海洋源降解核苷乳酸菌的體外篩選、鑒定及其益生特性研究

肉類、海鮮等高嘌呤食物大量進(jìn)入到國民的餐桌，導(dǎo)致高尿酸患病率逐年上升[1]。據(jù)2017年中國痛風(fēng)現(xiàn)狀白皮書顯示，我國的高尿酸發(fā)病率達(dá)到13.3%，患者多達(dá)1.7億，痛風(fēng)患者也達(dá)到了8 000萬人，高尿酸患者已超過糖尿病患者，引起大眾的關(guān)注[2]。高尿酸血癥常引起心血管疾病、非酒精性脂肪肝、高血壓、高血脂等并發(fā)疾病[3-5]。高尿酸血癥發(fā)生的原因一是人體嘌呤代謝酶表達(dá)異常引發(fā)的內(nèi)源性堆積，如磷酸核糖焦磷酸合成酶活性增高，導(dǎo)致尿酸生成速率變高引起的內(nèi)源性堆積；二是攝入過多海鮮、動(dòng)物內(nèi)臟、肉類等富含嘌呤的食物[6]，當(dāng)富含高嘌呤核苷食物進(jìn)入腸道后，在酶的作用下，轉(zhuǎn)化成核苷進(jìn)入血液，并在肝臟代謝成尿酸，最終形成高尿酸血癥[7]。目前，治療高尿酸血癥的藥物主要是別嘌醇、非布司他、丙磺舒和苯溴馬隆[8]。但是，這些藥物會(huì)引起患者如皮疹、肝損害等不良反應(yīng)[9]。因此，尋求安全有效的控制措施成為近些年的研究熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌可以降解腸道中的核苷成為不易被吸收的嘌呤堿基，并直接排出體外，從而避免了腸道對(duì)核苷的吸收，減少了肝臟轉(zhuǎn)化形成尿酸的機(jī)會(huì)[10-11]。而具有益生作用的乳酸菌被發(fā)現(xiàn)在改善腸道功能、降血壓、治療Ⅱ型糖尿病、抗氧化、降血尿酸等方面有較好的作用[12]。同時(shí)在高尿酸人群中發(fā)現(xiàn)其腸道菌群紊亂，嘌呤代謝也異常，并且乳桿菌豐度減少[13]，所以乳酸菌在治療高尿酸血癥的應(yīng)用上有著巨大潛力。日本學(xué)者利用格氏乳桿菌輔助治療高尿酸血癥取得較好的效果，該菌制備了供高尿酸患者使用的酸奶[14]，相關(guān)的研究成果也申請(qǐng)了專利[15]。XIAO等[16]從18種泡菜中分離到高效降解核苷的乳酸菌，并證實(shí)其具有降低大鼠尿酸水平的能力。通過定植在腸道中的乳酸菌，分解食物中的核苷，降低血尿酸水平已成為防治高尿酸血癥的重要策略。

本研究從15種海洋動(dòng)物腸道中分離出2株具有高效降解核苷的乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過溶血性、抗生素敏感性、抗氧化性、模擬人工胃腸液耐受性實(shí)驗(yàn)，對(duì)乳酸菌的定植能力及安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為開發(fā)具有降解核苷益生作用乳酸菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分離材料：海星、方格星蟲、金倉魚、鯆魚、石斑魚、小黃魚、馬鮫魚、彈涂魚、銀鯧魚、墨魚、方斑東風(fēng)螺、牡蠣、華貴櫛、菲律賓簾蛤、南美白對(duì)蝦，捕撈自廣東湛江海域；肌苷、鳥苷、腺苷(HPLC級(jí))，成都埃法科技有限公司；甲醇、MRS培養(yǎng)基、血平板、胰酶、牛膽鹽、血平板、金黃色葡萄球菌ATCC 6538，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；卡那霉素、紅霉素、鹽酸四環(huán)素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氨芐霉素，麥克林公司；胃蛋白酶，Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH)、鄰二氮菲，北京索萊寶科技有限公司；16S rDNA細(xì)菌通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A液相色譜儀，日本島津有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型單人雙面超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DG250厭氧工作站，廣州市華粵行儀器有限公司；PCR儀，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；2-16KL臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核苷降解菌的篩選

