醬油渣源副干酪乳桿菌體外安全性評(píng)價(jià)

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品，據(jù)智研咨詢發(fā)布的《2021—2027年中國(guó)醬油行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)預(yù)測(cè)報(bào)告》中報(bào)道，2020年中國(guó)醬油產(chǎn)量達(dá)700.8萬(wàn)t。醬油渣是醬油釀造過(guò)程中的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 kg醬油產(chǎn)生含水約75%的醬油渣0.67 kg[1]，即每年產(chǎn)生的醬油渣會(huì)超過(guò)469萬(wàn)t，而醬油渣中含有20%～30%的粗蛋白，23%左右的粗纖維，10%以上的碳水化合物等，若處理不當(dāng)是資源的巨大浪費(fèi)，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染。因此，對(duì)醬油渣的處理及利用是醬油工業(yè)發(fā)展中急需解決的問(wèn)題之一。近年來(lái)，醬油渣的開發(fā)和應(yīng)用較多，如用作動(dòng)物飼料、制備生物絮凝劑、提取生物活性化合物等，也有通過(guò)接種特定微生物，再次發(fā)酵醬油渣，以有效降解原料中潛在有害物質(zhì)，且轉(zhuǎn)化大量基質(zhì)為有用產(chǎn)品，進(jìn)而改善醬油渣品質(zhì)的研究[2]。

副干酪乳桿菌是乳桿菌屬中的干酪乳桿菌群，廣泛存在于發(fā)酵食品和人的口腔及腸道內(nèi)，在食品、醫(yī)療保健領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，特別是其作為商業(yè)發(fā)酵劑具有良好的發(fā)酵特性和研究?jī)r(jià)值[3]。如：POVEDA等[4]利用副干酪乳桿菌發(fā)酵奶酪，可促使奶酪中游離脂肪酸和醇類物質(zhì)增加，風(fēng)味有明顯提升。也有研究認(rèn)為，部分副干酪乳桿菌具有一定致病性，能引起敗血癥、心內(nèi)膜炎和局部感染等疾病[5]。由此可見，若副干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑使用于食品，則對(duì)其進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)與研究尤為必要。

本實(shí)驗(yàn)室前期從醬油渣中分離鑒定得到6株副干酪乳桿菌，這些菌株具有良好的生長(zhǎng)及抗氧化特性[6-7]，但尚不了解其生物安全性。因此，本研究擬通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)等，對(duì)已分離得到的上述6株菌的體外生物安全性進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以充分挖掘利用醬油渣中的副干酪乳桿菌資源，以期為減少醬油渣資源浪費(fèi)、再次應(yīng)用于醬油渣發(fā)酵或飼料生產(chǎn)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：副干酪乳桿菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159、HT197，均為本實(shí)驗(yàn)室前期從醬油渣中分離得到。標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923，南京茂捷微生物科技有限公司，大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC 25922，上海魯傲科技有限公司。

質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司；哥倫比亞血平板、氨基酸脫羧酶對(duì)照生化鑒定管、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶生化管、鳥氨酸脫羧酶生化管、靛基質(zhì)試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片(青霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素)，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104電子分析天平，梅特勒-托利多精密儀器公司；ALLEGRA-64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；721BR 16103凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Bio-Rad 公司；GR60DA全自動(dòng)滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DYY-7C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；428830數(shù)顯式游標(biāo)卡尺，寧波長(zhǎng)城精工實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 副干酪乳桿菌菌液的制備

將6株副干酪乳桿菌接種于預(yù)先配制好并滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化3代后待用。

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[8]和[9]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。使用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。使用的藥敏紙片種類為青霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素，共計(jì)7種。將活化至3代的副干酪乳桿菌用無(wú)菌生理鹽水稀釋，涂布于MRS培養(yǎng)基，靜置5 min后將相應(yīng)的藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基貼2種藥敏紙片，每種藥敏紙片設(shè)3組平行，并以S. aureus ATCC 25923作為質(zhì)控菌株。用游標(biāo)卡尺測(cè)量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)價(jià)菌株對(duì)抗生素的敏感度(表1)。

