益生菌組合物對慢傳輸型便秘的改善作用

慢傳輸型便秘是最常見的便秘類型之一[1]，是由腸道轉(zhuǎn)運時間延長導(dǎo)致的慢性排便困難[2]。藥物和手術(shù)治療均會給患者帶來不同程度的副作用，同時存在復(fù)發(fā)的可能性。使用益生菌制劑治療便秘不易引起不良反應(yīng)，受到越來越多的關(guān)注[3-5]。中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會發(fā)布《益生菌的科學(xué)共識(2020年版)》，指出了益生菌的核心特征之一是保證有足夠的數(shù)量，其功效發(fā)揮具有菌株特異性，益生功能需要在數(shù)量和菌株水平進(jìn)行確認(rèn)。相比使用單一菌株，復(fù)合菌株的人群適用性范圍更廣。

鹽酸洛哌丁胺是慢傳輸型便秘動物模型常用造模藥物[6-7]，其機制是作用于腸壁阿片受體，阻止膽堿和前列腺素釋放，從而抑制腸蠕動，延長腸道內(nèi)容物通過時間，促進(jìn)水、電解質(zhì)等吸收，導(dǎo)致動物腸轉(zhuǎn)運時間延長，糞便數(shù)量、質(zhì)量和含水量減少，出現(xiàn)便秘癥狀[8]。

本研究通過鹽酸洛哌丁胺誘導(dǎo)慢傳輸型便秘動物模型，研究益生菌組合配方在改善慢傳輸型便秘方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

益生菌組合物配方(鼠李糖乳桿菌LR-168、嗜酸乳桿菌LA-99和動物雙歧桿菌BB-115)，仙樂健康科技股份有限公司。

鹽酸洛哌丁胺膠囊，西安楊森制藥有限公司；活性炭粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠胃動素(motilin, MTL)、胃泌素(gastrin, Gas)、P物質(zhì)(substance P, SP)、內(nèi)皮素(endothelin 1, ET-1)、生長抑素(somatostatin, SS)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、腸道緊密連接蛋白、血清D-乳酸、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、干擾素γ(interferon γ, IFN-γ)、白介素2(interleukin 2, IL-2)、白介素4(interleukin 4, IL-4)、白介素6(interleukin6, IL-6)、白介素10(interleukin 10, IL-10)、白介素12(interleukin 12, IL-12)、白介素17(interleukin, IL-17)和抗體(sIgA)ELISA試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；阿拉伯樹膠粉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

墨汁配制方法：稱取阿拉伯膠100 g，與800 mL水混合均勻，加熱煮沸至溶液透明,再加入活性炭50 g，煮沸3次。待溶液冷卻后，用水稀釋定容至1 000 mL，4 ℃保存。

1.1.2 儀器設(shè)備

PB300-N電子天平，Mettler Toledo；Multi-scan Go多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；CFX384實時PCR系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物設(shè)計

6周齡雄性SPF級BABL/c小鼠，北京維通利華公司。實驗方案經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(JN.No20191115b0500110)，并按照歐盟指導(dǎo)方針(2010/63/EU)執(zhí)行。飼養(yǎng)環(huán)境保持在(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，12 h/12 h明暗交替，實驗期間，小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.2.2 模型建立與分組

50只小鼠隨機分成空白組、模型組(鹽酸洛哌丁胺)、陽性對照組(鹽酸洛哌丁胺+動物雙歧桿菌BB-12：5×108 CFU)、低劑量組(鹽酸洛哌丁胺+益生菌組合物：5×108 CFU)、高劑量組(鹽酸洛哌丁胺+益生菌組合物：5×109 CFU)，每組10只。

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)》對通便功能的評價方法，使用鹽酸洛哌丁胺造模便秘模型，通過檢測首粒黑便排出時間判定造模成功與否。小鼠適應(yīng)7 d后開始灌胃，從第8—14天空白組、模型組灌胃0.2 mL生理鹽水，陽性對照組、低劑量組、高劑量組灌胃相應(yīng)的用0.2 mL生理鹽水重懸的菌粉懸液。從第15—21天，模型組、灌菌組灌胃用0.2 mL生理鹽水重懸的鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg bw)，空白組灌胃0.2 mL生理鹽水，1 h后空白組、模型組灌胃0.2 mL生理鹽水，灌菌組灌胃相應(yīng)的用0.2 mL生理鹽水重懸的菌粉懸液。第22天處死小鼠取樣用作后續(xù)實驗。

