基于實時定量測序和分離培養(yǎng)技術分析不同紹興黃酒酒藥中的功能微生物

紹興黃酒作為黃酒的代表，與葡萄酒和啤酒一樣，是世界上最古老的飲料之一[1]。傳統(tǒng)黃酒釀造利用酒藥、麥曲等發(fā)酵劑中多種有益微生物參與糖化發(fā)酵，利用微生物提供的水解酶，如蛋白酶、淀粉酶等，分解大米和小麥中的大分子并產生相應的代謝物共同構成了黃酒獨特的色、香、味和風格[2-3]。酒藥，又名小曲、白藥、酒餅，是以米粉為原料，辣蓼草為輔料，通過接種陳年酒藥進行菌種傳代制成的，是中國黃酒釀造中一種獨特的糖化發(fā)酵劑，具有糖化發(fā)酵力強，用藥量少，生產方法及設備簡單等優(yōu)點[4]。酒藥作為傳統(tǒng)黃酒的重要原料，是黃酒釀造過程中重要的動力源，賦予紹興酒獨特的品質，酒藥微生物對黃酒的發(fā)酵過程具有至關重要的作用[5]。

傳統(tǒng)發(fā)酵劑的生產通常是在開放且復雜的工作環(huán)境中手工制作而成，其局限性在于不同批次發(fā)酵劑的質量特征不穩(wěn)定，進而影響酒的品質[6]。對于白酒大曲而言，地理因素和環(huán)境生長條件的差異形成了獨特的小麥原料微生物區(qū)系，這些微生物為大曲微生物群落的演化帶來更多的可能性，進而影響功能微生物的代謝以及白酒的品質[7]。CHEN等[8]從屬水平對比了紹興地區(qū)Dongfang、Tapai等6個酒廠酒藥微生物的組成，其中片球菌(39.20%)、腸桿菌(16.06%)、魏斯氏菌(8.83%)、克雷伯氏菌(5.04%)、埃希氏桿菌(3.64%)、嗜碳芽孢桿菌(1.65%)、阪崎腸桿菌(1.53%)、蒼白桿菌(1.35%)和青枯菌(1.04%)相對豐度均超過1%；真菌以根霉屬(36.08%)和酵母菌屬(34.08%)為優(yōu)勢微生物，不同微生物最終會影響酒的品質。毛青鐘[9]發(fā)現(xiàn)，黃酒酒藥中的微生物主要包括霉菌、酵母和細菌。霉菌主要有根霉、紅曲霉、黃曲霉、黑曲霉、毛霉、犁頭霉和青霉等；酵母菌有扣囊覆膜酵母屬、釀酒酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬等；細菌主要包括乳酸菌(乳球菌、乳桿菌)、丁酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌等。

當前與黃酒酒藥相關的研究以及對酒藥種水平微生物群落及菌種特性研究甚少，探究不同酒廠酒藥核心微生物組成及特性，對于研究酒藥對黃酒品質的作用具有重要意義。本研究采用理化指標測定、單分子實時定量測序技術及微生物功能分析，研究紹興不同酒廠酒藥樣品的理化指標、微生物群落及特性差異，旨在闡明不同酒廠酒藥核心微生物種水平群落結構及其菌種特性，為未來酒藥機械化生產及保持傳統(tǒng)紹興酒品質的穩(wěn)定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用2020年傳統(tǒng)紹興酒生產使用的成品酒藥，取自于紹興地區(qū)4個大型代表性手工黃酒廠，編號SYH，TP，JH，CYY。理化指標測定樣品密封并記錄樣品信息后保藏于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)樣品酶活力測定、測序相關研究；微生物篩選樣品密封并記錄樣品信息后保藏于4 ℃冰箱，用于后續(xù)研究。

1.2 主要培養(yǎng)基

1.2.1 微生物篩選培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH(7.0±0.1)，用去離子水定容至1 L。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸出粉5，pH 6.8，用去離子水定容至1 L。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸粉5，酵母浸粉4，葡萄糖20，K2HPO4 2，檸檬酸三銨2，醋酸鈉5，MgSO4 0.2，MnSO4 0.05，吐溫80 1，pH(6.2±0.2)，用去離子水定容至1 L。

