胰蛋白酶催化羅丹明110雙酰胺衍生物熒光酶聯(lián)免疫吸附方法檢測桔青霉素

桔青霉素(citrinin，CIT)是一種由青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和紅曲霉屬(Monascus)中的部分菌株產(chǎn)生的聚酮類真菌毒素，其主要存在于儲存的谷物中[1]。特別在氣候較炎熱的國家生產(chǎn)的谷物，CIT的污染是一個嚴重問題[2]。谷物產(chǎn)品和其他具有藥用價值的植物在生長、收獲、運輸和儲存過程中可能會被產(chǎn)生CIT的真菌污染[3-4]。當處理和儲存條件沒有得到嚴格控制時，水果也易被CIT污染而造成重大損失。根據(jù)調(diào)查，工業(yè)化國家的作物收獲后損失約為25%，其他國家超過50%[5]。而且CIT被證明對動物具有較強的腎毒性以及潛在的遺傳毒性、胚胎毒性[6]和致畸性[7]。鑒于其對人類健康及經(jīng)濟發(fā)展的危害，開發(fā)一種靈敏、快速的CIT檢測方法顯得非常重要。日本厚生省在2000年版的“日本食品添加劑標準”中率先制定出紅曲色素中CIT限量標準為0.2 mg/kg，這一標準是當時能夠檢出的CIT的最低劑量[8]，歐盟規(guī)定CIT在紅曲霉發(fā)酵的大米補充劑中的限量標準為2 mg/kg，中國臺灣省制定的《食品中真菌毒素限量標準》規(guī)定了食品中CIT的限量，其中紅曲色素中CIT的限量為0.2 mg/kg、原料用紅曲米的限量為5 mg/kg以下，使用紅曲原料制成的食品為2 mg/kg以下[8]。目前在中國大陸地區(qū)，還沒有建立不同農(nóng)產(chǎn)品中CIT含量的控制指標。

目前，CIT檢測可用的分析方法有薄層色譜法[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)[11]、超高效液相色譜和熒光檢測法[12]、氣相色譜質(zhì)譜法[13]和酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[14]。薄層色譜法雖然操作簡單，但是準確性和特異性較差；HPLC等儀器檢測方法雖然靈敏度和穩(wěn)定性較高，但樣品前處理操作較為復雜，且需要專業(yè)的大型儀器和檢測場所，不能滿足食品安全快速檢測要求。ELISA作為一種靈敏度高、高通量、設備簡單、成本低的樣品篩查和定量方法，近年來得到了迅速發(fā)展和廣泛應用。基于辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)催化底物的比色ELISA法存在靈敏度低、抗基質(zhì)干擾能力差的局限性。熒光酶聯(lián)免疫分析法(fluorescein-linked immunosorbent assay，F(xiàn)ELISA)與現(xiàn)有的分析平臺兼容性良好，被認為是目前有害食源性物質(zhì)篩選最敏感的方法之一[15-16]。在過去的幾十年里，已開發(fā)出多種具有高靈敏度的FELISA用于檢測目標分子，包括基于堿性磷酸酶的化學發(fā)光免疫檢測[17]、基于HRP的化學發(fā)光免疫檢測[18]、基于過氧化氫酶的熒光免疫檢測[19]、基于人α凝血酶的熒光免疫檢測[20]等，具有更廣泛的應用前景。因此，建立一種具有高靈敏度的FELISA方法用于谷物中CIT的定量檢測具有較大的應用前景。

胰蛋白酶(trypsin)是一種高特異性的絲氨酸蛋白水解酶，對于含精氨酸(Arg)位點的肽段表現(xiàn)出非常高的水解催化性能[21]?；趖rypsin的這個特性，研究人員設計并合成了含氨基保護基的三肽Cbz-Ile-Pro-Arg-OH，再通過?；磻獙rg的羧基與羅丹明110分子中的2個氨基縮合形成雙酰胺底物(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-R110，用于trypsin的催化能力測定[22]。在trypsin的催化下，連接在羅丹明110分子兩端的酰胺鍵迅速發(fā)生水解斷裂，具有微弱熒光的羅丹明110雙酰胺底物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕姛晒獾牧_丹明110分子，熒光信號強度可以得到極強的提高[23]。本研究通過將trypsin和羅丹明110雙酰胺底物引入到FELISA中，克服實際樣本的基質(zhì)干擾，以實現(xiàn)檢測靈敏度提高的目的。

