鏈霉菌S-pMS02發(fā)酵制備磷脂酶D的關(guān)鍵技術(shù)研究

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是一種新資源食品[1]，具有保護(hù)腦神經(jīng)、修復(fù)腦損傷[2]、增強(qiáng)記憶力、改善阿爾茨海默病和兒童多動癥[3-4]等功效。磷脂酶D(phospholipase D, PLD)可催化制備功能良好的單體磷脂及磷脂衍生物，通過其磷酸二酯酶活性使特定磷脂發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生成PS等稀有物質(zhì)，在食品及醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用中起著重要作用[5-6]。在食品工業(yè)中，PLD可對來源廣泛的粗品磷脂(如大豆卵磷脂)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和改性，提高其營養(yǎng)價值和使用性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，PLD是脂質(zhì)體藥劑最為重要的輔料，一定程度決定著脂質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展水平。因此PLD具有極高的技術(shù)研究價值和廣闊的市場應(yīng)用前景。

PLD廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和脊椎動物中，鏈霉菌來源的PLD因比其他來源具有更高的轉(zhuǎn)磷脂?；盍透鼘挿旱牡孜飳Ｒ恍远蔀榻陙硌芯康臒狳c(diǎn)[7-8]。鏈霉菌較高的酶分泌能力和較少的異源蛋白表達(dá)限制使其被廣泛用于生產(chǎn)重要的工業(yè)酶和重組蛋白。作為PLD的天然宿主，鏈霉菌不僅在蛋白表達(dá)及活性保持方面存在優(yōu)勢，其產(chǎn)生的PLD能在水相中發(fā)生催化反應(yīng)，可減少有機(jī)試劑的使用，開發(fā)工程菌株發(fā)酵原液生產(chǎn)體系。但從環(huán)境中篩選的野生鏈霉菌制備的PLD往往催化活性較低，分泌量遠(yuǎn)低于工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，同時分離提純工藝復(fù)雜，成品純度低、價格高，限制了PLD的應(yīng)用[9-10]。因此獲得高產(chǎn)PLD的菌株并提高其發(fā)酵產(chǎn)酶能力是解決這些問題的關(guān)鍵。實驗室前期借助基因工程手段對鏈霉菌進(jìn)行改造，篩選得到了1株高產(chǎn)PLD的重組菌株S-pMS02[11]，對其進(jìn)行了高產(chǎn)導(dǎo)向、活性保持等方向的研究，初步建立了一種基因工程霉菌制備PLD的方法。

為進(jìn)一步提高該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的效率從而快速應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，本研究從培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件、制備工藝3個方面對其進(jìn)行了研究與優(yōu)化，力圖解決菌株在發(fā)酵制備PLD酶過程中的關(guān)鍵技術(shù)問題，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，推動PLD在新型功能性食品方面的創(chuàng)制和精準(zhǔn)營養(yǎng)食品行業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、牛肉膏、瓊脂粉、硫酸銨、CaCl2、MgSO4·7H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白氨基酸，OXOID公司；重組鏈霉菌S-pMS02，實驗室保藏。

苯酚(分析純)、TritonX-100(分析純)、蛋黃卵磷脂，生工生物工程股份有限公司；膽堿氧化酶、BCA試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶，源葉生物。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FE20型pH計、ME104E電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ZQZY-78CN振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限責(zé)任公司；CT15RE臺式離心機(jī)，日本日立公司；Infine 200pro多功能微孔板檢測儀，瑞士迪肯公司；NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測定儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

MS固體培養(yǎng)基：豆粕15 g，豆殼20 g，加水3 L煮3 h，紗布過濾，添加瓊脂粉20 g，甘露醇20 g，pH自然?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，(NH4)2SO4 3，K2HPO4·3H2O 3.4，NaH2PO4·2H2O 2.34，MgSO4·7H2O 0.6，酪蛋白氨基酸5。微量金屬離子ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CaCl2均為0.001 g/L，pH自然。上述培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌20 min。

1.3.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

取新鮮的孢子懸浮液接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的安普霉素，用帶凹槽的錐形瓶30 ℃，200 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.3 PLD的制備

