全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析馥合香白酒中揮發(fā)性特征組分

中國(guó)白酒具有2000多年的釀造歷史，其中，復(fù)合香型白酒獨(dú)特的釀造工藝主要體現(xiàn)在發(fā)酵容器、制曲工藝、釀造工藝等方面[1]。黃淮地區(qū)屬于中國(guó)名酒產(chǎn)地的集中區(qū)域，以傳統(tǒng)“老五甑”工藝釀造生產(chǎn)的濃香型白酒為主，此外還擁有“淡雅濃香”、“濃醬兼香”、“多香復(fù)合”等不同風(fēng)格的白酒類型，其釀造工藝各具特色。金種子馥合香白酒作為黃淮名酒帶復(fù)合香型白酒的典型代表，采用“多曲并用、高溫堆積、分層出醅、分類蒸酒”等工藝，“泥底磚壁”窖池作為發(fā)酵容器，具有“復(fù)合香氣幽雅協(xié)調(diào)，酒體醇厚豐滿”的風(fēng)格特點(diǎn)[2]。

白酒中的風(fēng)味物質(zhì)多屬于微量或痕量成分，進(jìn)行分離和濃縮等預(yù)處理是白酒風(fēng)味分析的重要步驟，常用的預(yù)處理方法包括液液萃取法、液液微萃取法、固相萃取法、固相微萃取法(solid phase microextraction，SPME)，包括頂空固相微萃取法(headspace-SPME，HS-SPME)、同時(shí)蒸餾萃取法和攪拌棒吸附萃取法等。其中，HS-SPME無(wú)需溶劑且操作簡(jiǎn)單快速[3]。全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS)技術(shù)是20世紀(jì)90年代逐漸發(fā)展起來(lái)的新型分離技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的一維氣相色譜，該技術(shù)具有分辨率高、靈敏度高、峰容量大等特點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品揮發(fā)性組分分離鑒定的有效工具[4]。

當(dāng)前，GC×GC-TOF-MS技術(shù)已應(yīng)用于多種香型白酒的揮發(fā)性組分分析，提高了白酒揮發(fā)性組分的分析檢測(cè)水平。ZHU等[5]應(yīng)用該技術(shù)在茅臺(tái)酒中共鑒定出528種成分，還研究了一些重要芳香化合物對(duì)茅臺(tái)酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)。YAO等[6]應(yīng)用該技術(shù)鑒定了瀘州老窖的風(fēng)味成分，發(fā)現(xiàn)了24種具有生物活性的化合物，并且有數(shù)百種化合物被認(rèn)為是瀘州老窖白酒的特殊風(fēng)味來(lái)源。然而，關(guān)于復(fù)合香型白酒中揮發(fā)性特征組分的GC×GC-TOF-MS分析報(bào)道較少，關(guān)于黃淮名酒帶復(fù)合香型白酒特征組分的分析更為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(headspace solid-phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，HS-SPME-GC×GC-TOF-MS)技術(shù)首次對(duì)黃淮名酒帶的復(fù)合香型(金種子馥合香)白酒進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，并解析其特征組分，有助于增進(jìn)對(duì)馥合香白酒香氣特點(diǎn)及其特征組分的認(rèn)識(shí)，為深入研究黃淮白酒的風(fēng)味特征提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)酒樣：不同質(zhì)量等級(jí)的馥合香原酒，特級(jí)酒(以下稱JF1，酒精度63%vol)、優(yōu)級(jí)酒(以下稱JF2，酒精度50%vol)，安徽金種子酒業(yè)股份有限公司。

試劑耗材：NaCl(化學(xué)純)、無(wú)水Na2SO4等，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水由Milli Q純水儀制備(Milli-Q系統(tǒng))，美國(guó)Millipore公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相頭(2 cm,50/30 μm)，上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司。

儀器設(shè)備：全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀系統(tǒng)：7890A Agilent氣相色譜儀、Pegasus 4D飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Leco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

HS-SPME實(shí)驗(yàn)方法：參照文獻(xiàn)[7]的方法，并在萃取時(shí)間上略有調(diào)整。取5 mL酒樣加入20 mL頂空瓶中，加蓋密封，采用DVB/CAR/PDMS纖維頭，對(duì)頂空瓶中的樣品進(jìn)行SPME萃??；50 ℃恒溫15 min后，萃取30 min，立即插入GC進(jìn)樣口250 ℃解吸附5 min，再進(jìn)行GC×GC-TOF-MS分析，同條件下進(jìn)樣3次。