表1 藥敏實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]
Table 1 Criteria for drug sensitivity test

注：S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥

1.3.3 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。取2 mL活化3代后的副干酪乳桿菌菌液，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。吸取2.5 μL的質(zhì)粒提取液加入0.5 μL 6×Loading Buffer，吹打均勻，吸取混合物3 μL點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠孔道中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行觀察和分析，以含有pET28a的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4 溶血實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[12]和[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。在無(wú)菌條件下，將活化3代后的副干酪乳桿菌菌液用滅菌的接種環(huán)劃線于哥倫比亞血瓊脂平板中，培養(yǎng)后觀察有無(wú)溶血圈出現(xiàn)，同時(shí)用S. aureus ATCC 25923作為陽(yáng)性對(duì)照菌株。若菌落周圍的瓊脂為棕綠色，為α-溶血；若在菌落周圍形成透明圈，為β-溶血；若對(duì)溶血無(wú)作用，為γ-溶血。

1.3.5 吲哚實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。將活化3代后的副干酪乳桿菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)基中滴加5～8滴靛基質(zhì)試劑并輕搖試管，觀察液面顏色變化。若液面呈現(xiàn)紅色，則為陽(yáng)性，否則為陰性。以E. coli ATCC 25922為陽(yáng)性對(duì)照菌株，未接種的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3.6 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。將活化3代后的副干酪乳桿菌接種于精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)管和氨基酸脫羧酶對(duì)照管中，滴加無(wú)菌液體石蠟封口，于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察管內(nèi)顏色。若賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管均呈黃色則為陰性，實(shí)驗(yàn)管呈黃綠色且對(duì)照管呈黃色則為陽(yáng)性；若精氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管均呈黃色則為陰性，實(shí)驗(yàn)管變藍(lán)綠色且對(duì)照管變黃為陽(yáng)性。以E. coli ATCC 25922為陽(yáng)性對(duì)照菌株。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0中一般線性模型的單變量分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和差異顯著性分析，數(shù)據(jù)的表示方式為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±SD；n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥性檢測(cè)與分析

2.1.1 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

抗生素耐藥性檢測(cè)是乳酸菌安全性評(píng)價(jià)較為重要的部分。有部分學(xué)者認(rèn)為，乳酸菌具有一定的耐藥性會(huì)產(chǎn)生積極的影響，表現(xiàn)在當(dāng)人或動(dòng)物使用抗生素治療時(shí)可以避免菌體自身被殺滅，同時(shí)可幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[14]。但當(dāng)乳酸菌具有潛在致病性時(shí)，一旦成為致病原，它們所具有的耐藥性則會(huì)給治療帶來(lái)麻煩，這也是微生物抗生素耐藥性成為全球化問(wèn)題的原因之一。

藥敏實(shí)驗(yàn)的抑菌圈直徑及結(jié)果如表2所示。根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)可知，對(duì)照菌株金黃色葡萄球菌對(duì)7種抗生素敏感；6株副干酪乳桿菌對(duì)青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明不敏感；HT111對(duì)環(huán)丙沙星敏感，其他菌株對(duì)環(huán)丙沙星中度敏感。董春陽(yáng)[9]進(jìn)行的3株副干酪乳桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，所有菌均對(duì)青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、紅霉素敏感，對(duì)慶大霉素不敏感，綜合兩項(xiàng)研究，一致的結(jié)果是，副干酪乳桿菌對(duì)青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對(duì)慶大霉素不敏感，原因可能是青霉素、頭孢噻吩可以抑制副干酪乳桿菌細(xì)胞壁合成酶的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞細(xì)胞壁，引起溶菌，使細(xì)菌裂解死亡[15]；氯霉素、紅霉素則可通過(guò)終止50S亞基與肽?；?tRNA的結(jié)合來(lái)阻斷肽鏈的延伸，從而抑制細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[16]；大多數(shù)乳桿菌普遍對(duì)氨基糖苷類抗生素(如慶大霉素)不敏感，可能是因?yàn)楦备衫胰闂U菌可以產(chǎn)生某種酶使抗生素分子滅活或鈍化從而抗藥，或副干酪乳桿菌能夠增加抗生素外排轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量和改變細(xì)胞膜通透性[17]。