高氏一號培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO3 1，NaCl 0.5，K2HPO4 0.5，MgSO4 0.5，F(xiàn)eSO4 0.01，瓊脂15，pH(7.3±0.1)，用去離子水定容至1 L。

1.2.2 指示微生物培養(yǎng)基

產蛋白酶培養(yǎng)基(g/L)：魚粉蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖20，脫脂乳粉20，NaCl 1，瓊脂18，pH 6.6，用去離子水定容至1 L。

產淀粉酶培養(yǎng)基[10](g/L)：魚粉蛋白胨10，酵母浸出粉10，可溶性淀粉20，瓊脂18，pH 6.8，用去離子水定容至1 L。

產酸-LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，溴碘酚紫0.05，pH(7.0±0.1)，用去離子水定容至1 L。

產酸-YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸出粉5，溴碘酚紫0.05，pH(6.8±0.1)，用去離子水定容至1 L。

1.3 儀器與設備

SW-CJ-1 CCV超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DF-101 KS恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司；FE 20 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KC/HWS-250 PY恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海凱測實驗設備有限公司；GZX—9146 MBE電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；HYL-C 3組合式搖床，蘇州太倉市強樂實驗設備有限公司；SynergyH 1全功能酶標儀，美國Bio-RAD公司；ABI GeneAmp? 9700型PCR儀，賽默飛世爾科技公司；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)，Promega公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 理化指標測定

水分含量采用烘干法測定，參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；酸度測定參照GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》；液化力測定參考文獻[11]，糖化力及酸性蛋白酶活力測定參考《工業(yè)酶制劑通用實驗方法》。

1.4.2 高通量測序

1.4.2.1 DNA提取、擴增與檢測

采用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒方法對酒藥樣本的基因組進行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA。利用帶有barcode的特異性引物對總DNA進行擴增，其中，PCR聚合酶采用：TransGen AP221-02的TransStart FastPfu DNA Polymerase；使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，利用Tris-HCl洗脫DNA，再利用2%瓊脂糖電泳進行檢測。最后，PCR產物用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

1.4.2.2 文庫構建與上機測序

將DNA用Megaruptor打斷，使用Bluepinpin篩選10 kb以上的片段，經末端修復和加A尾后，加barcode，檢測片段長度，隨后把帶有不同barcode的樣本按照等摩爾數(shù)混合，加接頭、模板純化、使用Qubit進行濃度檢測，完成DNA文庫的制備。在 PacBio Sequel II上使用Grandomics中的Sequencing Primer V4和Sequel II Binding Kit 2.1進行測序。如果擴增片段≥3 kb，則試劑盒為2.0版本。測序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結果更加準確、可靠，首先對原始數(shù)據(jù)進行質控，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種分類分析。根據(jù)97%一致性閾值進行OTUs聚類，對OTUs進行豐度及多樣性分析。

1.4.3 酒藥微生物的篩選、鑒定及特性分析

取若干個250 mL錐形瓶，裝入50 mL生理鹽水和若干個玻璃珠，121 ℃滅菌20 min后待用。在超凈工作臺中，稱取5 g酒藥粉末加入錐形瓶中，充分振蕩搖勻作為原液，并對原液進行10-1～10-7不同梯度稀釋。吸取10-3～10-5稀釋液100 μL涂布于篩選平板，細菌于恒溫恒濕培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于28 ℃培養(yǎng)48 h。待長出菌落后，進行分離純化，獲得單一菌株。

DNA的提取使用SDS-CTAB法[12]。細菌采用16S rDNA鑒定，使用通用引物27-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；真菌采用ITS鑒定，引物為ITS1-F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴增后于上海生工送樣測序，結果見表2和3。

為研究不同微生物產酸、淀粉酶和酸性蛋白酶活力差異，將菌株分別涂布于相應的培養(yǎng)基，細菌于恒溫恒濕培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h，真菌于28 ℃培養(yǎng)48 h。觀察平板上菌落的生長情況以及菌落周圍的透明圈大小，酶活力指數(shù)(enzymatic activity index，EI)為水解圈直徑與菌落直徑的比值[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018和SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。采用ANOVA方差分析與差異顯著性檢驗，采用Origin軟件進行圖像處理。所有實驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同酒廠酒藥的微生物群落結構分析

