膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復(fù)合膜的制備及性能研究

酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物，其中拮抗酵母菌在果蔬貯藏期病害防治領(lǐng)域被廣泛研究[1]。將拮抗微生物作用于病原菌雖然效果很好，但因其活體生長要求營養(yǎng)條件苛刻，很難直接作用于食品上并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此，從微生物和代謝物質(zhì)中提取具有抑菌功能的物質(zhì)成為新的研究方向。

已有研究表明，拮抗菌D.hansenii產(chǎn)生的低分子質(zhì)量蛋白能夠抑制所有被測病原菌菌絲體的生長，從而延長果實的保藏時間和果品質(zhì)量[2-3]。交鏈孢霉菌(Alternaria alternata sp.)是低溫環(huán)境下導(dǎo)致水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品腐爛變質(zhì)的主要致病微生物，是果蔬保鮮的重要防治對象[4]，作者所在實驗室分離得到1株膜醭畢赤酵母，對交鏈格孢菌有明顯的抑制作用[5]，對其抑菌成分的開發(fā)可為該菌工業(yè)化應(yīng)用提供有力的保證。

本文對膜醭畢赤酵母發(fā)酵液進行初步抑菌性探索，在此基礎(chǔ)上，以玉米淀粉為基質(zhì)，添加食品級卡拉膠共混，以甘油為增塑劑制備復(fù)合抑菌膜。探索粗提純蛋白的加入對復(fù)合膜力學(xué)性能、阻隔性能和外觀形態(tài)等的影響，并研究該復(fù)合膜對交鏈格孢菌生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

玉米淀粉、卡拉膠(食品級)，河南萬邦化工科技有限公司；甘油、硫酸銨(分析純)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(分析純)，索萊寶科技有限公司。

1.2 供試菌和培養(yǎng)基

膜醭畢赤酵母菌(Pichia membranaefaciens)、交鏈孢菌(Alternaria alternata)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)由天津科技大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品物流保鮮與加工研究室提供。

1.3 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TE32 TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；ZHJH-C1109B無菌操作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機，上海向帆儀器有限公司；CH1S測厚儀，上海六菱儀器廠。

1.4 膜醭畢赤酵母發(fā)酵液抑菌性研究

(1)膜醭畢赤酵母發(fā)酵液制備

將膜醭畢赤酵母接種于PDA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)3～5 d后，離心收集上清液，即為無細(xì)胞發(fā)酵液。

(2)發(fā)酵液對灰葡萄孢菌的離體抑制作用

參照余巧銀等[6]的方法，在27 ℃下，培養(yǎng)5 d，觀察發(fā)酵液對灰葡萄孢菌的離體抑制作用。觀察、計算抑菌率，如公式(1)所示：

抑菌率

(1)

(3)蛋白酶對發(fā)酵液抑菌活性的影響

將無細(xì)胞發(fā)酵液用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至pH為7后，分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，使其終濃度為0.2 mol/L，在37 ℃水浴中充分反應(yīng)4 h后，沸水浴加熱0.5 h，以同樣處理未接入蛋白酶的無細(xì)胞發(fā)酵液為對照組1；將無細(xì)胞發(fā)酵液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH為2后加入胃蛋白酶，同樣以未接入蛋白酶的發(fā)酵液為對照組2。參照1.4(2)中的方法分別測定在添加不同蛋白酶處理發(fā)酵液的培養(yǎng)基中灰葡萄孢菌的生長直徑，以無菌水為對照組計算抑菌率。

1.5 生物蛋白抑菌復(fù)合膜的制備

(1)抑菌蛋白鹽析提取

在冷水浴下，將硫酸銨研磨后緩慢加入膜醭畢赤酵母發(fā)酵液中至硫酸銨的最終飽和度達(dá)到60%。冷藏過夜，離心收集蛋白質(zhì)沉淀物，透析除鹽后冷凍干燥得到蛋白質(zhì)提取物粉末。

(2)抑菌復(fù)合膜的制備

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的玉米淀粉溶液加熱糊化30 min[7]，同時配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%卡拉膠溶液，微波加熱[8]。將上述兩種溶液等體積混合后，向其中加入體積分?jǐn)?shù)為1%的甘油制備成基礎(chǔ)膜液。

將凍干蛋白提取物粉末配制成10 mg/mL的溶液，隨后進行2倍梯度稀釋至16倍，將原液與各稀釋后的溶液分別按體積分?jǐn)?shù)為1%加入基礎(chǔ)膜液中。

