金屬抗菌肽SIF4在模擬單/多組分食品體系中抑菌穩(wěn)定性研究

大多數(shù)食品是多組分共存的復雜體系，食品結(jié)構(gòu)化所必需的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等生物大分子是食品復雜體系重要組成成分，對食品加工有重要影響[1]。富含蛋白質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)基質(zhì)的食品在生產(chǎn)加工和流通等環(huán)節(jié)極易受到致病或腐敗微生物污染，既影響營養(yǎng)價值，還可能產(chǎn)生潛在生物毒素[2]。傳統(tǒng)熱處理殺菌可對熱敏性營養(yǎng)成分、生物活性物質(zhì)及食品色香味等產(chǎn)生不利影響，使用人工合成防腐劑常存在潛在“三致”危害。因此，在保證食品安全的前提下，使用安全、高效和新穎的抗菌保鮮劑盡可能保留食品原有風味和新鮮度是食品抗菌保鮮領(lǐng)域的研究焦點。食源性致病菌和腐敗菌是指在食品加工和流通過程被污染的致病和腐敗微生物總稱，以大腸菌群和金黃色葡萄球菌為主[3]?？咕囊蚓哂锌咕V廣、穩(wěn)定性好、特異性強、毒副作用少且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，可作為食源性致病菌和腐敗菌的新型抗菌劑和食品保鮮劑[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌活性[5-6]，在食品內(nèi)外部因素變化過程中有較好的穩(wěn)定性，具有較好的生物相容性[7]，但SIF4在復雜食品體系中的抑菌穩(wěn)定性(antimicrobial stability,AMS)尚不明確。以金黃色葡萄球菌為指示菌，本試驗系統(tǒng)研究SIF4在模擬單/多組分食品體系中抑菌活性變化規(guī)律，以期為SIF4在復雜食品體系抗菌保鮮中的應用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，菌種保藏中心；金屬抗菌肽SIF4，課題組制備[5]，對S.aureus最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.2×10-3 g/L；牛乳清蛋白[(bovine whey protein，BWP，蛋白質(zhì)含量為(91.34±1.17)%]，新西蘭恒天然公司；大豆分離蛋白[(soy protein isolate，SPI，蛋白質(zhì)含量為(92.25±0.96)%]，山東御馨生物科技；花生分離蛋白[(peanut protein isolate，PPI，蛋白質(zhì)含量為(40.68±1.26)%]，課題組用堿溶酸沉法從脫脂冷榨花生粕中提取[8]；菜籽油(rapeseed oil, RO)，道道全；花生油(peanut oil, PO)，山東魯花；大豆油(soybean oil, SO)，益海嘉里；大米淀粉(rice starch, RS)，Sigma-Aldrich；馬鈴薯淀粉(potato starch, PS)、玉米淀粉(corn starch, CS)，上海源葉生物科技；食品級Tween-80，江蘇茂亨化工有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 相對抑菌活性測定

取活化的S.aureus接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)中，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。準確吸取0.1 mL菌液(約6×108 CFU/mL)均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，將滅菌牛津杯置于培養(yǎng)皿中并加入供試品0.1 mL，4 ℃放置2 h使試液充分擴散至瓊脂層，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑(cm)并計算相對抑菌活性[7]，抑菌穩(wěn)定性用相對抑菌活性表示。相對抑菌活性的計算如公式(1)所示：

相對抑菌活性

(1)

1.2.2 在模擬單組分食品體系中抑菌穩(wěn)定性

1.2.2.1 在模擬蛋白質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性

準確稱取BWP、SPI和PPI于水溶液中，室溫下500 r/min磁力攪1 h，配制0%～5%(質(zhì)量分數(shù))的模擬蛋白質(zhì)體系。取SIF4加入到模擬蛋白質(zhì)體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.2.2 在模擬脂質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性