利用SMRT-seq技術對不同酒廠成品酒藥進行微生物群落結構分析，從種水平進行微生物組成分析，共鑒定出231種細菌和110種真菌，其中種水平相對豐度在1%以上的優(yōu)勢細菌共有21種，優(yōu)勢真菌共有9種。

SYH酒廠酒藥細菌共有3個屬相對含量大于1%，主要為片球菌屬(Pediococcus，51.53%)、魏斯氏菌屬(Weissella，9.56%)；種水平如圖1-a顯示，以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus，44.66%)、食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria，7.20%)、片球菌屬其他(Pediococcus other，5.20%)等為主。TP酒廠酒藥細菌共有5個屬相對含量大于1%，主要為片球菌屬(Pediococcus，42.24%)、腸桿菌屬(Enterobacter，14.10%)；種水平如圖1-a顯示以戊糖片球菌(P.pentosaceus，36.27%)、腸桿菌屬其他(Enterococcus other，12.75%)、片球菌屬其他(Pediococcus other，4.35%)等為主。JH酒廠酒藥細菌共有6個屬相對含量大于1%，主要為魏斯氏菌屬(Weissella，52.41%)、片球菌屬(Pediococcus，12.85%)、乳球菌屬(Lactococcus，4.61%)；種水平細菌以食竇魏斯氏菌(W.cibaria，43.98%)、戊糖片球菌(P.pentosaceus，11.67%)、乳球菌屬其他(Lactococcus Other，4.48%)為主。CYY酒廠酒藥細菌共有7個屬相對含量大于1%，主要為魏斯氏菌屬(Weissella，26.63%)、伴突菌屬(Sodalis，6.50%)、片球菌屬(Pediococcus，3.87%)；CYY酒廠酒藥種水平則以食竇魏斯氏菌(W.cibaria，17.92%)、伴突屬其他(Sodalis Other，6.50%)，融合魏斯氏菌(W.confusa，5.90%)等為主。可以發(fā)現(xiàn)4個酒廠主要細菌中均含有片球菌屬(Pediococcus)及魏斯氏菌屬(Weissella)，但相對含量有一定差異。不同酒廠酒藥的細菌群落結構有明顯差異，TP酒廠酒藥腸桿菌屬(Enterobacter)細菌含量相對于其他酒廠較高，JH酒廠酒藥中乳球菌屬(Lactococcus)細菌含量較高，CYY酒廠酒藥伴突菌屬(Sodalis)細菌含量較高。不同的微生物具有不同的功能特性及代謝產物，因此會對酒藥的理化指標產生一定影響。

相比于細菌群落結構，真菌的種水平結果如圖1-b顯示，SYH酒廠酒藥以扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera，73.53%)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，7.08%)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus，5.01%)等為主；TP酒廠酒藥以扣囊復膜酵母(S.fibuligera，64.74%)，少根根霉(Rhizopus arrhizus，15.58%)，小孢根霉(Rhizopus microsporus，9.55%)等為主；JH酒廠酒藥以扣囊復膜酵母(S.fibuligera，63.38%)、少根根霉(R.arrhizus，9.83%)、東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis，8.96%)等為主；CYY酒廠酒藥則以扣囊復膜酵母(S.fibuligera，76.67%)、光滑假絲酵母(Candida glabrata，7.93%)、釀酒酵母(S.cerevisiae，5.11%)等為主，可以看出真菌群落結構較為穩(wěn)定，扣囊復膜酵母(S.fibuligera)在4個廠區(qū)中均是相對豐度最高的真菌。不同廠區(qū)酒藥微生物群落結構的差異，可能是由于通常生產中曲的制作方式是生料制曲、開放式發(fā)酵，在制作過程中會受到生產環(huán)境、環(huán)境微生物以及人為因素等的影響，推測不同的發(fā)酵環(huán)境對細菌影響較大，對真菌影響較小，這些條件共同影響曲的質量及微生物種群結構，進而影響到酒產品的品質[14]。

a-細菌；b-真菌
圖1 不同酒廠酒藥微生物群落結構
Fig.1 Microbial community structure of Jiuyao in different wineries

2.2 不同酒廠酒藥的理化指標分析

不同的微生物群落結構會對理化指標產生一定影響，而理化指標的改變也會進一步影響微生物的群落結構，微生物群落和理化指標的相互作用，形成了穩(wěn)定的發(fā)酵系統(tǒng)，因此探究不同酒廠酒藥的理化指標(表1)具有重要意義。