1.2.3 小鼠首粒黑便時間、黑便粒數(shù)、黑便質(zhì)量及小腸推進(jìn)率的測定

第21天，空白組給予0.2 mL生理鹽水溶液、模型組和灌菌組均給予0.2 mL生理鹽水溶液重懸的鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg bw)，1 h后，各組菌灌胃墨汁，從灌胃墨汁開始，記錄每一只小鼠排首粒黑便的時間、6 h黑便粒數(shù)和黑便質(zhì)量。

第22天空白組給予0.2 mL生理鹽水溶液、模型組和灌菌組均給予0.2 mL生理鹽水溶液重懸的鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg bw)，30 min后，空白組和模型組灌胃墨汁，灌菌組灌胃含各自灌胃內(nèi)容物的墨汁。30 min后處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取腸管，測定小腸總長度L1，墨汁推進(jìn)長度L2，按公式(1)計算小腸推進(jìn)率：

小腸推進(jìn)率/%=L2/L1×100

(1)

1.2.4 小鼠血清、結(jié)腸組織勻漿胃腸調(diào)節(jié)肽的檢測

將收集到的小鼠血液靜置2 h，3 000×g離心15 min后獲得血清，參照試劑盒說明書進(jìn)行實驗，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算中血清中胃腸調(diào)節(jié)肽含量。

用預(yù)冷的PBS沖洗結(jié)腸組織，去除殘留血液，剔除周圍脂肪組織，稱重后將其剪碎。將剪碎的組織與PBS按照料液比1∶9(g∶mL)在組織破碎儀上進(jìn)行破碎，最后5 000×g離心10 min，取上清液檢測胃腸調(diào)節(jié)肽濃度。具體操作參照試劑盒說明書。

1.2.5 小鼠血清細(xì)胞因子的檢測

使用對應(yīng)ELISA試劑盒小鼠血清中細(xì)胞因子含量，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.6 小鼠結(jié)腸組織AQP3和c-kit基因表達(dá)水平檢測

取超低溫冰箱凍存新鮮結(jié)腸組織，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)來測定相關(guān)蛋白的表達(dá)量。嚴(yán)格按說明書用Trizol法提取總RNA，1 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成30 μL cDNA，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。AQP3基因、c-kit基因、actin基因引物序列如表1所示。

表1 AQP3、c-kit和actin引物序列
Table 1 Primer sequences of AQP3, c-kit and actin

根據(jù)反應(yīng)曲線得到各組樣品目的基因和內(nèi)參基因的閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct)，采用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△Ct=Ct Mean目的基因-Ct Mean內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組；實驗組和對照組的基因表達(dá)差異為2-ΔΔCt?？瞻讓φ战M的數(shù)值為1。

以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系共10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共38個循環(huán)。以actin基因為內(nèi)參，CFX96 Manager軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用GraphPad prism8作圖，所有的數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析，應(yīng)用one-way ANOVA進(jìn)行組間比較，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌組合物對小鼠腸道運動和排便情況影響

如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠的腸道轉(zhuǎn)運及排便情況發(fā)生顯著變化(P<0.05)，主要包括小腸推進(jìn)率下降，首粒黑便排出時間延長，6 h黑便排出粒數(shù)減少，黑便質(zhì)量降低。這表明洛哌丁胺造模慢傳輸型便秘成功。與陽性對照組相比，益生菌組合配方低、高劑量在小腸推進(jìn)率、首粒時間、黑便粒數(shù)和黑便質(zhì)量方面沒有統(tǒng)計學(xué)差異。相比模型組，各干預(yù)組(陽性對照組、益生菌組合物低、高劑量組)在腸道運動和排便情況方面得到顯著改善(P<0.05)。益生菌組合物能夠提高腸轉(zhuǎn)運效率，降低排便時間，改善便秘，效果與陽性對照一致。