準確移取適量RO、PO和SO于水溶液中，加入1%(體積分數(shù))的Tween-80，10 000 r/min乳化均質(zhì)3次(均質(zhì)30 s間隔1 min)制備0%～5%(體積分數(shù))的模擬脂質(zhì)體系。取SIF4加入到模擬脂質(zhì)體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.2.3 在模擬淀粉體系中的抑菌穩(wěn)定性

準確稱取RS、PS和CS于0.5%的NaCl溶液中并攪勻，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0[9]，煮沸2 min使溶液澄清，制備0%～5%(質(zhì)量分數(shù))的模擬淀粉體系。取SIF4加入到模擬淀粉體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.3 在模擬雙組分食品體系中抑菌穩(wěn)定性

1.2.3.1 在模擬蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系中抑菌穩(wěn)定性

參考仝面換[10]和ALZAGTAT[11]的方法并進行修改。分別配制3%(質(zhì)量分數(shù))BWP、SPI和PPI溶液，以蛋白質(zhì)質(zhì)量為基準，按油脂和蛋白質(zhì)質(zhì)量比為0.5∶1、1∶1和2∶1 分別加入RO、PO和SO，并加入1% Tween-80作乳化穩(wěn)定劑，10 000 r/min乳化均質(zhì)3次制備蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系；取SIF4加入到模擬蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min 離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.3.2 在模擬淀粉-蛋白質(zhì)體系中抑菌穩(wěn)定性

參考王玥[12]和COLOMBO等[13]方法并進行修改。分別配制3%(質(zhì)量分數(shù))的RS、PS和CS溶液(含0.5% NaCl)，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，煮沸2 min，冷卻至室溫后添加1.5、3、6 g的BWP、SPI和PPI，攪勻制成淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量比為2∶1、1∶1和1∶2的淀粉-蛋白質(zhì)體系；取SIF4加入到模擬淀粉-蛋白質(zhì)體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.3.3 在模擬淀粉-脂質(zhì)體系中抑菌穩(wěn)定性

參考LU等[14]和QIN等[15]方法并修改。分別配制3%(質(zhì)量分數(shù))的RS、PS和CS溶液(含0.5% NaCl)，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，煮沸2 min并冷卻至室溫；以淀粉質(zhì)量(g)為基準，按油脂和淀粉質(zhì)量比為0.5∶1、1∶1和2∶1分別加入RO、PO和SO并加入1% Tween-80作乳化穩(wěn)定劑，10 000 r/min乳化均質(zhì)3次制得淀粉-脂質(zhì)體系；取SIF4加入到模擬淀粉-脂質(zhì)體系中(終濃度為2×MIC)，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.4 在模擬3組分食品體系中抑菌穩(wěn)定性

參考WANG等[16]方法并修改。分別配制3%(質(zhì)量分數(shù))RS、PS和CS溶液(含0.5% NaCl)，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0，煮沸2 min并冷卻至室溫；按油脂和淀粉質(zhì)量比為1∶1分別加入RO、PO和SO并加入1% Tween-80作乳化穩(wěn)定劑，10 000 r/min乳化均質(zhì)3次(均質(zhì)30 s間隔1 min)制得淀粉-脂質(zhì)體系；按蛋白質(zhì)、淀粉、脂質(zhì)質(zhì)量比為1∶1∶1分別加入SPI、PPI和BWP，攪勻后得到蛋白質(zhì)-淀粉-脂質(zhì)體系。取SIF4加入到蛋白質(zhì)-淀粉-脂質(zhì)體系中使終濃度為2×MIC，混勻后靜置60 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測定相對抑菌活性。

1.2.5 試驗數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示，僅進行試驗組與對照組均數(shù)差異多重比較，顯著性水平α=0.05。采用SPSS 25.0進行組內(nèi)均數(shù)差異多重比較，方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 在模擬單組分食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

