母乳源乳酸菌的低聚糖利用特性研究

母乳不僅是嬰兒生長發(fā)育所需的最佳營養(yǎng)物質，而且對嬰兒腸道微生物群的構成起著重要的作用[1]。奶粉喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群構成不同于母乳喂養(yǎng)的嬰兒，主要表現為高豐度的腸球菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬等厭氧菌和較少的雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和乳桿菌屬[2-3]；而母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群中雙歧桿菌屬占主導地位，85%的母乳喂養(yǎng)嬰兒的優(yōu)勢微生物是雙歧桿菌，此外還有較少的葡萄球菌屬、鏈球菌屬和乳桿菌屬[4-5]。這一差異與母乳中含有的乳酸菌和豐富的人乳低聚糖[6]有關。人乳低聚糖是一種天然的益生元，對新生兒腸道菌群的形成、發(fā)展和組成起著至關重要的作用[7]。大量研究證實母乳喂養(yǎng)的嬰兒患新生兒壞死性小腸結腸炎、過敏、腹瀉、細菌感染等疾病的幾率遠遠低于奶粉喂養(yǎng)的嬰兒[8-9]。

在配方奶粉中適當添加益生元是目前常用的母乳模擬手段。目前，我國應用最多的是將低聚半乳糖和低聚果糖按照9:1的比例[10]混合加入新生兒配方奶粉，以提供與人乳相當的益生元效果。ABOULOIFA等[11]研究表明，低聚果糖和低聚木糖可以顯著提高分離自傳統發(fā)酵橄欖油的乳酸菌在低pH和0.3%膽鹽環(huán)境的存活率，以及菌株的疏水性和自聚集性。張鵬宇等[12]研究發(fā)現不同低聚糖配伍后可以促進特定乳酸菌的生長。目前有關母乳源乳酸菌利用低聚糖能力的研究較少，因此系統探討不同低聚糖對母乳源乳酸菌生長特性的影響，構建合理的益生菌-低聚糖組合具有廣闊的應用前景。

母乳源乳酸菌是配方奶粉中應用前景廣闊，在配方奶粉中適當添加低聚糖及母乳源益生菌能夠模擬母乳的腸道菌群導向作用。本研究分別以6種低聚糖或其組合作為主要碳源，研究其對母乳源乳酸菌的體外促生長作用，以篩選對母乳源乳酸菌具有生長促進作用的低聚糖，為配方奶粉的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌M48(Lactobacillus paracasei M48)、副干酪乳桿菌M60(L.paracasei M60)、副干酪乳桿菌M64(L.paracasei M64)、副干酪乳桿菌M71(L.paracasei M71)、鼠李糖乳桿菌M53(Lactobacillus rhamnosus M53)、植物乳桿菌M113(Lactobacillus plantarum M113)、短雙歧桿菌grx05(Bifidobacterium brevis grx05)、兩歧雙歧桿菌S16(Bifidobacterium bifidum S16)，由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室分離自湖南地區(qū)健康女性的母乳。

低聚果糖、低聚半乳糖(純度>95%)，量子高科(中國)生物股份有限公司；菊粉、低聚木糖(純度>99%)、水蘇糖(純度>90%)，浙江一諾生物科技有限公司；2′-巖藻糖基乳糖(純度>95%)，德國BASF公司；葡萄糖、胰蛋白胨、無水乙酸鈉、K2HPO4·7H2O、檸檬酸二銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、酵母膏、牛肉膏、吐溫80，國藥集團化學試劑有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，胰蛋白胨 10，無水乙酸鈉 5，K2HPO4·7H2O 2，檸檬酸二銨 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·7H2O 0.05，酵母膏 5，牛肉膏 10，吐溫80 1 mL/L，調節(jié)pH至6.5，121 ℃滅菌15 min后冷卻備用(雙歧桿菌培養(yǎng)基則另外添加莫匹羅星鋰鹽 50 mg/L及半胱氨酸鹽酸鹽500 mg/L)。