A-空白組；B-模型組；C-陽性對照組；D-低劑量組；E-高劑量組(以下各圖與此相同) a-小腸推進(jìn)率；b-首粒黑便時間；c-黑便粒數(shù)；d-黑便質(zhì)量
圖1 益生菌組合物配方對洛哌丁胺引起的便秘小鼠腸道排泄影響
Fig.1 Effects of probiotics complex on excretion in loperamide-induced constipation mouse model 注：組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 益生菌組合物對小鼠血清和結(jié)腸組織胃腸調(diào)節(jié)肽的影響

臨床研究表明，胃腸調(diào)劑肽在便秘和正常狀態(tài)下的分泌存在差異，為探究益生菌組合物的作用機制，對其表達(dá)進(jìn)行檢測。血清胃腸調(diào)節(jié)肽含量如圖2所示。

模型組相比空白組在胃腸調(diào)節(jié)肽方面差異顯著(P<0.05)，具體表現(xiàn)為興奮性胃腸調(diào)節(jié)肽(SP、MTL、Gas)在造模后含量下降，抑制性胃腸調(diào)節(jié)肽(VIP、SS、ET-1)造模后含量上升。益生菌組合配方灌胃后，抑制性胃腸調(diào)節(jié)肽(VIP、SS、ET-1)能夠恢復(fù)至空白組水平，低、高劑量無顯著差異。相比模型組，灌胃益生菌組合物配方低、高劑量組的興奮性胃腸調(diào)節(jié)肽(SP、MTL、Gas)含量，表現(xiàn)提升效果，其中血清SP、MTL含量在低劑量組中與空白組無統(tǒng)計學(xué)差異， Gas含量在高劑量組中與空白組無顯著差異。與陽性對照組相比，低劑量組在促進(jìn)SP表達(dá)水平上顯著優(yōu)于陽性對照，而高劑量組在抑制ET-1的表達(dá)水平顯著優(yōu)于陽性對照。

a-SP；b-MTL；c-Gas；d-VIP；e-SS；f-ET-1
圖2 益生菌組合物對洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響
Fig.2 Effects of probiotics complex on gastrointestinal hormones in serum samples of loperamide-induced constipation

結(jié)腸組織胃腸調(diào)節(jié)肽水平如圖3所示，與模型組相比，灌胃益生菌組合物配方后，興奮性胃腸調(diào)節(jié)肽(SP、MTL、Gas)含量顯著上升，抑制性胃腸調(diào)節(jié)肽(VIP、SS、ET-1)含量顯著下降。在促進(jìn)MTL和Gas分泌上，陽性對照比益生菌組合物更有優(yōu)勢，而在抑制SS、ET-1分泌中，益生菌組合物則更具優(yōu)勢。

a-SP；b-MTL；c-Gas；d-VIP；e-SS；f-ET-1
圖3 益生菌組合物對洛哌丁胺引起的便秘小鼠結(jié)腸組織中胃腸調(diào)節(jié)肽的影響
Fig.3 Effects of probiotics complex on gastrointestinal hormones in colon tissues of loperamide-induced constipation mouse

上述結(jié)果表明，益生菌組合物配方通過促進(jìn)興奮性胃腸調(diào)節(jié)肽分泌，同時降低抑制性胃腸調(diào)節(jié)肽產(chǎn)生來緩解洛哌丁胺誘導(dǎo)的慢傳輸型便秘，且血清和結(jié)腸組織的結(jié)果趨勢一致。

2.3 益生菌組合物對小鼠血清細(xì)胞因子的影響

腸道系統(tǒng)與免疫息息相關(guān)，益生菌有調(diào)節(jié)免疫的能力，通過研究細(xì)胞因子水平，能夠進(jìn)一步闡釋益生菌緩解便秘的機制。小鼠血清細(xì)胞因子水平如表2及表3所示，細(xì)胞因子IL-4水平，高劑量組與空白組、陽性對照組之間差異顯著；細(xì)胞因子IL-6水平，模型組與低、高劑量組之間差異顯著，其余各組細(xì)胞因子之間基本無差異。結(jié)果表明灌胃益生菌組合物基本不影響血清細(xì)胞因子水平。

表2 益生菌組合物對洛哌丁胺引起的便秘小鼠細(xì)胞因子的影響
Table 2 Effects of probiotics complex on serum cytokines in a loperamide-induced constipation mouse model

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

表3 益生菌組合物對洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清指標(biāo)的影響
Table 3 Effects of probiotics complex on serum indicators in a loperamide-induced constipation mouse model