6株副干酪乳桿菌對(duì)同一種抗生素敏感性有所差異，如表2所示。6株副干酪乳桿菌對(duì)青霉素、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素的耐藥性均呈顯著差異(P<0.05)，對(duì)紅霉素、復(fù)方新諾明的耐藥性則無(wú)顯著差異(P>0.05)。青霉素對(duì)HT31的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)HT155、HT197的抑制效果最弱，且青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT155、HT197呈顯著性差異(P<0.05)；頭孢噻吩對(duì)HT31的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)HT155、HT159的抑制效果次之，對(duì)HT90、HT111、HT197的抑制效果最弱，且頭孢噻吩對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT90、HT111、HT197呈顯著性差異(P<0.05)；環(huán)丙沙星對(duì)HT111的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)HT159的抑制效果次之，對(duì)HT31、HT90、HT155、HT197的抑制效果最弱，且環(huán)丙沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與6株菌均呈顯著性差異(P<0.05)；慶大霉素對(duì)HT90的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)HT31、HT159、HT197的抑制效果次之，對(duì)HT111、HT155的抑制效果最弱，且慶大霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與6株菌均呈顯著性差異(P<0.05)；氯霉素對(duì)HT90、HT111、HT155、HT159、HT197的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)HT31的抑制效果最弱，且氯霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT31無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)判斷結(jié)果及不同菌株同一抗生素的耐藥性分析
Table 2 Results of drug sensitivity test and analysis of drug resistance of different strains to the same antibiotic

注：括號(hào)內(nèi)字母為耐藥性判斷結(jié)果，S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥；藥敏紙片直徑為6.35 mm

7種抗生素對(duì)同一菌株的敏感性亦有不同(表3)。紅霉素對(duì)6株菌的抑制效果最強(qiáng)，慶大霉素、復(fù)方新諾明對(duì)6株菌的抑制效果最弱。此外，青霉素、頭孢噻吩、紅霉素對(duì)HT31和青霉素、紅霉素對(duì)HT111的抑制效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明青霉素、頭孢噻吩、紅霉素對(duì)HT31和青霉素、紅霉素對(duì)HT111的抑制效果均為最強(qiáng)的，原因可能是青霉素、頭孢噻吩、紅霉素影響了HT31、HT111內(nèi)蛋白類物質(zhì)的合成[15]。復(fù)方新諾明、頭孢噻吩對(duì)對(duì)照菌株的抑制效果最強(qiáng)，氯霉素、慶大霉素對(duì)對(duì)照菌株的抑制效果最弱。

表3 不同抗生素同一菌株的耐藥性分析
Table 3 Analysis of drug resistance of the same strain with different antibiotics

2.1.2 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

耐藥基因通常由質(zhì)粒等可移動(dòng)的遺傳元件攜帶，它們可以不受種屬間障礙的影響進(jìn)行自由交換，從而導(dǎo)致耐藥基因水平轉(zhuǎn)移。研究表明，體外培養(yǎng)條件下耐藥基因可以在不同種屬的乳酸菌菌株中發(fā)生轉(zhuǎn)移，當(dāng)外源性乳酸菌作用于腸道時(shí)，其耐藥基因能以各種方式在腸道菌群間相互傳遞，進(jìn)而使致病菌獲得耐藥性，危害宿主健康。此外，若乳酸菌的耐藥基因存在于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，會(huì)使乳酸菌的耐藥基因轉(zhuǎn)移到人體基因組，通過(guò)基因表達(dá)對(duì)人體造成潛在危害[18]。