采用流延法[9-10]，取20 mL倒入直徑9 cm的一次性培養(yǎng)皿中，在45 ℃下恒溫干燥4 h后揭膜。將復(fù)合膜樣品存放于相對濕度(50±2)%環(huán)境中平衡48 h備用。

1.6 復(fù)合膜性質(zhì)測定

1.6.1 厚度

參照張伸[11]的方法，測定復(fù)合膜的厚度。利用手持測厚儀(精確到0.001 mm)測定薄膜邊緣和中間10個點的厚度，取平均值。

1.6.2 力學(xué)性能

參照顏田田等[12]和肖力源等[13]的測定方法和計算公式，使用TA.XT.plus型質(zhì)構(gòu)儀測定復(fù)合膜的拉伸強度(tensile strength,TS)及斷裂伸長率(elongation at break,EAB)。

1.6.3 透濕性能

根據(jù)GB 1037—88《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法杯式法》，參照陳紅艷等[14]的方法，水蒸氣透過系數(shù)(water vapor permeability,WVP)計算如公式(2)所示：

(2)

式中:Δm為稱量瓶增加的質(zhì)量，g；d為復(fù)合膜的平均厚度，mm；A為稱量瓶瓶口面積，m2；t為稱量瓶放入恒濕器中的時間，24 h；Δp為23 ℃下的水蒸氣壓，KPa。

1.6.4 透明度

參照王海霞[15]的方法和計算公式，測定膜的吸光度值。計算復(fù)合膜透明度。

1.7 抑菌蛋白復(fù)合膜對交鏈格孢菌抑菌作用實驗

(1)平板對峙法：參照喬博鑫等[16]的方法，實驗組注入30 μL抑菌復(fù)合膜液，對照組注入30 μL無菌水。于28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察、記錄。

(2)含藥平板法[17]：將復(fù)合膜液與融化后的PDA培養(yǎng)基混合，待培養(yǎng)基凝固后，接入直徑為1 cm的交鏈格孢菌菌片，以無菌水組作為對照，于28 ℃下培養(yǎng)5 d后觀察、記錄。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，使用Origin 2017軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶對發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖1可知，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶均能顯著降低發(fā)酵液的抑菌活性(P<0.05)，經(jīng)過胃蛋白酶處理的發(fā)酵液的抑菌率僅為36.30%，而對照組為65.97%，但木瓜蛋白酶對發(fā)酵液的抑菌性影響不大。實驗證明，發(fā)酵液中存在蛋白類抑菌物質(zhì)。

A-胰蛋白酶；B-木瓜蛋白酶；C-蛋白酶K；D-胃蛋白酶； CK1-對照組1；CK2-對照組2；CK-無菌水 a-不同蛋白酶處理后發(fā)酵液對灰葡萄孢菌生長的影響； b-不同蛋白酶處理后發(fā)酵液的抑菌率
圖1 蛋白酶對發(fā)酵液抑菌性的影響
Fig.1 Effect of protease on the antibacterial activity of fermentation broth
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 復(fù)合膜的性質(zhì)

2.2.1 外觀形態(tài)

通過觀察外觀形態(tài)可以直接了解薄膜的顏色、透明程度及表面狀態(tài)。由圖2可看出，抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜相比，顏色微黃，二者均較透明且表面平整光滑，無明顯的顆粒感和粗糙感。

a-基礎(chǔ)復(fù)合膜；b-抑菌蛋白膜
圖2 玉米淀粉-卡拉膠基礎(chǔ)復(fù)合膜與抑菌蛋白膜外觀形態(tài)圖
Fig.2 Appearance of corn starch-carrageenan basic composite film and bacteriostatic protein film

2.2.2 厚度和透濕性能

WVP是衡量包裝材料阻隔外界水氣接觸內(nèi)部食品的重要指標(biāo)。由表1可知，抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜在厚度和WVP方面差異不顯著(P>0.05)，說明蛋白提取物的加入對復(fù)合膜的厚度和WVP無較大影響，抑菌復(fù)合膜薄厚均勻且有良好的水分保持作用。這可能是由于蛋白提取物與玉米淀粉、卡拉膠等基礎(chǔ)成膜材料具有良好的相容性[18]，抑菌復(fù)合膜質(zhì)地連續(xù)均勻。

表1 抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜厚度和WVP對比
Table 1 Comparison of thickness and WVP between antibacterial composite membrane and basic composite membrane film

注：0、2、4、8、16分別代表不同稀釋倍數(shù)蛋白溶液制備的抑菌復(fù)合膜；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 透明度和力學(xué)性能