表1 酒藥理化指標
Table 1 Physicochemical indicators in Jiuyao

注：同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)

4個酒廠成品酒藥含水量在11%～15%，其中JH酒藥水分含量顯著高于其他酒廠(P<0.05)，酒藥水分含量一般控制在11%左右，不同酒廠酒藥水分含量存在差異可能是由于不同酒廠酒藥制作工藝及干燥時間略有差異，水分含量的差異可能會導致最終成品酒藥中的微生物組成存在差異[15]；微生物生長過程中會代謝產生酸性物質使酒藥表現(xiàn)為酸性，如乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)等[16]。酒藥酸度在13～35 g/kg，TP和JH的酸度較高(P<0.05)，SYH的酸度較低(P<0.05)，這可能是因為不同酒廠的酒藥中的微生物群落差異導致的(圖1-a)，SYH酒廠片球菌屬豐度為51.53%，豐度遠高于其他酒廠，但酸度較低，可能是片球菌屬的產酸能力較低；而TP酒廠酒藥中的腸桿菌屬(Enterobacter)和JH酒藥中的乳球菌屬(Lactococcus)相對含量較高，可能是這2個屬的細菌具有較高的產酸能力。酒藥液化酶活力在0.4～1.4 U/g，TP和JH酒廠的液化酶活力較高(P<0.05)，SYH和CYY的液化酶活力較低；糖化酶活力約在100～200 U/g，各酒廠糖化酶活力沒有顯著差異；酒藥酸性蛋白酶活力在80～200 U/g，其中以SYH的酸性蛋白酶活力最高，為(190.08±26.74) U/g(P<0.05)，TP最低為(86.43±10.03) U/g，這可能和真菌微生物的組成差異相關(圖1-b)，SYH和CYY酒廠酒藥除了扣囊復膜酵母(S.fibuligera)外，釀酒酵母(S.cerevisiae，5.11%)含量相比于其他酒廠酒藥較高，因此推測釀酒酵母對酒藥酸性蛋白酶活力具有一定貢獻。

曲粉中的微生物可以通過自身菌體或分泌的酶將糊化原料分解產生小分子糖如麥芽糖和葡萄糖，不僅可以為后續(xù)微生物生長提供營養(yǎng)物質，也供發(fā)酵階段產生乙醇和香味物質[17]。在生產中，較高的酶活力表明起罐和發(fā)酵效率較高，可以促進發(fā)酵的進行[18]。因此，微生物具有的功能特性，對黃酒品質具有重要影響。

2.3 酒藥微生物篩選及功能分析

分析不同酒廠酒藥的微生物群落結構差異，結合酒藥的酶活力相關指標可以確定酒藥中的戊糖片球菌(Pediococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)等細菌，扣囊復膜酵母(S.fibuligera)、釀酒酵母(S.cerevisiae)等真菌可能為促進酒藥品質提升的功能微生物，分離得到相關微生物能夠強化提升酒藥品質。通過傳統(tǒng)的篩選方法，從酒藥中分離出71株微生物，包括44株真菌，27株細菌(表2和表3)。這些微生物約占細菌微生物群的27%～60%，真菌微生物群的60%～90%。其中異常威克漢姆酵母(W.anomalus)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、扣囊復膜酵母(S.fibuligera)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)的分離比例最高，其他微生物如融合魏斯氏菌(Weissella confusa)的分離比例較小。除此之外，SMRT-seq分析中未檢出的異常畢赤酵母(Pichia anomala)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)等也在傳統(tǒng)篩選中被鑒定出來。這些菌株可能只在酒藥微生物中占很小比例，在基因組提取或PCR擴增過程中丟失了序列信息[19]。