分析方法：參照文獻(xiàn)[8]，全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的第一維柱為DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣溫度250 ℃，初始溫度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min；氦氣(99.999 9 %) 1.0 mL/min，無(wú)分流。第二維柱為DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)，柱溫高于第一維柱5 ℃，調(diào)制解調(diào)器溫度始終保持高于第二維柱5 ℃，全二維分析調(diào)制周期4.0 s，接口溫度270 ℃，離子源溫度250 ℃，電子轟擊源70 eV，檢測(cè)器1 680 V，采集率50張/s，質(zhì)譜掃描范圍m/z 29～500，采用NIST譜庫(kù)。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(electron impact ionization，EI)，電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；檢測(cè)器電壓1 365 V，采集質(zhì)量數(shù)35～500 amu、頻率100 spectrum/s，由Leco公司Pegasus4D工作站控制數(shù)據(jù)采集。

GC×GC-TOF-MS數(shù)據(jù)處理：采集的TOF-MS數(shù)據(jù)由Leco公司Chroma TOF工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，自動(dòng)識(shí)別信噪比>50的色譜峰，并自動(dòng)和質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)。采用NIST 14和Wiley 9質(zhì)譜庫(kù)，自動(dòng)比對(duì)生成的“峰表”，再經(jīng)過(guò)人工解譜與同系物二維色譜出峰規(guī)律比對(duì)，作為初步鑒定結(jié)果；最后，去除烷烴類等沒(méi)有風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物，再選擇相似度與反相似度均>700，且可能性>4 000的化合物，并在Chroma TOF軟件中建立保留指數(shù)計(jì)算方法，確定化合物一維色譜柱保留指數(shù)，再與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)比對(duì)，選擇數(shù)值差異≤50的化合物作為最終鑒定結(jié)果[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS技術(shù)應(yīng)用于馥合香白酒揮發(fā)性組分分離的特性分析

全二維氣相色譜把分離機(jī)理不同而又互相獨(dú)立的2根色譜柱串聯(lián)，其中第一維通常采用非極性的長(zhǎng)色譜柱，根據(jù)分離物的沸點(diǎn)差異進(jìn)行分離；第二維通常采用極性或中等極性的短色譜柱，根據(jù)分離物的極性差異進(jìn)行再分離。DB-WAX色譜柱的使用溫度下限為20 ℃，改善了低沸點(diǎn)分析物的分離度；DB-17MS色譜柱屬于中等極性色譜柱，能夠?yàn)榛钚曰衔锓治鎏峁O佳的惰性，極低的柱流失性能使其適用于多種GC/MS應(yīng)用?；谏鲜鲈瓌t，本實(shí)驗(yàn)采用一維DB-WAX色譜柱搭配二維DB-17MS色譜柱對(duì)馥合香白酒中揮發(fā)性組分進(jìn)行分析，如圖1所示，全二維分析譜圖表明馥合香白酒中的揮發(fā)性組分較為復(fù)雜，其中的一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現(xiàn)象，通過(guò)二維色譜分離獲得了一定的分離效果，采用該技術(shù)在馥合香特級(jí)酒中共檢測(cè)到729個(gè)色譜峰。

a-1D總離子流色譜圖；b-2D總離子流色譜圖
圖1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法JF1的 1D和2D總離子流色譜圖
Fig.1 1D and 2D total ion flow chromatogram of JF1 based on HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 注：圖中黃色或綠色的亮點(diǎn)表示1個(gè)色譜峰

2.2 馥合香白酒中揮發(fā)性組分的HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鑒定

香氣物質(zhì)的完全分離為評(píng)價(jià)香氣物質(zhì)對(duì)白酒品質(zhì)的貢獻(xiàn)度提供了可靠依據(jù)。通過(guò)分析表1鑒定出的化合物統(tǒng)計(jì)可知，JF1、JF2中共鑒定出可信度較高的揮發(fā)性組分分別為341和303種。其中，酯類分別為117和105種，醇類分別為70和61種，有機(jī)酸類分別為43和44種，醛、酮、縮醛類分別為47和40種，揮發(fā)性含硫化合物分別為14和11種，含氮化合物分別為9和8種(其中，吡嗪類分別為7和6種)，呋喃類均為16種，其他類化合物分別為25種和18種。