2.4 益生菌組合物對小鼠結(jié)腸組織AQP3和c-kit基因表達(dá)量的影響

水通道蛋白AQP3在腸道水轉(zhuǎn)運過程中起到重要作用，Cajal間質(zhì)細(xì)胞(intestinal cells of Cajal，ICC)參與慢傳輸便秘的形成機制，而c-kit是其特異性標(biāo)志物，通過研究AQP3和c-kit的基因表達(dá)水平可以探索益生菌緩解便秘的機制。如圖4所示，與模型組相比，灌菌組顯著提高AQP3和c-kit基因表達(dá)水平(P<0.05)，且結(jié)果與空白組及陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。益生菌組合物低、高劑量無顯著差異。結(jié)果表明益生菌組合物能夠通過恢復(fù)AQP3和c-kit基因的轉(zhuǎn)錄水平來改善便秘。

圖4 益生菌組合物對AQP3和c-kit基因表達(dá)量的影響
Fig.4 Effects of probiotics complex on expression of AQP3 and c-kit in mouse colon

3 結(jié)論與討論

慢傳輸型便秘是功能性便秘的一種，主要癥狀包括排便困難、排便次數(shù)減少、排便時間延長或排便不盡。腸內(nèi)容物的移動主要通過蠕動進(jìn)行[9]，通過測定小腸推進(jìn)率可以了解到腸道蠕動情況，小腸推進(jìn)率越高越有利于糞便的排出[10]。本研究通過鹽酸洛哌丁胺造模便秘小鼠，益生菌組合物干預(yù)后能夠顯著提高小腸推進(jìn)率，首粒黑便時間，黑便粒數(shù)和黑便質(zhì)量，并且低劑量組和高劑量組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

研究表明胃腸調(diào)節(jié)肽SP、MTL、Gas、VIP、SS和ET-1在腸胃運動調(diào)節(jié)中起重要作用，其表達(dá)水平與便秘癥狀密切相關(guān)。其中，SP、MTL和Gas是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，VIP、SS和ET-1是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[11-13]。提高SP、MTL和Gas水平能夠加速腸道蠕動，提高轉(zhuǎn)運率，改善便秘癥狀，而VIP、SS和ET-1是減慢腸轉(zhuǎn)運時間的重要因素，降低其分泌，可以緩解慢傳輸型便秘[14]。本研究中益生菌干預(yù)后能夠顯著提高興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，同時降低抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)。

細(xì)胞因子是由多種組織細(xì)胞(主要為免疫細(xì)胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。細(xì)胞因子能介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化成熟、功能維持、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合和腫瘤消長等[15]。細(xì)胞因子的含量異常會導(dǎo)致各種并發(fā)癥狀的出現(xiàn)[16]。本研究中通過檢測小鼠血清中的細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)各組小鼠細(xì)胞因子水平基本未發(fā)生變化。

ICC相當(dāng)于胃腸道的起搏細(xì)胞，它能產(chǎn)生一種促進(jìn)腸道蠕動的慢波。而c-kit受體在ICC發(fā)育過程中具有十分重要的作用，所以可以通過檢測腸道中c-kit蛋白的表達(dá)量來反映腸道中Cajal細(xì)胞的數(shù)量。已有研究發(fā)現(xiàn)可通過提高胃腸道ICC的c-kit基因表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸的蠕動，緩解便秘癥狀[17]。水通道蛋白是一種細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出。水通道蛋白有許多的亞家族，其中AQP3基因在小鼠結(jié)腸中高表達(dá)[18]。研究表明，腹瀉和便秘患者水通道蛋白的表達(dá)水平均存在異常[19]。本研究中鹽酸洛哌丁胺造模會導(dǎo)致c-kit和AQP3的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于空白組，而灌胃益生菌組合物后能恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明益生菌組合物可能通過提高c-kit和AQP3轉(zhuǎn)錄水平緩解便秘，與前人研究相符[20]。

綜上所述，表明益生菌組合物能夠通過促進(jìn)SP、MTL和Gas的分泌，抑制VIP、SS和ET-1的表達(dá)，調(diào)控AQP3和c-kit的基因轉(zhuǎn)錄，從而改善慢傳輸型便秘。