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，對(duì)照組所在泳道出現(xiàn)熒光條帶(泳道2)，而6株副干酪乳桿菌的泳道上均無(wú)條帶出現(xiàn)(泳道3～8)，表明這6株菌均沒(méi)有攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，故可初步判斷這6株菌是安全菌株。該結(jié)果與田原等[19]的副干酪乳桿菌質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

1-15 K DNA Marker；2-陽(yáng)性對(duì)照；3～8-副干酪乳桿菌 HT31、HT90、HT111、HT155、HT159、HT197
圖1 質(zhì)粒提取電泳圖
Fig.1 Plasmid extraction electrophoresis

2.2 有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)

2.2.1 吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

吲哚實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)菌株能否產(chǎn)生色氨酸酶，其分解色氨酸后能生成吲哚。色氨酸是人體必需氨基酸，其代謝失調(diào)會(huì)影響色氨酸的吸收，甚至影響免疫及消化功能，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等。

吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性，而對(duì)照菌株大腸桿菌的結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明6株副干酪乳桿菌不能產(chǎn)生色氨酸酶，不會(huì)引起吲哚類物質(zhì)的產(chǎn)生。這與王英等[20]的副干酪乳桿菌的吲哚實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.2.2 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

溶血是指細(xì)菌分泌的溶血素使細(xì)胞溶解的現(xiàn)象，與菌株自身致病性相關(guān)。許多革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都能產(chǎn)生溶血素，作用于細(xì)胞膜后造成其結(jié)構(gòu)和功能紊亂，使細(xì)胞內(nèi)成分泄露，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。根據(jù)溶血情況可分為3類：α-溶血，是指血平板菌落周圍呈現(xiàn)棕綠色，這類菌通常為條件致病菌；β-溶血，是指菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈，這類菌通常具有強(qiáng)致病性，如金黃色葡萄球菌；γ-溶血，是指菌落周圍顯示正常血平板顏色，這類菌通常沒(méi)有致病性[21]。

溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2和表4。6株副干酪乳桿菌均有溶血性，其中表現(xiàn)為輕微溶血的菌株有2株，分別是HT31和HT111。副干酪乳桿菌HT197為無(wú)色透明圈的β-溶血，被攝入人體后可能有產(chǎn)生敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)，因此，不能作為發(fā)酵菌株。乳酸菌出現(xiàn)β-溶血的情況較少，此前IBRAHIM等[22]在埃及發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)了1株乳酸菌為β-溶血。副干酪乳桿菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均為呈棕綠色溶血圈的α-溶血，乳酸菌產(chǎn)生α-溶血的情況比較常見，BIN等[23]從多個(gè)發(fā)酵乳及牛乳中分離的乳酸菌中有30%的菌株出現(xiàn)了α-溶血，MARAGKOUDAKIS等[24]對(duì)干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的溶血實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小部分菌株會(huì)出現(xiàn)α-溶血現(xiàn)象，因其沒(méi)有出現(xiàn)致病性高的β-溶血，故上述研究者認(rèn)為這類菌株是相對(duì)安全的。由此可以得出，本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)α-溶血的HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均相對(duì)安全。

表4 實(shí)驗(yàn)菌與對(duì)照菌的有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)結(jié)果
Table 4 Evaluation results of harmful metabolites of experimental and control bacteria

注：--陰性；+-陽(yáng)性，+的數(shù)量表示程度；/-沒(méi)有進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)

a-HT31；b-HT197；c-S.aureus ATCC 25923
圖2 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
Fig.2 The results of hemolysis test

2.2.3 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)菌株分解氨基酸生成生物胺的能力。精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸經(jīng)過(guò)氨基酸脫羧酶作用后分別形成精胺、尸胺和腐胺，過(guò)多的生物胺類物質(zhì)積累會(huì)引起許多副作用，如嘔吐、惡心、發(fā)燒等癥狀[13]。此外，各生物胺之間還可以通過(guò)抑制某些生物胺相關(guān)代謝酶的活性，使生物胺數(shù)量增加，進(jìn)而增強(qiáng)人體的不適癥狀。

氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)均呈陰性，對(duì)照菌株大腸桿菌呈陽(yáng)性，說(shuō)明這6株菌不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，對(duì)人體無(wú)害。此結(jié)果與徐傳標(biāo)等[25]的干酪乳桿菌的氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)、質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)和氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)，從耐藥性檢測(cè)和有害代謝產(chǎn)物研究?jī)蓚€(gè)方面對(duì)醬油渣中分離的6株副干酪乳桿菌體外安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)菌株抗生素耐藥性的測(cè)定，是對(duì)現(xiàn)有的和潛在的益生菌菌株體外安全性評(píng)估的重要內(nèi)容之一。本研究采用紙片擴(kuò)散法探究了6株副干酪乳桿菌對(duì)青霉素、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素的敏感情況，結(jié)果表明，6株菌均對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為耐藥，HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對(duì)青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對(duì)環(huán)丙沙星中度耐藥，HT111對(duì)青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感，原因可能是副干酪乳桿菌對(duì)抑制細(xì)胞壁合成酶和蛋白質(zhì)合成的藥物較為敏感[15-16]?？股啬退幓蚩赏ㄟ^(guò)質(zhì)粒在食品和腸道環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過(guò)質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)探究6株副干酪乳桿菌是否有攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，結(jié)果表明，6株菌均不存在攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，與之前多篇文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[19-20]。綜上，6株副干酪乳桿菌對(duì)2種抗生素表現(xiàn)為抗性(慶大霉素、復(fù)方新諾明)，其中HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對(duì)4種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素)，對(duì)1種抗生素中度耐藥(環(huán)丙沙星)，HT111對(duì)5種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星)，且均不攜帶耐藥質(zhì)粒。

菌株的安全性研究還需對(duì)其毒性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生予以重視。本研究通過(guò)吲哚實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)探究了6株副干酪乳桿菌毒性代謝產(chǎn)物的生成情況，結(jié)果表明，6株副干酪乳桿菌均不產(chǎn)生色氨酸酶和氨基酸脫羧酶，不會(huì)產(chǎn)生吲哚、精胺、尸胺和腐胺等有害物質(zhì)，與之前副干酪乳桿菌相關(guān)有毒代謝產(chǎn)物研究的結(jié)果一致[20,25]，HT197出現(xiàn)β-溶血現(xiàn)象，此前也有研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵食品中分離的乳酸菌會(huì)產(chǎn)生β-溶血[22]，產(chǎn)生這種溶血現(xiàn)象的菌株安全性較低，有引起敗血癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]，其他5株菌均未出現(xiàn)β-溶血現(xiàn)象。綜上，6株副干酪乳桿菌在耐藥性檢測(cè)、產(chǎn)有害代謝物吲哚、精胺、尸胺和腐胺方面相對(duì)安全，在溶血方面，HT197為β-溶血，而其余5株菌沒(méi)有出現(xiàn)β-溶血，因此認(rèn)為這5株菌具有良好的安全性。

當(dāng)前，解決醬油渣資源浪費(fèi)問(wèn)題的研究主要集中在提取其中附加值較高的物質(zhì)或用作動(dòng)物飼料方面，對(duì)醬油渣中微生物的開發(fā)利用尚不足。醬油渣是醬油發(fā)酵的副產(chǎn)物，微生物種類豐富，從中篩選出性能良好并安全的菌株用作發(fā)酵劑能很大程度改善醬油渣的品質(zhì)和安全性，從而減輕資源浪費(fèi)問(wèn)題。本研究對(duì)從醬油渣中分離得到的6株副干酪乳桿菌的體外安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終得出HT31、HT90、HT111、HT155、HT159的安全性較高，為實(shí)際應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步通過(guò)毒力基因、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行探究，為其作為發(fā)酵劑用于醬油渣等發(fā)酵食品中的應(yīng)用安全性提供更加科學(xué)全面的理論依據(jù)。