表1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香 白酒中分析鑒定出的化合物統(tǒng)計(jì) 單位:種

Table 1 Statistics of compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

2.2.1 含硫化合物

揮發(fā)性含硫化合物的香氣閾值極低，香氣獨(dú)特，在大多數(shù)食品尤其是酒精飲料中含量極低，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)也具有一定的挑戰(zhàn)性[10]。從馥合香白酒中分析鑒定出的含硫化合物如表2所示。JF1、JF2中分別為14和11種，其中的三甲基二硫呈強(qiáng)烈逸發(fā)性冷的薄荷氣味和濃烈辛香香氣，類似新鮮洋蔥氣味，硫代丁酸S-甲酯具有乳酪、番茄、硫化物樣香氣，2-噻吩甲醛具有類似杏仁香氣。馥合香白酒釀造過(guò)程中高溫大曲與芝麻香曲的應(yīng)用，促進(jìn)了發(fā)酵過(guò)程中耐高溫細(xì)菌菌群的代謝，有利于原料蛋白質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而產(chǎn)生具有不同香氣特點(diǎn)的含硫化合物，可能對(duì)馥合香白酒的香氣特征具有積極貢獻(xiàn)。

揮發(fā)性含硫化合物對(duì)芝麻香型白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)是白酒風(fēng)味化學(xué)研究的熱點(diǎn)，在芝麻香型白酒中檢測(cè)到多種特征性含硫化合物，如3-甲硫基丙醇、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙酸乙酯、二甲基三硫等。本實(shí)驗(yàn)在馥合香白酒中鑒定出多種揮發(fā)性含硫化合物，如三甲基二硫、二甲基二硫等，這可能與馥合香白酒的釀造工藝吸收與借鑒了芝麻香型白酒的釀造工藝有關(guān)，

表2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鑒定出的含硫化合物
Table 2 Sulfur compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

注：a)一維色譜保留時(shí)間；b)二維色譜保留時(shí)間(下同)

對(duì)含硫化合物在特定含量下的復(fù)合香氣及其對(duì)馥合香白酒的香氣貢獻(xiàn)還有待深入研究。

2.2.2 呋喃類化合物

呋喃類化合物是構(gòu)成許多天然食品香氣特征的重要成分，具有閾值低、香氣獨(dú)特等特點(diǎn)，包括呋喃脂類、呋喃含硫類、?；秽悺⑵渌秽惢衔锏?span id="ciow7kx" class="superscript" tag="11" style="font-size: 0.6em; vertical-align: super; color: rgb(0, 153, 255);">[11]。研究發(fā)現(xiàn)，呋喃類物質(zhì)是醬香型白酒的重要呈香物質(zhì)和特征化合物[12]。從馥合香白酒中分析鑒定出的呋喃類化合物如表3所示，JF1、JF2中均檢測(cè)到16種，其中的乙酸糠酯具有果香、藥香、辛香，2-乙?；?5-甲基呋喃具有特殊香味，5-甲基-2-呋喃甲醛具有辛香、甜香、焦糖樣的香氣，2-戊基-呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香氣。苯并呋喃類和呋喃酮類化合物均具有藥用或健康功能價(jià)值[13]，馥合香白酒中檢測(cè)到的呋喃類化合物可能對(duì)其獨(dú)特香氣及健康價(jià)值具有積極貢獻(xiàn)。

表3 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鑒定出的呋喃類化合物
Table 3 Furan compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

馥合香白酒釀造過(guò)程中的蒸餾環(huán)境、酒醅組成以及釀酒工藝等是影響酒體中呋喃類化合物種類及含量的重要因素，釀酒大曲以及酒醅是原酒中呋喃類化合物的重要來(lái)源；此外，糠醛的產(chǎn)生還與蒸餾環(huán)境有重要關(guān)系，當(dāng)酒體中的糠醛含量比其他成分略多時(shí)，酒體呈現(xiàn)焦香風(fēng)味，當(dāng)糠醛的含量較多時(shí)，酒體則顯現(xiàn)醬香風(fēng)味。因而，不同質(zhì)量等級(jí)的馥合香白酒均呈現(xiàn)出一定的“焦香、醬香”等香氣特征。