本研究通過甲醛加成法[24]合成了trypsin-CIT，并將其引入到FELISA信號生成系統(tǒng)實現(xiàn)CIT的快速檢測。其原理如圖1所示，trypsin-CIT可通過抗原-抗體相互作用被固定在酶標孔中，選擇trypsin替代常用的HRP作為標記酶，并且選用僅存在極低熒光的羅丹明110雙酰胺衍生物作為trypsin的催化底物。通過CIT與trypsin-CIT對其抗體的競爭關系，被固定下來的trypsin催化羅丹明110雙酰胺衍生物裂解而觸發(fā)熒光信號的產(chǎn)生，實現(xiàn)對CIT的快速檢測。本研究與傳統(tǒng)ELISA的HRP-TMB顯色體系進行了對比，顯示出較高的分析靈敏度，并將其應用于檢測玉米樣本，驗證了本方法的檢測性能和穩(wěn)定性。

圖1 Trypsin催化的羅丹明110雙酰胺熒光底物 ELISA方法檢測CIT
Fig.1 Trypsin-catalyzed rhodamine 110 bis-amide fluorescent substrate ELISA method for the detection of CIT

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶、鏈球菌蛋白G, 美國Sigma-Aldrich公司；(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-R110賽默飛世爾科技公司； CIT， Fermentek公司；抗CIT腹水， 南昌大學中德聯(lián)合研究院；脫脂乳， 廣東賽國生物科技有限公司；甲醇(色譜純、分析純)及常見試劑(分析純)，西隴科學分有限公司；96孔酶標板， Costar公司。

Waters H CLASS/XEVD TQD， 美國沃特世公司；桔青霉素免疫親和柱， 北京華安麥克生物技術有限公司；Varioskan LUX多功能酶標儀， 賽默飛世爾公司；超純水儀， 美國密里博公司。

1.2 trypsin-CIT與HRP-CIT的制備

將5.7 mg trypsin溶解于2 mL濃度為1 mmol/L的HCl(pH 3)中，隨后向其中逐滴加入10 mg/mL的CIT甲醇溶液100 μL，混合均勻后加入200 μL體積分數(shù)為37%甲醛溶液，37 ℃攪拌反應24 h，即得到trypsin-CIT，同樣CIT與HRP反應得到HRP-CIT，反應結(jié)束后，置0.01 mol/L PBS中4 ℃透析72 h。

1.3 trypsin催化的熒光底物濃度

羅丹明110雙酰胺熒光底物的濃度對于trypsin催化的FELISA信號強度有著較大影響，因此本研究測定了在相同trypsin質(zhì)量濃度(400 ng/mL)條件下，熒光底物濃度與trypsin濃度的變化規(guī)律，獲得最佳目標底物濃度。

1.4 trypsin催化的FELISA檢測流程

將鏈球菌蛋白G(proteinG)用PBS(pH 8.6)稀釋至25 μg/mL，每孔100 mL，4 ℃過夜包被，去除孔內(nèi)液體，用含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖液進行洗板，重復3次，用PBS(pH 7.4)將抗CIT腹水稀釋至20 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h后洗板，加入300 μL 1%脫脂乳溶液，37 ℃孵育1 h，加入50 μL質(zhì)量濃度為5.5 μg/mL的trypsin-CIT和50 μL的待測液，37 ℃孵育30 min后洗板，加入濃度為0.312 5 μmol/L的羅丹明雙酰胺底物，37 ℃孵育30 min后測定激發(fā)波長為498 nm，發(fā)射波長為521 nm時的熒光強度。

1.5 trypsin催化的FELISA的精密度與準確性評價

分別通過LC-MS/MS和FELISA的方法對加標的陰性玉米樣本進行分析，隨后根據(jù)GB 5009.222—2016《桔青霉素測定》中的樣本提取方法：稱取10.0 g加有CIT的玉米樣本于錐形瓶中，加入50 mL體積分數(shù)70%的甲醇水溶液，在渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心，取上清液用快速定性濾紙過濾后待檢測。取上清液用0.01 mol/L PBS稀釋7倍后，進行FELISA檢測；另取1 mL上清液加入49 mL 0.01 mol/L磷酸溶液(pH 7.5)混勻，用微纖維濾紙過濾后取20 mL上述溶液過免疫親和柱凈化，將其以1～2滴/s的流速全部通過親和柱，再將5 mL 0.01 mol/L磷酸溶液(pH 7.5)也以1～2滴/s的流速通過親和柱，待液體排干后，用2 mL甲醇以1滴/s的流速進行洗脫，洗脫液收集至樣品瓶中用于LC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 trypsin催化的熒光底物濃度

根據(jù)圖2-a可得，在trypsin質(zhì)量濃度固定于400 ng/mL條件下，隨著底物濃度升高，trypsin催化底物產(chǎn)生的熒光信號也逐漸升高。結(jié)合熒光信號強度，底物濃度為0.156 μmol/L時具有明顯的熒光信號，故選擇了0.156 μmol/L為本實驗的最終底物濃度。