2.1.1 在模擬蛋白質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)是食品重要的結(jié)構(gòu)化分子和營養(yǎng)基質(zhì)，SIF4在模擬蛋白質(zhì)體系中抑菌穩(wěn)定性如圖1所示。

圖1 在模擬蛋白質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.1 AMS in simulated protein system
注：相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)(下同)

由圖1可知，金屬抗菌肽SIF4在模擬BWP、SPI、PPI體系中具有較好的抑菌穩(wěn)定性，試驗組與對照組均無顯著差異(P>0.05)，由此可見，金屬抗菌肽SIF4可用于BWP、SPI、PPI等為基質(zhì)的蛋白質(zhì)食品體系的抗菌保鮮。

2.1.2 在模擬脂質(zhì)食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

脂質(zhì)是食品重要的結(jié)構(gòu)化分子，與食品物性、風味和穩(wěn)定性有重要關(guān)系，SIF4在模擬脂質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性如圖2所示。

由圖2可知，在1%模擬RO體系中，SIF4相對抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，在2%～5%模擬RO體系中，試驗組抑菌活性顯著增強(P<0.05)，可能與RO本身有一定抗菌活性有關(guān)[17]，SIF4與菜籽油在抗菌活性發(fā)揮過程中有協(xié)同增強作用，一定范圍內(nèi)，抗菌活性與劑量呈正相關(guān)關(guān)系。在模擬PO和SO體系中，試驗組抑菌活性均顯著高于對照組(P<0.05)。由此可見，模擬脂質(zhì)體系可增強SIF4抑菌活性。在脂質(zhì)體系中能保持較好抑菌活性，可能與脂質(zhì)本身對致病與腐敗微生物具有一定抑制活性有關(guān)[18]，SIF4與脂質(zhì)協(xié)同作用更加增強了其在食品體系中的抑菌活性和穩(wěn)定性，可應用于含脂質(zhì)乳化食品(如蛋糕、冰淇淋等)的抗菌保鮮。

圖2 在模擬脂質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.2 AMS in simulated lipid system
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.3 在模擬淀粉食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

淀粉是食品加工重要的原料和結(jié)構(gòu)化分子，SIF4在模擬淀粉體系中抑菌穩(wěn)定性如圖3所示。

圖3 在模擬淀粉體系中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.3 AMS in simulated starch system

由圖3可知，在RS、PS和CS模擬體系中，各試驗組與對照組抑菌穩(wěn)定性均無顯著差異(P>0.05)，表明各模擬淀粉體系對SIF4抑菌活性無明顯影響，SIF4可用于含大米淀粉、馬鈴薯淀粉和玉米淀粉等淀粉的各類食品的抗菌與保鮮。

2.2 在模擬雙組分食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

2.2.1 在模擬蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系中的抑菌穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系是食品常見且重要的加工體系，SIF4在該模擬體系中抑菌穩(wěn)定性如圖4所示。

由圖4可知，在以BWP為基質(zhì)的BWP-RO體系中，SIF4抑菌活性在BWP和RO質(zhì)量比為 0.5∶1和1∶1的體系中得到顯著增強(P<0.05)，可能與該體系中RO比例相對較高以及RO本身具備一定抑菌活性有關(guān)，SIF4和RO協(xié)助作用增強了抑菌效果[17]；在BWP-SO體系中，試驗組抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，而在BWP-PO體系中，試驗組抑菌穩(wěn)定性顯著增強于對照組(P<0.05)；在以SPI為基質(zhì)的SPI-RO體系中，SPI與RO質(zhì)量比為0.5∶1和1∶1時，試驗組相對抑菌活性顯著高于對照組(P<0.05)，SPI-SO和SPI-PO體系試驗組抑菌活性均顯著高于對照組(P<0.05)；在以PPI為基質(zhì)的PPI-RO體系中，PPI與RO質(zhì)量比為0.5∶1和1∶1時，試驗組相對抑菌活性顯著高于對照組(P<0.05)，當PPI和O質(zhì)量為比2∶1時，試驗組相對抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明該體系中脂質(zhì)過低時，對SIF4抑菌活性的增強作用減弱；對PPI-SO和PPI-PO體系來說，當兩者質(zhì)量比為0.5∶1時，試驗組相對抑菌活性與對照組均無顯著差異(P>0.05)，當兩者質(zhì)量比為1∶1或2∶1時，試驗組相對抑菌活性與對照組相比得到顯著增強(P<0.05)。由此可見，SIF4在不同蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系中可維持較好的抑菌穩(wěn)定性或得到不同程度強化，表明SIF4可用于蛋白質(zhì)-脂質(zhì)構(gòu)成的如蛋糕、冰淇淋等食品體系[11]的抗菌與保鮮。