低聚糖MRS液體培養(yǎng)基：以低聚糖代替 MRS 培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量為 20 g/L。

1.2 儀器設備

BXP-16恒溫培養(yǎng)箱，上海力辰邦儀器科技有限公司；JF-SX-500型全自動滅菌鍋，日本TOMY公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；PHS-25型酸度計，上海雷磁儀器廠；FP-110-C型全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen公司；1510型酶標儀，美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將用甘油保藏的菌種接種于普通MRS液體培養(yǎng)基中，劃線純化，挑取單菌落并連續(xù)活化3次，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 乳酸桿菌生長曲線的測定

將菌懸液以3%的接種量分別接種于各低聚糖MRS液體培養(yǎng)基中，將接入菌后的液體培養(yǎng)基振蕩均勻后，取200 μL加于培養(yǎng)板中，每種培養(yǎng)基做3個平行，用全自動生長曲線儀記錄菌株的生長情況，直至48 h停止。以普通MRS液體培養(yǎng)基和不添加葡萄糖的MRS培養(yǎng)基為陽性對照和陰性對照。以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度(OD600值)為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 雙歧桿菌生長曲線的測定

將菌懸液以3%的接種量分別接種于各低聚糖MRS液體培養(yǎng)基中，將接入菌后的液體培養(yǎng)基放置厭氧袋中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h取出相應試管，使用酶標儀測定OD600值。以普通MRS液體培養(yǎng)基和不添加葡萄糖的MRS培養(yǎng)基為陽性對照和陰性對照。以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度(OD600值)為縱坐標，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 母乳源乳酸菌的低聚糖利用特性比較

母乳源乳酸菌在添加不同低聚糖MRS液體培養(yǎng)基的生長曲線如圖1所示。4株副干酪乳桿菌M48、M60、M64、M71在以菊粉和低聚果糖為唯一碳源的MRS培養(yǎng)基中的OD600均高于葡萄糖組，其中副干酪乳桿菌M60在低聚半乳糖培養(yǎng)基中的生長速率也高于葡萄糖組(圖1-a～圖1-d)，最大生物量為1.149，高于陽性對照組(表1)，說明副干酪乳桿菌對菊粉及低聚果糖的利用情況普遍較好，部分菌株還可以利用低聚半乳糖，這可能是由于低聚果糖和菊粉都是由β-D-呋喃果糖連接，副干酪乳桿菌的β-果糖苷酶能利用低聚果糖和菊粉[13]。

鼠李糖乳桿菌M53在各種低聚糖培養(yǎng)基中生物量均顯著低于MRS組(圖1-e)，說明鼠李糖乳桿菌M53僅可以較好利用低聚半乳糖，對低聚果糖、菊粉等低聚糖的利用較弱(表1)，這與LANGA等[14]研究結果基本一致。植物乳桿菌M113的整個生長周期中，在低聚果糖及低聚半乳糖培養(yǎng)基中的OD600值均略高于陽性對照組(圖1-f)，說明M113可以較好利用低聚果糖及低聚半乳糖，而陳韞慧等[15]發(fā)現植物乳桿菌AR514對菊粉的利用度最高，說明乳酸菌在利用低聚糖時存在菌株特異性。