將發(fā)酵液于4 ℃、6 500 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。將粗酶液于6 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液用0.45 μm濾膜抽濾，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末(65%，430 g/L)，4 ℃靜置過夜沉淀蛋白。待蛋白沉淀完全后，16 000 r/min、4 ℃離心30 min，取蛋白沉淀完全復(fù)溶于PBS中。12 000 r/min離心5 min去除復(fù)溶物中的固體雜質(zhì)，取上清液備用。將上清液進(jìn)一步超濾濃縮，6 000 r/min離心15 min，PBS洗脫，重復(fù)離心直至蛋白溶液接近無色透明。

1.3.4 菌體濃度測定

將發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min，取菌體用蒸餾水沖洗，重復(fù)上述離心2次，最終將菌體置于60 ℃ 烘箱烘至恒重，計算菌體質(zhì)量濃度。

1.3.5 PLD酶活力測定

取卵磷脂0.1 g，加無水乙醇和蒸餾水各5 mL，冰浴振蕩至乳液狀。吸取200 μL于5 mL離心管中，加入0.04 mol/L Tris-HCl(pH 5.5)、0.01 mol/L CaCl2、1 g/L TritonX-100，37 ℃預(yù)熱5 min，加入100 μL 待測酶液，立即置搖床中37 ℃，200 r/min反應(yīng)10 min。加入200 μL 10 mmol EDTA、10 g/L 16-烷基-3-甲基氯化銨、0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)的反應(yīng)終止液，置沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫。加入0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)3 mL(含有2 U膽堿氧化酶、2 U過氧化氫酶、4-氨基安替吡啉0.3 mg、苯酚1 mg)，置搖床37 ℃，200 r/min反應(yīng)20 min。反應(yīng)后的混合液于500 nm處測吸光度，以氯化膽堿做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力[12]。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用單因素對照試驗，對發(fā)酵培養(yǎng)基各成分進(jìn)行優(yōu)化[13]。

碳源的優(yōu)化：分別選取葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇和可溶性淀粉6種物質(zhì)作為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)后檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

氮源的優(yōu)化：分別選取牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、酪蛋白氨基酸、牛肉膏混合蛋白胨、硫酸銨混合酪蛋白氨基酸作為氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)后檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

金屬離子濃度的優(yōu)化：設(shè)置不同質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L)的Mg2+、Ca2+，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)后檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

1.3.7 菌株最佳發(fā)酵條件的確定

用改良后的培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用單因素對照試驗依次對接種量、溫度、時間及溶氧量進(jìn)行優(yōu)化實驗，確定最佳發(fā)酵條件。

最佳接種量：將孢子按濃度為103、104、105、106、107個/mL的接種量分別接種至培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

最佳培養(yǎng)溫度：分別在26、28、30、32、34、36 ℃的溫度下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

最佳發(fā)酵時間：分別在發(fā)酵培養(yǎng)的第3、4、5、6、7、8天取發(fā)酵液檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

最佳溶氧量：分別設(shè)置使裝液量為20、40、60、80、100 mL，透氣型封口膜密封后發(fā)酵培養(yǎng)，檢測PLD酶活力和菌體質(zhì)量濃度。

1.3.8 發(fā)酵制備工藝優(yōu)化

發(fā)酵過程中加入實驗室自行設(shè)計的攪散工具，PLD制備過程中使用低溫底座盛裝樣品管保持溫度穩(wěn)定[14]。隨機(jī)選取16組不同發(fā)酵條件的樣品，檢測發(fā)酵制備工藝優(yōu)化前后的PLD酶活力。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差。實驗數(shù)據(jù)采用GraghPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖，制備工具采用AutoCAD軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。圖中以各組最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的研究