圖4 在蛋白質(zhì)-脂質(zhì)中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.4 AMS in simulated protein-lipid system

2.2.2 在模擬淀粉-蛋白質(zhì)體系中的穩(wěn)定性

淀粉-蛋白質(zhì)復合物是一種重要的食品體系，常通過靜電、范德華力、氫鍵、疏水作用等形成混合體系，主要為靜電作用力和疏水作用力。SIF4在該模擬體系中抑菌穩(wěn)定性如圖5所示。

由圖5可知，在以RS為基質(zhì)的RS-BWP體系中，試驗組相對抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，在RS-SPI和RS-PPI體系中，兩者質(zhì)量比為1∶1 或1∶2時，試驗組相對抑菌活性與對照組均有顯著差異(P<0.05)，說明該體系中蛋白質(zhì)組分相對較多時，相對抑菌活性可得到不同程度增強[19]；在以PS為基質(zhì)的PS-BWP、PS-SPI和PS-PPI體系中，試驗組相對抑菌活性與對照組相比稍有降低，但沒有達到顯著性差異(P>0.05)，試驗組相對抑菌活性稍有降低，可能是由于馬鈴薯淀粉富含磷酸基團，減弱陽離子抗菌肽SIF4與細胞壁帶負電荷脂多糖結(jié)合或與細胞壁某特定負電荷區(qū)域結(jié)合力[6]；在以CS為基質(zhì)的CS-BWP、CS-SPI和CS-PPI體系中，試驗組相對抑菌活性與對照組均無顯著差異(P>0.05)。試驗結(jié)果表明，SIF4可用于大米淀粉、馬鈴薯淀粉和玉米淀粉等為基質(zhì)的淀粉-蛋白質(zhì)體系食品的抗菌保鮮。

圖5 在淀粉-蛋白質(zhì)中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.5 AMS in simulated starch-protein system

2.2.3 在模擬淀粉-脂質(zhì)體系中的穩(wěn)定性

淀粉-脂質(zhì)復合物常存在于天然淀粉或形成于食品加工過程，SIF4在該模擬體系中的抑菌活性變化如圖6所示。

圖6 在淀粉-脂質(zhì)中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.6 AMS in simulated starch-lipid system