海洋動(dòng)物采集后用無菌生理鹽水清洗3次，并用滅菌的剪刀取各類海洋動(dòng)物腸道10 g至裝有90 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中，于均質(zhì)器中拍打均勻，并吸取0.1 mL適當(dāng)稀釋濃度的混懸液涂布于MRS固體平板上，37 ℃培養(yǎng)，利用菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果除去重復(fù)菌株。將獲得的目標(biāo)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃中靜置培養(yǎng)24 h，獲得種子培養(yǎng)液，再經(jīng)過3次接種傳代后，按1%接種量接種于MRS肉湯中，按照TSUBOI等[17]方法取2 mL培養(yǎng)液，于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體，再用1 mL PBS(pH 7.2～7.4)重復(fù)洗滌菌體3次。向洗滌干凈沉淀的菌體中加入750 μL核苷緩沖液(1.26 mmol/L肌苷，1.26 mmol/L鳥苷，1.26 mmol/L腺苷，10 mmol/L中性磷酸鉀緩沖液，pH 7.2～7.4)，重懸菌體后，置于振蕩培養(yǎng)箱，在37 ℃，180 r/min條件下反應(yīng)1 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取450 μL上清液與50 μL終止劑高氯酸溶液(0.1 mol/L)混合均勻，終止反應(yīng)[18]。以不加菌體的核苷緩沖液為空白對(duì)照，通過HPLC測(cè)定上清液中肌苷、鳥苷和腺苷的濃度，分析核苷的降解率，計(jì)算如公式(1)所示。色譜條件：液相色譜儀LC-20A；反向色譜柱為Agilent-C18(4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為V(純水)∶V(色譜級(jí)甲醇)=90∶10；流速1 mL/min，測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃。所有進(jìn)入HPLC的溶液需使用0.22 μm孔徑的無菌過濾器過濾。

降解率

(1)

式中：ρ空白，不加菌體核苷緩沖液各核苷的質(zhì)量濃度；ρ實(shí)驗(yàn)，乳酸菌與核苷培養(yǎng)基共培養(yǎng)后各核苷的質(zhì)量濃度。

1.3.2 菌株的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

分別以27F、1492R為正、反向引物，使用MightAmp DNA聚合酶對(duì)候選菌株進(jìn)行菌落PCR，PCR體系按照LU等[19]方法。PCR的體系為30 μL：挑取少量待測(cè)單菌落作為模板，2×Mighty Ampbuffer 15 μL，MightyAmp DNA聚合酶0.75 μL，27F(10 μmol/μL)0.75 μL，1492R(10 μmol/μL)0.75 μL，雙蒸水12.75 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min；4 ℃保存10 min。取4 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，判斷其分子質(zhì)量。將符合要求的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)測(cè)得的16S rRNA基因序列，從EzBioCloud(EzTaxon)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索，下載相似性高的模式菌株的16S rRNA基因序列，利用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.3 菌株溶血活性測(cè)定

將候選菌株點(diǎn)種于血平板上，同時(shí)，以點(diǎn)種金黃色葡萄球菌ATCC 6538作陽性對(duì)照，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察溶血圈出現(xiàn)情況，判斷候選菌株是否具有溶血性。

1.3.4 菌株抗生素敏感性的測(cè)定

候選菌株的抗生素敏感性測(cè)定方法采用歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committeeon Antimicrobial Suseeptibility Testing, EUCAST, http://www.eucast.org)推薦的二倍肉湯稀釋法測(cè)定不同抗生素對(duì)2株候選菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。將卡那霉素、紅霉素、鹽酸四環(huán)素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氨芐霉素作為敏感性指示抗生素添加到MRS肉湯中，調(diào)整質(zhì)量濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL，以不含有抗生素的肉湯作空白對(duì)照，在OD600下測(cè)定候選菌株生長(zhǎng)情況，菌株明顯被抑制住生長(zhǎng)的抗生素濃度為該抗生素對(duì)菌株的MIC值。根據(jù)歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)在2012年對(duì)于EUCAST標(biāo)準(zhǔn)新調(diào)整的指南，判斷候選菌株的抗生素敏感性[20]。

1.3.5 菌株抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 菌株對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱取DPPH溶于無水乙醇中，使其濃度為0.2 mmol/L，存放于棕色瓶中，避光，將100 μL DPPH溶液置于試管中，加入100 μL菌株胞外上清液，振蕩混勻，室溫避光放置30 min 后，在517 nm 處測(cè)其吸光值(Ai)；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液(Aj)，對(duì)照組為等體積的無菌水代替樣品溶液(Ac)，菌株對(duì)DPPH自由基清除能力計(jì)算如公式(2)所示：