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源的優(yōu)化

不同微生物利用不同的營養(yǎng)成分，其種類對微生物發(fā)酵產(chǎn)酶存在一定的影響[15]。碳源在微生物生長過程中提供能源，氮源是組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，兩者都是細(xì)胞合成的主要成分。按1.3.2所述方法發(fā)酵制備PLD時測得酶活力為16.2 U/mL，為提高菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶效率，對培養(yǎng)基中碳、氮源進(jìn)行優(yōu)化，以各組最高酶活力為100%，計算相對酶活力，同時分析菌體濃度與酶活力的關(guān)系。碳源優(yōu)化結(jié)果如圖1-a所示，與原始碳源葡萄糖相比，甘露醇和可溶性淀粉發(fā)酵效果更好，酶活力最高為20.16 U/mL，增長了約27%。其中甘露醇產(chǎn)生的菌體量少，可減輕工業(yè)廢料的處理，可溶性淀粉廉價易得，能在工業(yè)生產(chǎn)中降低成本，從經(jīng)濟(jì)適用角度考慮，選擇可溶性淀粉為碳源進(jìn)行后續(xù)實驗。

氮源優(yōu)化結(jié)果如圖1-b所示，硫酸銨復(fù)合酪蛋白氨基酸作為氮源時酶活力最高，為20.28 U/mL，酪蛋白氨基酸作為單一氮源時相對酶活力為64%，高于牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨。牛肉膏復(fù)合蛋白胨相對酶活力為71%，高于酪蛋白氨基酸，表明復(fù)合氮源中氨基酸、生長因子等成分配比更適合菌體生長產(chǎn)酶[16]。菌體濃度與酶活力呈同樣趨勢，因此采用硫酸銨復(fù)合酪蛋白氨基酸為氮源進(jìn)行后續(xù)實驗。

a-不同碳源；b-不同氮源
圖1 培養(yǎng)基不同碳源、氮源對酶活力及菌體質(zhì)量濃度的影響
Fig.1 Effects of different carbon and nitrogen sources on enzyme activity and cell concentration

2.1.2 金屬離子含量對菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響

作為微生物生理活性物質(zhì)的重要組成成分，金屬離子在一定濃度下對微生物的生長和目的產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用。K+、Na+可維持細(xì)胞滲透壓和胞內(nèi)物質(zhì)的穩(wěn)定性，是培養(yǎng)基中不可缺少的[16]。在大腸桿菌和鏈霉菌結(jié)合轉(zhuǎn)移實驗中發(fā)現(xiàn)，Mg2+對實驗結(jié)果影響較大，可能與鏈霉菌的代謝關(guān)系密切。另有研究表明Ca2+可作為一些酶的輔因子，對蛋白的產(chǎn)生、活力大小和穩(wěn)定性都有一定的影響[17]。在前期PLD的酶學(xué)性質(zhì)分析中發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度為10 mmol/L時有助于酶活性的提高，一般作為金屬離子助劑參與酶活力檢測。但Ca2+對鏈霉菌發(fā)酵生長的影響仍未可知，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中Mg2+和Ca2+的含量，探究金屬離子對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響。

Mg2+對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖2-a所示，發(fā)酵液中PLD的酶活力隨著培養(yǎng)基中Mg2+濃度的增加而逐漸升高，Mg2+質(zhì)量濃度1.5 g/L時PLD酶活力達(dá)到最高，較優(yōu)化前(Mg2+質(zhì)量濃度0.6 g/L)PLD產(chǎn)酶活力提高了約40%?？梢奙g2+對菌株發(fā)酵培養(yǎng)有促進(jìn)作用，適當(dāng)?shù)奶砑佑兄谔岣弋a(chǎn)酶效率。Ca2+對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響如圖2-b所示，當(dāng)Ca2+含量為0時酶活力最高，隨著濃度增加酶活力水平逐漸下降。含量為0.5～1.5 g/L時，相對酶活力約為85%，質(zhì)量濃度超過1.5 g/L后，酶活力發(fā)生劇烈下降，當(dāng)添加量為3 g/L時，相對酶活力僅為11%。觀察發(fā)現(xiàn)Ca2+質(zhì)量濃度為1.5 g/L時發(fā)酵培養(yǎng)基中開始產(chǎn)生鈣鹽沉淀，從而影響了后續(xù)發(fā)酵?？梢奀a2+對菌株發(fā)酵培養(yǎng)呈抑制作用，在發(fā)酵過程中應(yīng)避免添加。