2株雙歧桿菌在低聚半乳糖和水蘇糖培養(yǎng)基中的OD600值均高于陽性對照組(圖1-g和圖1-h)，說明它們能很好的利用低聚半乳糖和水蘇糖。盡管低聚木糖被稱為“超強雙歧因子”[16]，但grx05、S16在低聚木糖中的OD600值僅為0.076和0.065，幾乎沒有生長，說明本研究中母乳源不同種的雙歧桿菌對低聚糖的利用情況類似，且與上述文獻中的菌株不同。所有菌株在2′-巖藻糖基乳糖、低聚木糖中的生長曲線和陰性對照組較接近，且OD600值均低于0.300，與其他實驗組及陽性對照組存在顯著性差異(P<0.05)，說明8株母乳源乳酸菌對2’-巖藻糖基乳糖和低聚木糖的利用均較弱。盡管2′-巖藻糖基乳糖能夠調節(jié)嬰兒腸道菌群[17]，本文分離到的母乳源乳酸菌均無法利用2′-巖藻糖基乳糖，說明人乳低聚糖中的成分并非全部能夠促進母乳源乳酸菌的生長，可能存在調節(jié)免疫、黏附等功能[18]。

a-副干酪乳桿菌M48；b-副干酪乳桿菌M60；c-副干酪乳桿菌M64；d-副干酪乳桿菌M71；e-鼠李糖乳桿菌M53； f-植物乳桿菌M113；g-短雙歧桿菌grx05；h-兩歧雙歧桿菌S16
圖1 不同低聚糖作為碳源時母乳源乳酸菌的生長曲線
Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source 注：Control-無葡萄糖；Glucose-葡萄糖；FOS-低聚果糖；GOS-低聚半乳糖；Inulin-菊粉；2′-FL-2′巖藻糖基乳糖； XOS-低聚木糖；Stachyose-水蘇糖(下同)

表1 不同低聚糖作為碳源時母乳源乳酸菌的最大生物量
Table 1 Maximum biomass of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source

注：同一行不同上標字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

由表2可知，副干酪乳桿菌M49、M60、M64、M71在低聚果糖和菊粉培養(yǎng)基中的最大比生長速率均顯著高于MRS組(P<0.05)，說明了4株副干酪乳桿菌對低聚果糖和菊粉的利用速率較高。鼠李糖乳桿菌M53在所有實驗組的最大比生長速率均低于陽性對照組，低聚半乳糖組的最大比生長速率為0.335/h，說明M53對低聚糖利用情況整體較弱，僅在低聚半乳糖中生物活力較強。植物乳桿菌M113在低聚果糖作為發(fā)酵底物時的最大比生長速率提高幅度較大，另外，在以水蘇糖為碳源培養(yǎng)時的最大比生長速率也較高，說明M113對低聚果糖及水蘇糖的利用速率較強，可能是由于M113的β-呋喃果糖苷酶、α-半乳糖苷酶活力較高[19]。2株雙歧桿菌低聚半乳糖組和水蘇糖組的最大比生長速率顯著高于其它實驗組(P<0.05)，其中，兩歧雙歧桿菌S16這2組的最大比生長速率高于陽性對照組，說明雙歧桿菌對低聚半乳糖和水蘇糖的利用較強。

表2 不同低聚糖作為碳源時母乳源乳酸菌的最大比生長速率 單位：h-1

Table 2 Maximum specific growth rate of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source

2.2 非母乳源乳酸菌的低聚糖利用特性比較

為比較母乳源乳酸菌和非母乳來源乳酸菌的低聚糖利用特性，本研究測試了可用于嬰幼兒食品的鼠李糖乳桿菌GG、HN001[20]和長壽老人腸道來源的植物乳桿菌Q58在不同低聚糖培養(yǎng)基中的生長曲線。鼠李糖乳桿菌GG、HN001與鼠李糖乳桿菌M53類似(圖2-a和圖2-b)，都只利用低聚半乳糖，可能是由于鼠李糖乳桿菌是已知產胞外β-半乳糖苷酶的乳桿菌[21]，但HN001對低聚半乳糖的利用顯著高于人源乳酸菌的LGG和M53(P<0.05)，表明不同來源的鼠李糖乳桿菌對低聚半乳糖的利用具有差異性。植物乳桿菌Q58對低聚果糖和低聚半乳糖的利用較強(圖2-c)，與植物乳桿菌M113類似，但是M113在低聚糖環(huán)境下的生長速度和生長量均大于Q58；植物乳桿菌對低聚果糖和低聚半乳糖的利用是否具有廣譜性，需要進一步研究。WATSON等[22]研究了68株人源及動物源乳桿菌和雙歧桿菌對10種碳源的代謝能力，發(fā)現大多數乳桿菌和雙歧桿菌對低聚半乳糖的利用較強，與本實驗研究結果一致。