DPPH清除率

(2)

1.3.5.2 菌株對(duì)·OH清除能力測(cè)定

取30 μL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液，依此加入60 μL 0.2 mol/L PBS(pH 7.4)和30 μL 0.75 mmol/L的FeSO4，在該混合液中加入30 μL樣品溶液，最后加入30 μL 0.01%(體積分?jǐn)?shù))H2O2，37 ℃水浴60 min，分光光度計(jì)于536 nm處測(cè)吸光度Ay，同樣操作，30 μL蒸餾水+30 μL樣品得到空白吸光度Ab，30 μL 蒸餾水+30 μL 0.01%(體積分?jǐn)?shù))H2O2得到對(duì)照吸光度A0，·OH清除率計(jì)算如公式(3)所示：

·OH清除率

(3)

1.3.6 菌株在人工胃腸液存活率的測(cè)定

人工胃液的配制：將PBS (pH 7.2～7.4)緩沖液用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為3.0，加入胃蛋白酶(3 g/L)溶解后用0.22 μm的無菌濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。人工腸液的配制：用0.1 mol/L NaOH溶液將PBS(pH 7.4)緩沖液的pH調(diào)至8.0，加入1 g/L的胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的牛膽鹽，溶解后用0.22 μm的無菌濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用[21]。

將乳酸菌接種活化3代后，以1%接種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS(pH 7.2～7.4)洗滌菌體3次，再調(diào)整菌體濃度至109 CFU/mL。取1 mL PBS重懸的乳酸菌菌體加入到5 mL的模擬胃液中，同時(shí)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%NaCl 1.5 mL，混勻，迅速放入37 ℃培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)0 h，活菌數(shù)記為N0和培養(yǎng)3 h，活菌數(shù)記為N3，取1 mL胃液中處理3 h的菌液，加入9 mL模擬腸液中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，于4 h后測(cè)活菌數(shù)，記為N7。

以無菌生理鹽水按1∶10梯度稀釋，進(jìn)行乳酸菌活菌計(jì)數(shù)，并按公式(4)(5)計(jì)算不同乳酸菌株在模擬胃腸液轉(zhuǎn)運(yùn)后的存活率。

胃液中存活率

(4)

轉(zhuǎn)運(yùn)腸液后存活率

(5)

1.3.7 菌株在飽腹的人工腸液中對(duì)核苷降解能力的測(cè)定

人工腸液配制與1.3.6一致，再將阿拉伯半乳糖、膠質(zhì)、木聚糖、土豆淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、粘蛋白、L-半胱氨酸添加至人工腸液中，至最終質(zhì)量濃度為1、2、1、3、0.4、3、1、4、0.5 g/L，同時(shí)添加肌苷-鳥苷-腺苷至最終濃度分別為1.26 mmol/L[22]。離心2 mL菌體，將菌體重懸于750 μL含有核苷的人工飽腹腸液中，共培養(yǎng)于振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃、180 r/min)中60 min，終止反應(yīng)后，以不加菌體的人工飽腹腸液作為空白對(duì)照，以添加菌體的人工飽腹腸液作為實(shí)驗(yàn)組，取20 μL上清液進(jìn)行降解率測(cè)定，方法與1.3.1相同，計(jì)算如公式(6)所示：

降解率

(6)

式中：ρ空白，不加菌體人工腸液中各核苷的質(zhì)量濃度；ρ實(shí)驗(yàn)，乳酸菌與含有核苷的人工腸液反應(yīng)后各核苷的質(zhì)量濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均平行測(cè)3次，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的表示，采用Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 高效降解核苷乳酸菌的篩選