芝麻香型白酒中的特殊風(fēng)味成分以吡嗪類化合物為主，輔以呋喃類、酚類、噻唑、含硫化合物等，其相互影響構(gòu)成了酒體的復(fù)合香氣。呋喃類化合物在醬香型白酒中的含量相對(duì)較高，是醬香型白酒的重要標(biāo)志組分。本實(shí)驗(yàn)在馥合香白酒中均檢測(cè)到呋喃類、酚類、噻唑、含硫化合物等特殊風(fēng)味成分，此類化合物可能對(duì)馥合香白酒的香氣特征起到重要作用。

2.2.3 含氮化合物(包括吡嗪類化合物)

白酒中的含氮類化合物以吡嗪類為主，該類化合物通常具有強(qiáng)烈的堅(jiān)果、焙烤、咖啡、焦香等香氣特征，對(duì)改善白酒的口感、促進(jìn)白酒的香氣優(yōu)雅具有積極作用[14]。有研究從不同香型白酒中檢測(cè)到多種含氮化合物，其主要有噻唑、吡啶、吡嗪及其他衍生物等[15]。本實(shí)驗(yàn)從JF1、JF2中檢測(cè)到的含氮類化合物分別為9和8種(表4)，包括吡嗪類化合物分別為7和6種，其中的噻唑具有特殊臭氣。

表4 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在馥合香白酒中分析鑒定出的含氮化合物
Table 4 Nitrogen-containing compounds identified in Fuhe-flavor Baijiu by HS-SPME-GC×GC-TOF-MS

馥合香白酒釀造中，高溫大曲、中溫大曲和芝麻香曲等分工藝階段使用，芝麻香曲復(fù)配組分的細(xì)菌曲以耐高溫產(chǎn)蛋白酶嗜熱細(xì)菌菌群為主，在糧醅堆積及入池發(fā)酵過(guò)程中促進(jìn)了原料蛋白質(zhì)的分解，均有可能產(chǎn)生具有不同香氣特點(diǎn)的含氮化合物。酒體中吡嗪類、吡啶類、吡喃類及噻唑類等組分，主要來(lái)源于高溫大曲的高溫制曲、糧醅的高溫堆積及酒醅的高溫發(fā)酵等過(guò)程，該類化合物對(duì)馥合香白酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

吡嗪類化合物廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)及健康功能因子[16]。醬香型白酒中吡嗪類化合物與醬香型白酒的感官特征密切相關(guān)，其含量對(duì)醬香型白酒的品質(zhì)具有重要影響。然而，對(duì)于馥合香白酒中吡嗪類化合物的研究還比較鮮見(jiàn)。

本實(shí)驗(yàn)從JF1、JF2中檢測(cè)到的吡嗪類化合物分別為7和6種，吡嗪類物質(zhì)閾值極低，通常對(duì)酒體風(fēng)味具有正向貢獻(xiàn)。其中，2-乙基-6-甲基-吡嗪具有堅(jiān)果、焙烤和甜香香氣，2,5-二甲基-吡嗪具有刺鼻的炒花生香氣和巧克力、奶油香氣，2-甲基吡嗪具有似牛肉加熱時(shí)發(fā)生的香味和果仁及可可似香味，三甲基吡嗪具有巧克力、果仁及可可香氣，四甲基吡嗪具有特殊的堅(jiān)果香氣，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和炒花生的香氣。部分吡嗪類物質(zhì)還具有健康功能，如四甲基吡嗪具有夠擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚，保肝、護(hù)肝等功效[17]，2-甲基吡嗪和三甲基吡嗪均具有抗氧化功能[18]，且2-甲基吡嗪可以改善高血糖，并具有分解甘油三酯的能力[19]。

馥合香白酒中檢測(cè)到的吡嗪類化合物均具有特殊香氣，這與馥合香白酒具有“芝麻香、醬香”等香氣特征密切相關(guān)，部分具有健康功能的吡嗪類化合物可作為馥合香白酒重要的特征性組分。馥合香白酒釀造過(guò)程中，糧醅經(jīng)高溫堆積產(chǎn)生與積累的風(fēng)味物質(zhì)及其前驅(qū)物(包括吡嗪類化合物)，尤其是經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)促進(jìn)了“焦香”等特殊香氣物質(zhì)的生成，這類化合物在發(fā)酵過(guò)程中溶入到酒醅中，再通過(guò)“分層出醅、分類蒸酒”等工序溶入到酒體中，有助于增加酒體中的“芝麻香、醬香”等香氣成分。