表2酒藥真菌功能分析
Table 2 Analysis of the function of Jiuyao fungi

注：酸度中，++表示產酸能力強，+代表產酸能力弱；酶活力中，EI值表示透明圈直徑(cm)與菌落直徑(cm)的比值

當微生物的酶活指數(shù)(EI)≥2.0時，該微生物被認為是潛在的產酶菌株[20]，微生物特性分析結果表明，4株扣囊復膜酵母(S.fibuligera)的EI值可達到2.4～2.7，可能在酒藥中的扣囊復膜酵母首先分解米粉中的淀粉，為酒藥中微生物生長提供營養(yǎng)，促進釀酒酵母等其他酵母的生長；酸性蛋白酶活性中釀酒酵母(S.cerevisiae)Y30菌株EI值為2.09，扣囊復膜酵母(S.fibuligera)Y35的EI值為2.00，酸性蛋白酶可以溶解顆粒狀原料并從顆粒上釋放被吸附的α-淀粉酶，也可以分解原料、死菌菌體蛋白生成的氨基酸，為酵母菌的生長提供能量[21]；此外，研究表明霉菌也是影響發(fā)酵劑淀粉酶和蛋白酶活性的主要因素[19]。因此，占微生物群比例最高的扣囊復膜酵母對酒藥的淀粉酶和蛋白酶活性貢獻最大；釀酒酵母對酸性蛋白酶活性有一定貢獻，驗證了SYH和CYY酒廠酒藥酸性蛋白酶活性相對于其他酒廠酒藥較高的原因。本次篩選出較多異常威克漢姆酵母，結果顯示大多數(shù)異常威克漢姆酵母都具有較高的產酸能力。研究表明異常威克漢姆酵母在培養(yǎng)過程中可產酯類、醇類和有機酸類等風味物質，對香氣的形成起著重要作用，常常作為白酒釀造、發(fā)酵食品的重要功能微生物[22]，可在后續(xù)對異常威克漢姆酵母對黃酒風味的影響進行下一步研究。釀酒酵母也具有一定的產酸能力，不同的釀酒酵母因其獨特的代謝方式可以直接影響發(fā)酵過程中有機酸的分泌，有機酸作為發(fā)酵食品中酸味的重要組成部分，與發(fā)酵食品的質量評價和品質管理有著密切的關系[23-24]。

如表3所示，細菌中，共篩選出11株戊糖片球菌，研究表明戊糖片球菌可以抑制許多食源性病原體在食物中的繁殖，如李斯特氏菌等[25]。僅有1株戊糖片球菌產酸，驗證了SYH酒廠片球菌屬豐度較高，但酸度較低的原因；大部分乳桿菌具有產酸能力，但細菌均不具有淀粉酶和蛋白酶活性。推測酒藥中的產酸微生物在酒藥制作過程中具有一定抑菌作用，可以抑制有害微生物生長。綜上所述，酒藥中不同微生物共同作用，形成一個穩(wěn)定的環(huán)境，不僅保證了其中核心微生物的生長，也保證了酒藥的功能特性。

表3酒藥細菌功能驗證
Table 3 Analysis of the function of Jiuyao bacteria

注：+表示能產酸，-不能產酸

3 結論與討論

本文對不同酒廠酒藥進行微生物群落結構、理化因子分析并篩選主要功能微生物。結果表明，不同酒廠酒藥在細菌群落結構有一定差異，但真菌群落結構較為穩(wěn)定，以扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)為優(yōu)勢微生物(相對豐度大于63%)。在理化指標方面存在一定差異，其中JH酒藥水分含量明顯高于其他酒廠(P<0.05)，TP和JH酒廠酒藥的酸度和液化酶活力較高(P<0.05)，各酒廠糖化力沒有顯著差異，SYH酒廠酒藥的酸性蛋白酶活力最高(P<0.05)。從酒藥中篩選鑒定出71株微生物，包括44株真菌，27株細菌。對微生物進行功能性分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)微生物都具有產酸能力，推測這些微生物可以為酒藥發(fā)酵提供一個酸性環(huán)境，抑制有害微生物的生長；扣囊復膜酵母具有較強的淀粉酶和蛋白酶活性，能夠分解酒藥中的營養(yǎng)物質，為微生物的生長提供能量。因此，占微生物群比例最高的扣囊復膜酵母是酒藥酵母中淀粉酶和蛋白酶的主要貢獻者?？偟膩碚f，本研究解析了不同酒廠酒藥核心微生物種水平群落結構及其菌種特性，闡明扣囊復膜酵母在酒藥中的關鍵作用，對保持傳統(tǒng)紹興酒品質穩(wěn)定及實現(xiàn)酒藥機械化生產具有重要意義。