a-鼠李糖乳桿菌GG；b-鼠李糖乳桿菌HN001；c-植物乳桿菌Q58
圖2 不同低聚糖作為碳源時其他來源乳酸菌的生長曲線
Fig.2 Growth curves of lactic acid bacteria from other sources with different oligosaccharides as carbon source

2.3 低聚果糖/低聚半乳糖組合對乳酸菌生長的影響

為探究不同低聚糖組合是否具有更強的乳酸菌促進作用，將低聚果糖和低聚半乳糖分別以4∶1、3∶2、2∶3和1∶4的質量比例進行配伍后，以20 g/L的添加量加入到無葡萄糖的改良MRS培養(yǎng)基中，并與添加等量低聚果糖、低聚半乳糖和乳糖進行比較，測定副干酪乳桿菌M71、植物乳桿菌M113、鼠李糖乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌HN001的生長情況。

由圖3可知，除鼠李糖乳桿菌HN001可以利用乳糖以外，其余3株菌均不利用乳糖，因此，添加益生元對乳酸菌的生長促進非常必要。在混合低聚糖中，副干酪乳桿菌M71表現出對低聚果糖的選擇性利用，其生物量的增長取決于低聚果糖的含量(圖3-a)；植物乳桿菌M113在達到穩(wěn)定期時6組低聚糖培養(yǎng)基發(fā)酵液OD600值無顯著性差異(P>0.05)(圖3-b)，說明6個組的增殖效果相同，可能是由于M113可以同時利用低聚果糖和低聚半乳糖，因此2種低聚糖的比例變化對其生長情況無明顯影響。鼠李糖乳桿菌GG、HN001的生物量隨低聚半乳糖的比例提升而升高(圖3-c和圖3-d)，在復配培養(yǎng)基中達到穩(wěn)定期時的OD600值均低于只添加低聚半乳糖培養(yǎng)基。實驗結果表明，低聚果糖與低聚半乳糖混合對母乳源乳酸菌的生長沒有疊加的增殖效果。

a-副干酪乳桿菌M71；b-植物乳桿菌M113；c-鼠李糖乳桿菌GG；d-鼠李糖乳桿菌HN001
圖3 乳酸菌在不同比例低聚果糖/低聚半乳糖組合中的生長曲線
Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria in different proportions of fructooligosaccharides/galactooligosaccharides combinations 注：FOS-低聚果糖；GOS-低聚半乳糖；Lactose-乳糖

3 結論

本實驗測試了8株母乳源乳酸菌對低聚半乳糖、低聚果糖、2′-巖藻糖基乳糖、菊粉、低聚木糖、水蘇糖及復配低聚果糖/低聚半乳糖組合的代謝情況。不同菌株表現出不同的低聚糖利用特性，母乳來源的4株副干酪乳桿菌和植物乳桿菌可以較好的利用低聚果糖；植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及雙歧桿菌均能代謝低聚半乳糖；雙歧桿菌可較好的代謝水蘇糖副干酪乳桿菌可利用菊粉且增殖作用明顯；而2′-巖藻糖基乳糖和低聚木糖對母乳源乳酸菌無明顯的生長促進作用。在復配組合中菌株的生長情況由乳酸菌可利用的低聚糖含量決定，低聚果糖與低聚半乳糖混合對母乳源乳酸菌的生長沒有疊加的增殖效果。本研究有助于更加科學地認識低聚糖和母乳來源益生菌之間的關系，為選擇和開發(fā)低聚糖、益生菌以及合生元產品提供一些參考。