以肌苷、鳥苷、腺苷3種核苷作為降解底物，采用HPLC法對(duì)海星等15種海洋動(dòng)物腸道中分離得到的乳酸菌降解核苷的能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1，從海星腸道中分離到的30株乳酸菌對(duì)3種核苷均表現(xiàn)出不同程度的降解能力，其中菌株L3、2Y-15與BX-59對(duì)3種核苷的降解率均在50%以上，表現(xiàn)出高效的核苷降解能力。在流動(dòng)相為V(純水)∶V(色譜級(jí)甲醇)=90∶10條件下，3種核苷能較好地分離，且峰形尖銳，無拖尾。肌苷、鳥苷、腺苷出峰時(shí)間為7.631、8.47、19.097 min(圖1-a)，而菌株2Y-15與BX-59與核苷緩沖液共培養(yǎng)60 min后經(jīng)相同液相條件測(cè)定，均未在7.631、8.47、19.097 min出現(xiàn)核苷特征峰(圖1-b、圖1-c)，說明菌體與核苷緩沖液共培養(yǎng)后降解了核苷底物，而且除BX-59對(duì)鳥苷的降解率為99.84%外，2株菌株對(duì)3種核苷降解率均達(dá)到100%。牛春華等[23]篩選到已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上證實(shí)其具有降尿酸效果的植物乳桿菌，其在60 min下對(duì)肌苷與鳥苷的降解率分別為57%與60%。本研究篩選的菌株2Y-15與BX-59與陳沈梁等[24]篩選獲得的短乳桿菌對(duì)肌苷、鳥苷的降解率較相近，分別為98.07%、96.10%。目前報(bào)道的降解核苷酸的乳酸菌主要是針對(duì)肌苷和鳥苷這2種核苷，而菌株2Y-15與BX-59同時(shí)對(duì)肌苷、鳥苷、腺苷3種核苷均具有較高的降解率。利用乳酸菌預(yù)防或輔助治療高尿酸血癥主要是通過降解腸道中的核苷，金方等[18]認(rèn)為干酪乳桿菌通過降解核苷、核苷酸，減少腸道對(duì)核苷、核苷酸的吸收，從而降低大鼠的尿酸。KANO等[25]也發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌PA-3可以減少腸道對(duì)核苷、核苷酸的吸收，達(dá)到降低尿酸的效果。因此，乳酸菌能否有效降解腸道中的核苷，是利用乳酸菌預(yù)防或輔助治療高尿酸血癥的關(guān)鍵。

表1 分離菌株對(duì)核苷的降解率 單位：%

Table 1 The degradation rate of nucleosides by candidate strains

a-空白組；b-菌株BX-59；c-菌株ZY-15
圖1 候選菌株降解核苷液相圖
Fig.1 The liquid phase diagram of nucleoside degradation by candidate strains

2.2 菌株鑒定

菌株2Y-15與BX-59的序列堿基長(zhǎng)度分別為1 475與1 478 bp，兩菌株的16S rDNA序列比對(duì)相似性為98%，在EZbiocloud數(shù)據(jù)庫中對(duì)2株乳酸菌的16S rDNA基因序列與已報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行相似性比對(duì)，相似性最高的模式菌株均為Limosilactobacillus fermentum CECT562，相似率均為98.78%，而菌株2Y-15、菌株BX-59與相似性第2的Limosilactobacillus gorillae相似性分別為97.21%、97.01%。從EZbiocloud數(shù)據(jù)庫收集相似性高的不同種屬菌株的16S rDNA序列，并與菌株BX-59、2Y-15的16S rDNA一起使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖2可知，菌株2Y-15、菌株BX-59與Limosilactobacillus fermentum CECT562位于同一簇群，結(jié)合相似率鑒定菌株2Y-15與BX-59均為發(fā)酵粘液乳桿菌(Limosilactobacillus fermentum)。

圖2 兩株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic tree of 2 strains of lactic acid bacteria

2.3 菌株的溶血活性

利用血平板實(shí)驗(yàn)對(duì)2株具有降解核苷的乳酸菌進(jìn)行溶血性評(píng)價(jià)，從圖3可知，2個(gè)血平板上的金黃色葡萄球菌ATCC 6538陽性對(duì)照組均出現(xiàn)了明顯的溶血圈，而點(diǎn)種在血平板上的菌株BX-59與2Y-15均未出現(xiàn)溶血圈，表明這2株乳酸菌不具有溶血毒性。溶血性細(xì)菌對(duì)人體具有嚴(yán)重的危害，聯(lián)合國糧農(nóng)組織對(duì)應(yīng)用于食品中的益生菌明確要求不能有溶血毒性[26]。大多數(shù)的乳酸菌不具有溶血性，但ARGYRI[27]從發(fā)酵橄欖中分離出73株乳酸菌，并發(fā)現(xiàn)4株戊糖乳桿菌具有α-溶血性，因此，溶血性也成為體外篩選對(duì)人體無害益生菌的必要檢測(cè)指標(biāo)。

a-左側(cè)為金黃色葡萄球菌，右側(cè)為菌株BX-59； b-左側(cè)為金黃色葡萄球菌，右側(cè)為菌株2Y-15
圖3 菌株BX-59與2Y-15的溶血活性
Fig.3 Hemolytic activity of strains BX-59 and 2Y-15