2.2 菌株發(fā)酵條件研究

2.2.1 接種量對菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響

采用不同濃度的孢子接種，結(jié)果如圖3所示，孢子濃度在105個/mL時，PLD活力到達(dá)臨界點(diǎn)，此時酶活力水平最高，在臨界點(diǎn)之前，酶活力隨孢子濃度的增加而上升，在臨界點(diǎn)之后，酶活力水平保持恒定不再增高。因此在發(fā)酵接種時，孢子濃度應(yīng)≥105個/mL。

a-Mg2+；b-Ca2+
圖2 培養(yǎng)基中Mg2+、Ca2+含量對酶活力的影響
Fig.2 Effect of Mg2+and Ca2+content in culture medium on enzyme activity

圖3 接種孢子濃度對酶活力及菌體濃度的影響
Fig.3 Effect of inoculated spore concentration on enzyme activity and cell concentration

2.2.2 培養(yǎng)溫度對菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響

不同發(fā)酵溫度下，接種新鮮孢子發(fā)酵培養(yǎng)7 d檢測酶活力和菌體濃度。實驗結(jié)果如圖4所示，發(fā)酵溫度為32 ℃時，酶活力最高22.68 U/mL，此時的菌體濃度也最大。與原始發(fā)酵條件中30 ℃的培養(yǎng)溫度相比，酶活力水平提高了20%以上。因此，菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的最佳培養(yǎng)溫度為32 ℃。

2.2.3 發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響

發(fā)酵時間的優(yōu)化對于工業(yè)化生產(chǎn)成本控制較為關(guān)鍵，基于產(chǎn)業(yè)化考慮，縮短發(fā)酵時間可節(jié)約生產(chǎn)成本，帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。接種新鮮孢子至發(fā)酵培養(yǎng)基中32 ℃培養(yǎng)，檢測不同發(fā)酵時間的酶活力水平和菌體濃度，結(jié)果如圖5所示，在第6天時發(fā)酵液的PLD活力達(dá)到最高25.56 U/mL，之后逐漸下降。菌體濃度也呈現(xiàn)類似的變化趨勢。因此，可縮短發(fā)酵時間為6 d。

圖4 發(fā)酵溫度對酶活力及菌體濃度的影響
Fig.4 Effect of fermentation temperature on enzyme activity and cell concentration

圖5 發(fā)酵時間對酶活及菌體濃度的影響
Fig.5 Effect of fermentation time on enzyme activity and cell concentration

2.2.4 溶氧量對菌株發(fā)酵產(chǎn)PLD的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，250 mL的凹槽搖瓶在正常情況下的裝液量為100 mL。為進(jìn)一步放大發(fā)酵工藝提供研究基礎(chǔ)，設(shè)計實驗使裝液量在100 mL的基礎(chǔ)上一次遞減，并使用透氣型封口膜密封。圖6顯示在菌溶氧量增大的情況下，酶活力也相應(yīng)增高。裝液量為20 mL時，可能因可利用的營養(yǎng)物質(zhì)過少而導(dǎo)致酶活力減小。因此，當(dāng)使用250 mL的凹槽搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時，裝液量設(shè)置40 mL較為合適。

2.3 發(fā)酵制備工藝對PLD活力的影響

2.3.1 菌株發(fā)酵過程中加入剪切工具對酶活力的影響

鏈霉菌基內(nèi)菌絲分枝較多且不斷裂，在發(fā)酵時會產(chǎn)生鏈狀的菌絲體并與菌核交織纏繞成菌絲球[18]。菌絲球的包裹性嚴(yán)重影響目的蛋白的分泌，因此發(fā)酵過程中對菌絲球的充分?jǐn)嚿⒑臀锢砑羟兄陵P(guān)重要。除了使用凹槽搖瓶外，另加入自制的剪切工具。如圖7-a所示，該工具為三角鏢結(jié)構(gòu)，3個鏢腿為等長移液器槍頭，中心部分為圓形凸起?？蛇M(jìn)行高溫高壓滅菌，在發(fā)酵第3天時加入能有效進(jìn)行菌絲體的攪散剪切。

圖6 培養(yǎng)基裝液量對酶活力及菌體濃度的影響
Fig.6 Effect of medium volume on enzyme activity and cell concentration