透明度是衡量包裝材料性能的指標(biāo)之一，良好的透明度便于觀察被包食品的外觀形態(tài)。由圖3可知，基礎(chǔ)復(fù)合膜透明度可達(dá)到(66.80±1.63)%，加入蛋白提取物原液的復(fù)合膜透明度僅有(52.09±1.32)%，下降了18.71%。此外，透明度隨著蛋白提取物濃度降低而上升，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到16時，抑菌復(fù)合膜的透明度升至(64.54±1.63)%，與基礎(chǔ)復(fù)合膜之間無明顯差異。這可能是由于蛋白提取物本身呈現(xiàn)黃色，加入后使膜也呈現(xiàn)黃色(如2.2.1所示)阻礙了光的傳播路徑。

圖3 不同濃度蛋白提取物對復(fù)合膜透明度的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of protein extracts on the transparency of composite membrane

力學(xué)性能反應(yīng)了薄膜的柔韌性和抗拉強度，由圖4可知,蛋白提取物的加入使復(fù)合膜的TS下降，EAB上升?；A(chǔ)復(fù)合膜的TS為(11.86±0.50) N/mm2，抑菌復(fù)合膜的TS為(5.80±1.54) N/mm2，下降了51%。普通復(fù)合膜的EAB為(35.19±7.27)%，抑菌復(fù)合膜的EAB為(62.07±6.41)%，增長了43%。這可能是因為蛋白提取物與淀粉發(fā)生相互作用，使淀粉本身氫鍵作用降低[19]，導(dǎo)致復(fù)合膜抗拉強度降低，由脆性向柔性轉(zhuǎn)變。

圖4 抑菌蛋白復(fù)合膜和普通復(fù)合膜力學(xué)性能對比圖
Fig.4 Comparison of mechanical properties between antibacterial protein composite membrane and ordinary composite membrane

2.2.4 抑菌膜對交鏈格孢菌的離體抑制作用

平板對峙法：如圖5所示，經(jīng)過對峙實驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)5 d后，在分界線上出現(xiàn)明顯的抑菌帶，菌落半徑在靠近左側(cè)小孔明顯一側(cè)小于垂直方向上，靠近小孔測的菌落半徑只有(1.8±0.1) cm，在垂直方向上菌落半徑為(3.8±0.1) cm，說明抑菌膜液對交鏈孢菌有明顯的抑制作用。

含藥平板法：如圖6所示，在培養(yǎng)5 d后，含藥平板菌落直徑明顯小于對照組，實驗組菌落直徑僅為(1.2±0.1) cm，而對照組菌落直徑為(6.5±0.1) cm，約是實驗組菌落直徑的5.4倍，說明抑菌復(fù)合膜液對交鏈孢菌有明顯的抑制作用。

a-空白對照;b-實驗組反面;c-實驗組正面
圖5 抑菌蛋白膜液與交鏈孢菌平板對峙結(jié)果
Fig.5 Results of confrontation between antibacterial protein film solution and Alternaria alternata plate

a-實驗組;b-對照組
圖6 含抑菌復(fù)合膜液藥平板對交鏈孢菌抑制作用
Fig.6 Inhibitory effect of liquid drug plate containing antibacterial composite membrane on Alternaria alternata

3 結(jié)論

近年來，以拮抗酵母菌為基礎(chǔ)的果蔬采后病原微生物防治產(chǎn)品的研究開發(fā)取得了令人矚目的進展[19]，本實驗室已有的研究表明，膜醭畢赤酵母菌發(fā)酵液中可能存在蛋白類抑菌物質(zhì)，尋找能夠維持抑菌成分生物活性的載體成為進一步的研究方向[20]。本文在此基礎(chǔ)上，進一步探索了以玉米淀粉-卡拉膠復(fù)合膜為基礎(chǔ)的膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復(fù)合膜。

經(jīng)實驗測定發(fā)現(xiàn)，外泌蛋白提取物與成膜基質(zhì)間有較好的相容性，添加蛋白提取物的抑菌復(fù)合膜與基礎(chǔ)復(fù)合膜相比，仍具有薄厚均一、平整致密和延緩水分散失的優(yōu)點；力學(xué)性能和外觀形態(tài)對比發(fā)現(xiàn)，蛋白提取物的加入會使復(fù)合膜的顏色加深，透明度下降，由脆性向韌性轉(zhuǎn)變；經(jīng)過抑菌作用分析，該抑菌復(fù)合膜對交鏈格孢菌菌絲生長有直接的抑制作用，能顯著抑制菌落的擴大。

膜醭畢赤酵母菌外泌蛋白抑菌復(fù)合膜是一種天然、安全包裝材料，為生物防治果蔬腐敗變質(zhì)產(chǎn)品的開發(fā)提供了新思路。