2.3 不同質(zhì)量等級(jí)馥合香白酒的主要香氣成分對(duì)比

圖2是馥合香白酒中主要香氣成分的種類占比分布圖，JF1、JF2中各香氣成分的種類占比相近，其中占比最高的均為酯類化合物，其次為酸類和醇類，占比最低的是吡嗪類化合物。馥合香白酒的釀造以“泥底磚壁”窖池作為發(fā)酵容器，窖池底部的窖泥中富含己酸菌等產(chǎn)酯微生物菌群，己酸乙酯等酯類化合物具有水果香氣，賦予酒體特殊的愉悅香氣。適量的酸類化合物對(duì)酒體的風(fēng)味感官起到緩沖作用，并在酒體貯存過(guò)程中緩慢形成具有特殊香氣的酯類。醇類化合物是酒體中醇甜和助香的主要物質(zhì)，也是形成各類香氣物質(zhì)的前驅(qū)體，其中高級(jí)醇還具有賦予酒體特殊香氣并襯托酯香的作用，使酒體的香氣更加協(xié)調(diào)。

a-JF1；b-JF2
圖2 馥合香白酒中主要香氣成分的種類占比分布圖
Fig.2 Percentage of species distribution of main aroma components in Fuhe-xiang Baijiu

馥合香白酒中酯類、醇類和酸類等占比在75%以上，其對(duì)馥合香白酒的香氣起到主要作用；其他類化合物的種類占比均較低，但其中的某些閾值較高的化合物，可能對(duì)馥合香白酒獨(dú)特香氣的形成具有重要作用。馥合香白酒的整體香氣特征可能是由多種香氣活性成分共同作用形成的。其中，分子質(zhì)量較高的醛、酮類物質(zhì)具有類似橘子皮的香氣，支鏈醛、酮類物質(zhì)具有愉快的甜味或水果香氣，含硫化合物主要呈現(xiàn)烤肉、菜葉的香氣，特殊的含氮、含硫化合物可能與其釀酒原料或釀酒工藝等帶來(lái)的豐富蛋白質(zhì)有關(guān)。

馥合香白酒釀造用曲的微生物種類較多、工藝較復(fù)雜，還存在微生物之間的相互影響等作用，發(fā)酵過(guò)程中的“產(chǎn)酒、生香、呈味、風(fēng)格”等同時(shí)形成并交叉進(jìn)行，促使了馥合香白酒形成較為豐富的香氣物質(zhì)。目前，白酒樣品的檢測(cè)分析技術(shù)有限，且受到樣品前處理方法的制約；因此，馥合香白酒的主體香氣成分及其特征性組分還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

白酒釀造過(guò)程中的發(fā)酵原料、制曲與釀酒工藝、窖池類型及地域環(huán)境等因素對(duì)釀酒微生物菌群及其代謝具有重要影響，形成不同的風(fēng)味物質(zhì)及特征組分，進(jìn)而影響白酒的風(fēng)格特點(diǎn)與香型分類，不同香型白酒均具有典型的風(fēng)味物質(zhì)或特征組分[20-21]。本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOF-MS技術(shù)首次針對(duì)黃淮名酒帶的復(fù)合香型白酒(馥合香白酒)進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，并解析其組分特征，得到以下結(jié)論：(1)JF1中檢測(cè)出729個(gè)色譜峰，鑒定出可信度較高的揮發(fā)性化合物341種，體現(xiàn)了馥合香白酒揮發(fā)性組分的復(fù)雜性；(2)JF1、JF2中檢測(cè)到的揮發(fā)性含硫化合物分別為14和11種，作為酒體中的微量成分，其含量與香氣閾值均極低，可能對(duì)馥合香白酒的香氣特征具有重要貢獻(xiàn)；(3)JF1、JF2中檢測(cè)到的呋喃類化合物均為16種，特殊香氣及功能性的呋喃類化合物可能對(duì)馥合香白酒獨(dú)特的香氣及健康價(jià)值具有積極貢獻(xiàn)；(4)JF1、JF2中檢測(cè)到的吡嗪類化合物分別為7和6種，具有獨(dú)特香氣和生理功能的吡嗪類化合物可作為馥合香白酒重要的特征性組分。馥合香白酒中鑒定出的揮發(fā)性含硫化合物和吡嗪類化合物，均可作為馥合香白酒的特征性組分。然而，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酒體中各風(fēng)味物質(zhì)的香氣協(xié)同作用還有待深入研究。