更好的活性，并且在食品中添加適量的NaCl能有效增強Nisin抗菌活性。為了減少與食品基質(zhì)的相互作用，可以將Nisin包埋進微囊、脂質(zhì)體或包裝膜，制備抗菌活性包裝膜，有效提高其抑菌穩(wěn)定性及效率。