2.2 trypsin-CIT與trypsin催化性能對比

在0.156 μmol/L底物濃度下，繪制trypsin、trypsin-CIT濃度與熒光強度關系曲線，如圖2-b所示，trypsin和trypsin-CIT質(zhì)量濃度為25 ng/mL時，trypsin-CIT催化產(chǎn)生的熒光強度為35.42，trypsin催化產(chǎn)生的熒光強度為16.68，可推得酶活損失52.91%。

a-trypsin(400 ng/mL)條件下底物濃度與熒光強度關系； b-trypsin、trypsin-CIT濃度與熒光強度關系
圖2 底物濃度及不同酶濃度對熒光強度的影響
Fig.2 Effect of substrate concentration, trypsin and trypsin-CIT concentration on fluorescence intensity

2.3 trypsin催化的熒光ELISA的檢測條件優(yōu)化

實驗優(yōu)化了包被腹水濃度、trypsin-CIT濃度、pH、甲醇濃度、NaCl濃度、免疫孵育時間和酶催化時間等影響FELISA的幾個關鍵參數(shù)，以獲得高靈敏度和強熒光信號。

包被抗體和trypsin-CIT的濃度被認為是影響直接競爭ELISA檢測靈敏度的最重要因素。為了提高CIT抗體的生物活性，本實驗預先將proteinG包被在酶標板上，定向捕獲CIT抗體的Fc片段，從而提高CIT抗體的生物活性。因此本實驗設置腹水質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg/mL和trypsin-CIT質(zhì)量濃度為22、11、5.5、2.75 μg/mL進行正交實驗，結(jié)果如表1，通過(F為陰性條件下的熒光值，F0為50 ng/mL加標條件下的熒光值)反映本方法對CIT的檢測靈敏度，并基于F與F0的最大差值與B0的最高值原則選擇最佳腹水濃度與trypsin-CIT濃度，根據(jù)最佳信號顯示，包被腹水質(zhì)量濃度為20 μg/mL、trypsin-CIT質(zhì)量濃度為5.5 μg/mL是最佳條件。

表1 棋盤滴定法優(yōu)化包被腹水濃度和trypsin-CIT濃度
Table 1 Optimized coated ascites concentration and trypsin-CIT concentration by a checkboard titration method

注：*為最佳包被腹水濃度和Trypsin-CIT

pH、甲醇濃度、NaCl濃度能夠通過改變抗原抗體結(jié)合位點的活性來影響抗原抗體反應，本實驗通過B0=(1-F/F0)×100(F為陰性條件下的熒光值，F0為50 ng/mL加標條件下的熒光值)反映加入標準品后的抑制結(jié)果，當B0值越大時，表示本方法對于CIT的檢測靈敏度越高。如圖3-a所示，在pH 6.5時，B0達到最大值，為最佳pH條件。由于CIT分子具有很強的疏水性，為實現(xiàn)對樣本中CIT的高回收率提取，需要用含有一定體積分數(shù)甲醇的樣本提取液，但是待檢測溶液中的甲醇體積分數(shù)過高時，抗原抗體的反應會受到極大干擾，因此，研究了含不同體積分數(shù)甲醇的待檢測溶液進行反應的檢測結(jié)果，如圖3-b所示，當甲醇體積分數(shù)升高時，B0會逐漸下降，且在甲醇體積分數(shù)>10%時B0從34.09%降至15.55%，基于這一結(jié)果，本實驗選擇甲醇體積分數(shù)為10%為免疫檢測最佳條件。在免疫反應過程中，一定濃度的NaCl有利于抗原抗體的相互作用，如圖3-c所示，隨著NaCl濃度的升高，B0也逐漸升高，且當NaCl濃度達到80 mmol/L時，B0達到最高值。為了評價免疫孵育時間和酶催化時間對B0的影響，設置了不同免疫孵育時間(15～75 min)和不同酶催化時間(10～60 min)作為反應條件，30 min是免疫孵育時間最佳條件(圖3-d)，酶催化時間達到30 min后，B0進入平臺期(圖3-e)，因此最佳酶催化時間為30 min。

a-pH；b-甲醇體積分數(shù)；c-NaCl濃度；d-免疫孵育時間；e-酶催化時間
圖3 Trypsin催化的FELISA檢測條件優(yōu)化
Fig.3 Optimization of FELISA detection conditions catalyzed by Trypsin