2.3.2 PLD制備過程中使用冰凍保溫裝置對酶活力的影響

PLD制備過程中，多次離心和蛋白沉淀操作會使酶活力逐漸降低。為減少最終的酶活力損失，使用自制的冰凍保溫裝置進(jìn)行樣品處理。如圖7-b所示，該裝置包括隔溫托盤和冰盒兩部分，冰盒為金屬材質(zhì)的立方體結(jié)構(gòu)，從頂面向底面凹陷形成若干個離心管放置孔，隔溫托盤為隔熱泡沫材質(zhì)，可套在金屬放置架底部。分離純化過程中，將樣品管放入冰凍保溫座中保持低溫，較傳統(tǒng)的冰浴保溫時間更長且避免冰水混合物對樣品的污染。

a-剪切工具；b-冰凍保溫裝置
圖7 剪切工具、冰凍保溫裝置的結(jié)構(gòu)正視及俯視示意圖
Fig.7 Schematic diagram of shear tool and freeze insulation device structure

圖8為16組不同發(fā)酵條件的樣品分別使用原始方法和優(yōu)化后方法操作時的酶活力水平。結(jié)果顯示，同時使用剪切工具和冰凍保溫裝置，酶活力總體提高了約47%，大大減少了最終酶活的損失。其中測得最高酶活力為33 U/mL，約為最初酶活力(16.2 U/mL)的2倍。

圖8 剪切保溫對酶活力的影響
Fig.8 Effect of shear heat preservation on enzyme activity

3 結(jié)論

宿主的選擇對PLD的成功表達(dá)至關(guān)重要。在國內(nèi)外學(xué)者對PLD的異源表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，以大腸桿菌為宿主時，PLD大部分以不溶形式表達(dá)[19]，或直接對宿主生長有抑制作用[20]。以畢赤酵母或枯草芽孢桿菌[21]為宿主時，檢測到的胞外酶活力分別為1、1.5 U/mL，無法滿足生產(chǎn)需求。鏈霉菌是PLD的天然宿主，蛋白可在胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊和有效的翻譯后修飾，不會形成包涵體影響酶活性。同時鏈霉菌較高的酶分泌能力也使其成為工程化菌株的首選。本研究選用重組鏈霉菌S-pMS02作為宿主高效表達(dá)PLD，并利用酶工程對其進(jìn)行生產(chǎn)制備。

為提高菌株S-pMS02發(fā)酵產(chǎn)酶的效率，從培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件、制備工藝3個方面對其進(jìn)行了深入研究與優(yōu)化。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基各營養(yǎng)組分的優(yōu)化，最終確定可溶性淀粉為碳源，硫酸銨復(fù)合酪蛋白氨基酸為氮源，同時金屬離子的添加對菌株發(fā)酵也存在一定影響，添加適當(dāng)?shù)腗g2+有助于菌株的生長和產(chǎn)酶，而Ca2+對菌株的發(fā)酵生長有抑制作用，可能因其與發(fā)酵體系中的其他物質(zhì)反應(yīng)形成了鈣鹽沉淀，從而影響菌株生長。發(fā)酵條件的優(yōu)化可有效提高PLD的產(chǎn)酶活性和產(chǎn)酶量，其中時間的控制對產(chǎn)酶影響較大，在對時間的優(yōu)化過程中，PLD活力呈現(xiàn)1～5 d逐漸升高，第6天達(dá)到頂點(diǎn)又逐漸下降的趨勢，說明蛋白從合成到分泌至胞外需要一定的時間，有活性的PLD蛋白如果未能及時從發(fā)酵液中制備出來，可能會隨著繼續(xù)培養(yǎng)變?yōu)轲B(yǎng)分被分解。因此，在適當(dāng)?shù)臅r間制備PLD可降低生產(chǎn)耗能、減少酶活力損失。在發(fā)酵工藝上，利用自行設(shè)計的剪切工具解決了鏈霉菌菌絲纏繞成團(tuán)不利于蛋白釋放的難題，同時在PLD制備過程中使用保溫工具降低了酶活力損失，為PLD生產(chǎn)的中試試驗和工業(yè)化研究奠定了基礎(chǔ)。