2.4 菌株的抗生素敏感性

聯(lián)合國糧農(nóng)組織要求作為益生菌應(yīng)不具有可轉(zhuǎn)移的耐藥性[26]，但目前，已有報(bào)道從保健食品益生菌制劑中分離到具有耐藥性的乳酸菌，這些乳酸菌可能將攜帶的耐藥基因轉(zhuǎn)移到腸道的致病菌中，致使病菌出現(xiàn)耐藥性，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的危害[28]。因此，乳酸菌的耐藥性帶來的安全問題也引起人們的關(guān)注[29]。目前，評(píng)估菌株抗生素敏感性的有效方法是采用MIC[20]，本研究對(duì)7種抗生素敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)2株菌除對(duì)卡那霉素及菌株2Y-15對(duì)鏈霉素的MIC剛好達(dá)到歐洲食品安全局給出的指南臨界值[20](64 μg/mL)外，對(duì)其他抗生素均低于臨界值。雖然有報(bào)道認(rèn)為有些乳酸菌對(duì)卡那霉素、鏈霉素等氨基糖苷類藥物具有抗性，但不具有轉(zhuǎn)移基因的特性[30]。而具有抗性的同時(shí)，是否具有轉(zhuǎn)移基因的特性需要單獨(dú)分析該種種內(nèi)相關(guān)基因的進(jìn)化情況和攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性，確保安全問題后續(xù)可進(jìn)一步結(jié)合耐藥基因檢測(cè)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。綜合分析，本研究2株菌株具有一定的耐藥性，2株降解核苷的發(fā)酵粘液乳桿菌具有益生菌產(chǎn)品開發(fā)及功能應(yīng)用的潛力。

表2 菌株BX-59與2Y-15對(duì)7種抗生素的敏感性
Table 2 Sensitivity of strains BX-59 and 2Y-15 to 7 antibiotics

2.5 菌株抗氧化活性測(cè)定

有研究發(fā)現(xiàn)，血尿酸濃度的過度升高，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致體內(nèi)的抗氧化能力降低[31-32]。因此，降尿酸同時(shí)具備抗氧化作用已成為目前藥物篩選的另一個(gè)熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)2株具有降解核苷的發(fā)酵粘液乳桿菌抗氧化特性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株BX-59與2Y-15對(duì)DPPH自由基與·OH均具有良好的清除能力(圖4)，其中對(duì)DPPH自由基的清除率分別為61.05%和58.36%，對(duì)·OH的清除率分別為57.84%和61.12%，推測(cè)具有降尿酸功能的2株乳桿菌對(duì)高尿酸造成的氧化損傷具有潛在的抗氧化保護(hù)益生作用。

圖4 菌株BX-59與2Y-15體外抗氧化能力
Fig.4 Antioxidant capacity of strains BX-59 and 2Y-15 in vitro

2.6 菌株在人工胃腸液的存活率

乳酸菌經(jīng)口服后，先需要抵抗3 h胃酸和胃蛋白酶的作用，隨后乳酸菌與食物經(jīng)胃部排空后進(jìn)入腸道，再繼續(xù)耐受腸道中膽鹽和消化酶的脅迫，存活下來的才能有效定植于腸道，并發(fā)揮其益生功能。本研究從海洋動(dòng)物腸道中分離出的2株具有降解核苷的乳酸菌在人工胃腸液模擬環(huán)境存活情況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從圖5可以看出，菌株BX-59與菌株2Y-15經(jīng)過3 h的人工胃液作用后均表現(xiàn)出較強(qiáng)的存活能力，通過活菌數(shù)和公式(4)得出存活率分別為98.7%與99.8%，表明乳酸菌在人工胃液中有較強(qiáng)的耐受性。經(jīng)過3 h人工胃液培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)運(yùn)至人工腸液培養(yǎng)4 h，存活率均出現(xiàn)了下降，菌株BX-59與2Y-15下降率分別為20%與36%，說明腸道中的膽鹽和消化酶對(duì)2株菌存活率影響顯著(P<0.05)，但活菌數(shù)均在1×105 CFU/mL以上。HSIEH等[33]在釀酒副產(chǎn)物中分離出可降解核苷的乳酸菌，對(duì)胃液中的低酸環(huán)境和腸道中的膽鹽環(huán)境有相似的耐受力。肖源勛等[34]從傳統(tǒng)泡菜中分離篩選出具有降解60%肌苷和降解50%鳥苷的酪乳桿菌，經(jīng)過測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)酪乳桿菌可耐受胃蛋白酶、pH 3的低酸環(huán)境、膽鹽和胰蛋白酶環(huán)境，并且對(duì)其進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具有降尿酸功能。益生菌能夠在胃酸、胃蛋白酶的胃部環(huán)境和膽鹽、胰酶的腸道環(huán)境脅迫下存活，才能夠發(fā)揮其對(duì)宿主的益生特性，因此益生菌的篩選需在體外模擬胃腸液環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)后具有高存活率顯得尤為重要[35]。