2.4 trypsin催化的FELISA檢測性能評價

以CIT濃度為橫坐標，B0為橫坐標繪制定量曲線(圖4-a)，隨著溶液中的CIT質(zhì)量濃度從1.56～6 400 ng/mL，B0逐漸增加，且在CIT質(zhì)量濃度為12.5～400 ng/mL時，B0隨CIT濃度增加呈線性增加關系，其定量可用方程y=18.606 lnx-18.713(R2=0.992)，檢測靈敏度IC20為8.01 ng/mL，IC50為40.16 ng/mL，為了與基于HRP-CIT的傳統(tǒng)比色ELISA檢測性能對比，設置腹水質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg/mL，HRP-CIT質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg/mL進行正交實驗同樣優(yōu)化了二者濃度，結(jié)果如表2，根據(jù)競爭抑制率B0=(1-OD陰性/OD陽性)×100(OD陰性為陰性條件下的吸光度，OD陽性為加標200 ng/mL條件下的吸光度)，由最高競爭抑制率所對應的條件得出最佳腹水質(zhì)量濃度為40 μg/mL，HRP-CIT質(zhì)量濃度為40 μg/mL，同時基于此條件構(gòu)建了基于HRP-CIT的傳統(tǒng)比色ELISA，并繪制了其定量曲線(圖4-b)，其定量可用方程y=13.476 lnx-11.975(R2=0.971 2)，檢測靈敏度IC20為10.73 ng/mL，IC50為110.08 ng/mL，對比可得，本實驗構(gòu)建的FELISA檢測靈敏度是傳統(tǒng)比色ELISA的1.34倍，IC50是傳統(tǒng)比色ELISA的2.741倍。

a-trypsin催化的FELISA檢測CIT定量曲線; b-HRP催化的比色ELISA檢測CIT定量曲線
圖4 Trypsin催化的FELISA與HRP催化的比色 ELISA檢測性能比較
Fig.4 Detection efficacy of FELISA catalyzed by trypsin and colorimetric ELISA catalyzed by HRP

表2 棋盤滴定法優(yōu)化包被腹水濃度和HRP-CIT濃度
Table 2 Optimized coated ascites concentration and HRP-CIT concentration by a checkboard titration method

注：*為最佳包被腹水濃度和HRP-CIT

用本方法進一步檢測質(zhì)量濃度為1 μg/mL的常見真菌毒素CIT、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮(deoxynivalenone，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin AFG1，AFG1)和伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)，結(jié)果如圖5所示，與常見真菌毒素無明顯的交叉反應，表明本方法檢測CIT具有較好的特異性。

為了評價該方法檢測實際樣本的可行性，將不同質(zhì)量濃度的CIT添加至玉米樣本中，加標量分別為3.5、1.75、0.88、0.22 mg/kg，結(jié)果如表3，F(xiàn)ELISA批內(nèi)回收率分別為97.05%、98.97%、110.58%、90.94%，批間回收率分別為90.10%、109.11%、101.63%、93.46%，且批內(nèi)、批間測定的標準偏差值均小于15%。檢測結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為參考方法進行對比，表4結(jié)果顯示trypsin催化的FELISA檢測結(jié)果與LC-MS/MS結(jié)果具有良好的一致性。以上結(jié)果表明，trypsin催化的FELISA具有良好的回收率和準確性，可對玉米樣本中的CIT進行定量檢測。

圖5 Trypsin催化的FELISA特異性分析
Fig.5 FELISA specific analysis catalyzed by trypsin

表3 Trypsin催化的FELISA檢測不同濃度CIT的 重現(xiàn)性與精密度
Table 3 Reproducibility and precision of FELSA catalyzed by Trypsin in detecting CIT at different concentrations

表4 加標玉米對Trypsin催化的FELISA進行準確度評估
Table 4 Accuracy assessment of Trypsin-catalyzed FELISA by spiked corn

3 結(jié)論

本研究基于trypsin催化羅丹明110雙酰胺熒光底物的特性，結(jié)合CIT和CIT標記的trypsin與CIT抗體的相互競爭作用關系，建立了一種FELISA方法用于檢測玉米中的CIT。在最佳條件下：抗CIT腹水質(zhì)量濃度20 μg/mL、trypsin-CIT質(zhì)量濃度為5.5 μg/mL、pH 6.5、甲醇體積分數(shù)10%、NaCl濃度80 mmol/L、免疫反應時間30 min、酶催化時間30 min，該方法檢測CIT的最低靈敏度可達8.01 ng/mL，IC50可達40 ng/mL，是HRP催化的比色ELISA檢測靈敏度的1.34倍，IC50的2.741倍，此外，該方法具有良好的特異性、重現(xiàn)性和精密度。如果使用CIT的單克隆抗體，檢測靈敏度還可以更高，為更快速、靈敏定量檢測CIT提供了新的選擇。