由圖6可知，在以RS為基質(zhì)的RS-RO體系中，兩者質(zhì)量比為0.5∶1和1∶1時，試驗組相對抑菌活性顯著高于對照組(P<0.05)，在RS-SO和RS-PO體系中，兩者質(zhì)量比為1∶1或2∶1時，試驗組相對抑菌活性顯著高于對照組(P<0.05)；在以PS為基質(zhì)的PS-RO體系中，試驗組與對照組均無顯著差異(P>0.05)，在PS-SO體系中，試驗組相對抑菌活性均顯著高于對照組(P<0.05)，而在PS-PO體系中，兩者質(zhì)量比為0.5∶1和1∶1時，試驗組相對抑菌活性顯著高于對照組(P<0.05)；在以CS為基質(zhì)的CS-RO、CS-SO和CS-PO體系中，試驗組與對照組均無顯著差異(P>0.05)。由此可見，SIF4在不同淀粉-脂質(zhì)體系中可維持較好的抑菌穩(wěn)定性或得到不同程度強化，具備在淀粉-脂質(zhì)食品體系抗菌保鮮中應用的潛在可行性。脂質(zhì)主要與淀粉中直鏈淀粉絡(luò)合[15]，NAVARRO等[20]研究發(fā)現(xiàn)，葵花籽油可促進玉米直鏈淀粉溶出且有助于淀粉-脂質(zhì)復合物形成。通常脂類脂肪鏈插入直鏈淀粉螺旋內(nèi)部空腔，脂肪酸羧基或甘油的甘油基部分仍暴露在螺旋外部[19]，在脂質(zhì)或脂肪酸等配體存在下，發(fā)生構(gòu)象變化形成具有親水性表面和疏水性內(nèi)螺旋孔道的左手單螺旋結(jié)構(gòu)的淀粉-脂質(zhì)復合物[21]，溫和堿性條件有助于淀粉-脂質(zhì)復合體形成[22]。

2.3 在模擬3組分食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

SIF4在構(gòu)建的模擬3組分食品體系中的相對抑菌活性變化如圖7所示。

a-BWP基質(zhì)；b-SPI基質(zhì)；c-PPI基質(zhì)
圖7 模擬3組分體系中的抑菌穩(wěn)定性
Fig.7 AMS in simulated triple-component system

由圖7可知，各蛋白質(zhì)為基質(zhì)構(gòu)成的3組分模擬食品體系中，試驗組與對照組相對抑菌活性均無顯著差異(P>0.05)，由此可以說明，SIF4可廣泛應用于各類蛋白質(zhì)-淀粉-脂質(zhì)體系中，在復雜食品體系中具有較好的應用基礎(chǔ)[19]。

3 結(jié)論

食品是典型的復雜軟物質(zhì)體系，食品中蛋白質(zhì)、淀粉和脂質(zhì)等結(jié)構(gòu)化分子或分子間互作對食品物性、風味及食品安全等可產(chǎn)生重要影響[19]。SIF4作為一種新型金屬抗菌肽，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等典型致病與腐敗細菌有較好抑菌活性[5-6]，但其在復雜食品體系中的抑菌穩(wěn)定性這一科學問題仍需解決。本試驗構(gòu)建了以蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和淀粉為基質(zhì)的模擬食品單/多組分體系，研究了SIF4在這些模擬食品體系中的抑菌活性的變化規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)，在模擬蛋白質(zhì)和淀粉單組分食品體系中，SIF4抑菌活性與對照組無顯著性變化(P>0.05)，模擬PO和SO脂質(zhì)體系處理對SIF4抑菌活性無顯著影響(P>0.05)，而模擬RO體系可對SIF4抑菌活性可起到不同程序的強化，2%～5%模擬RO體系可顯著增強抑菌活性(P<0.05)；在模擬蛋白質(zhì)-脂質(zhì)雙組分食品體系中，SIF4可維持較好的抑菌穩(wěn)定性或被不同程度增強；在模擬淀粉-蛋白質(zhì)雙組分食品體系中，PS基質(zhì)體系和CS基質(zhì)體系對抑菌活性無顯著性影響(P>0.05)，而在RS淀粉基質(zhì)體系中，SIF4可保持較好抑菌穩(wěn)定性或得到增強；在模擬淀粉-脂質(zhì)雙組分食品體系中，CS基質(zhì)體系對抑菌活性無顯著性影響(P>0.05)，而RS基質(zhì)和PS基質(zhì)體系則表現(xiàn)為對抑菌活性無顯著性影響(P>0.05)或不同程度增強(P<0.05)；在構(gòu)建的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-淀粉3組分體系中，試驗組與對照組均無顯著性差異(P>0.05)，表明SIF4在構(gòu)建的模擬3組分食品體系中具有較好的抑菌穩(wěn)定性。