圖5 人工模擬胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)條件下菌株BX-59 與2Y-15的耐受性
Fig.5 The tolerance of strains BX-59 and 2Y-15 in simulated gastrointestinal transport conditions

2.7 菌株在飽腹人工腸液中對(duì)核苷的降解能力

核苷是由食物中的核蛋白經(jīng)過各種酶的作用轉(zhuǎn)化來的，腸道對(duì)核苷有較強(qiáng)的吸收能力，并轉(zhuǎn)化為尿酸導(dǎo)致高尿酸癥。而乳酸菌經(jīng)口服后，最終定植于腸道中，可以降低腸道對(duì)核苷的吸收[36]。本研究通過模擬人體進(jìn)食后的飽腹?fàn)顟B(tài)，探究2株乳酸菌在飽腹人工腸液中對(duì)核苷的降解能力。從表3可知，2株菌對(duì)3種核苷均有不同程度的降解，其中菌株2Y-15在模擬人工飽腹腸液降解率明顯優(yōu)于菌株BX-59，并對(duì)肌苷與腺苷的降解率為100%，對(duì)鳥苷也達(dá)到了98.60%。雖然菌株2Y-15在人工胃腸液模擬環(huán)境存活率僅為64%，但存活下來的菌依然能有效地降解3種核苷。而菌株BX-59在人工胃腸液模擬環(huán)境存活率達(dá)到了80%，但對(duì)肌苷、鳥苷、腺苷降解率僅有60.78%、51.34%與59.00%，與XIAO等[16]篩選出的具有降尿酸乳酸菌在核苷緩沖液環(huán)境中對(duì)肌苷、鳥苷降解率相近(60%左右)，發(fā)酵粘液乳桿菌2Y-15在飽腹腸液環(huán)境中較菌株BX-59表現(xiàn)出更優(yōu)秀的核苷降解能力，腸液的膽鹽環(huán)境導(dǎo)致活菌數(shù)減少，在應(yīng)用方面可以通過加大活菌數(shù)保證其短時(shí)間降解核苷的功能性。

表3 飽腹腸液條件下菌株BX-59與2Y-15 對(duì)核苷的降解率 單位：%

Table 3 Degradation rates of nucleosides by strains BX-59 and 2Y-15 under saturating intestinal fluid conditions

3 結(jié)論

本研究從海洋動(dòng)物腸道中分離到菌株BX-59與2Y-15，經(jīng)鑒定均為發(fā)酵粘液乳桿菌(Limosilactobacillus fermentum)，且2株菌株均無溶血性、對(duì)氯霉素、紅霉素、氨芐等抗生素敏感，同時(shí)具備良好的抗氧化活性以及較好的耐受人工胃腸液環(huán)境能力，并且在飽腹的人工腸液中，保持著較高的核苷降解率，具有開發(fā)成益生菌制劑的潛能。本研究對(duì)具有降解核苷功能的2株乳酸菌進(jìn)行了益生特性和體外安全性的評(píng)價(jià)，但其在復(fù)雜腸道環(huán)境中是否發(fā)揮其潛在的降尿酸功能和對(duì)機(jī)體的安全性還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前研究中，乳酸菌在人體腸道中定植后可減少腸道吸收過多核苷以減少血液中尿酸水平，所以本研究中所分離篩選的2株乳酸菌具有用于開發(fā)高尿酸血癥防治微生態(tài)菌劑的潛能。