微波輔助低共熔溶劑提取、部分純化螺旋藻多糖及其體外生物學(xué)活性研究

螺旋藻(Spriulina platensis)營養(yǎng)價(jià)值較高，是商業(yè)上必不可少的微藻之一，可直接用作食物或食物成分，亦可用作生物肥料、廢水處理和生物柴油生產(chǎn)，以及化妝品和制藥行業(yè)[1-2]，其含有大量的蛋白質(zhì)、必需脂肪酸(亞油酸和γ-亞麻酸)、多糖、氨基酸、維生素，尤其是復(fù)合維生素B和色素等[3]。螺旋藻中分離的多糖具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒和免疫應(yīng)答等[4]。目前，可以借助熱水、稀堿和不同的有機(jī)溶劑提取和分離多糖[5-6]，然而，這些傳統(tǒng)的提取方法通常復(fù)雜、耗時(shí)、低效且對環(huán)境有害。

低共熔溶劑(deep eutectic solvent，DES)作為新一代環(huán)境友好的“綠色”溶劑，具有替代有機(jī)溶劑的潛力，已引起廣泛關(guān)注[7]。一般來說，DES是由氫鍵受體和氫鍵供體混合而成的[8]。氯化膽堿價(jià)格低廉、可生物降解且無毒，是最常用的氫鍵受體，而氫鍵供體可以是糖、醇或羧酸。DES已被證明是一種新型綠色溶劑，具有無毒、可生物降解和不可燃等優(yōu)異的性能[9-10]。目前，DES正被用于有機(jī)合成和(生物)催化、生物化學(xué)、分析化學(xué)、納米材料和提取過程[11-15]。高效、無污染的DES輔助微波提取法已廣泛用于從天然植物材料中提取生物活性化合物，如類黃酮、異黃酮、酚類化合物和天然色素等[16-19]。然而，關(guān)于利用DES從螺旋藻中提取多糖的研究鮮有報(bào)道。

本研究評(píng)價(jià)了不同組合的DES對螺旋藻多糖提取效果的影響。在確定最佳的DES溶劑基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法對與多糖得率相關(guān)的主要提取條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并通過大孔樹脂對其部分純化，對其抗氧化和抗癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和設(shè)備

螺旋藻粉末由甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心提供；氯化膽堿、DL-蘋果酸、檸檬酸、甘油、乙二醇、1, 4-丁二醇、尿素、L-脯氨酸、丙二醇、甲醇、乙醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素、MTT，北京索萊寶科技有限公司；大孔樹脂D3520，天津允開樹脂科技有限公司；DPPH(純度>99.5%)、ABTS(純度>98.0%)，上海源葉生物科技有限公司；丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT，純度>98%)、維生素C (純度>98%)，成都德斯特生物科技有限公司；人宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司。所有其他試劑和化學(xué)品均為分析純。

U-T6 紫外可見分光光度計(jì)，屹譜儀器制造(上海)有限公司；DF-101S5L數(shù)顯恒溫水油浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MCR-3微波化學(xué)反應(yīng)器，鞏義市科瑞儀器有限公司。

1.2 DES合成

DES的合成是將氫鍵受體氯化膽堿和1種或者2種氫鍵供體按照一定物質(zhì)的量比混合，80 ℃磁力攪拌3～4 h，直至形成清澈均勻的液體，制備得到DES。結(jié)果如表1所示。

表1 不同類型DES的制備
Table 1 Preparation DES systems in the experiment

1.3 微波輔助低共熔溶劑提取多糖

為了選擇最佳提取溶劑，在微波反應(yīng)管中稱取1 000 mg螺旋藻粉末加入10 mL DES水溶液(去離子水含量:30%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，采用微波反應(yīng)系統(tǒng)在80 ℃下處理30 min，混合物以8 000×g離心15 min。在定量分析之前，用相應(yīng)提取溶劑將上清液固定到20 mL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，其得率由以下公式(1)計(jì)算:

多糖得率

(1)

式中：C，提取液中的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V，稀釋提取物的體積，mL；m，提取樣品的質(zhì)量，g

1.4 微波輔助DESs提取多糖的優(yōu)化

在微波輔助DES提取多糖的過程中，DES含水量、提取時(shí)間、提取溫度和固(樣粉)-液(提取劑)比是4個(gè)主要因素。通過改變水含量(0%、10%、20%、30%、40%、50%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))、提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)、提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)和固液比(10、20、30、60、80、100 mg/mL)，研究微波輔助DES提取螺旋藻多糖條件?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝。應(yīng)用BBD獲得該提取中4個(gè)主要自變量的最佳值：DES含水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和固液比(D)在3個(gè)不同水平(-1、0、1)。以多糖得率作為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)值?；趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。隨后，在最佳條件下進(jìn)行了3次驗(yàn)證提取實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)策略的準(zhǔn)確性。

1.5 從DES提取物中回收和部分純化多糖

在最佳條件下提取后，將DES提取多糖裝載到大孔樹脂D3520-Cl(3.5 cm×30 cm)上。用100 mL去離子水洗滌以除去DES后，用100 mL 0.1 mol/L(洗脫液1)、0.3 mol/L(洗脫液2)和0.5 mol/L(洗脫液3)的NaCl溶液以3 mL/min的流速梯度洗脫該柱；然后，分別收集洗脫液并采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中多糖含量，選擇目標(biāo)組分用于進(jìn)一步的體外活性檢測。

1.6 多糖的抗氧化活性

1.6.1 DPPH自由基清除活性

將提取和部分分離的多糖溶解在蒸餾水中以獲得不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1、2、3、4和5 mg/mL)的樣品溶液。然后，將0.1 mL多糖溶液與0.4 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mol/L)混合后在室溫遮光條件靜置，反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定吸光度。用DES提取的多糖清除DPPH自由基活性與已知的抗氧化劑(如BHT和維生素C)進(jìn)行了比較。DPPH自由基清除活性按照公式(2)計(jì)算:

DPPH自由基清除活性

(2)

式中：A空白，空白對照(含有除多糖之外的所有試劑)的吸光度；A樣品，樣品的吸光度。

1.6.2 ABTS陽離子自由基清除活性

將97.15 mg ABTS和16.13 mg過硫酸鉀與蒸餾水混合制備ABTS陽離子自由基儲(chǔ)備溶液(25 mL)。室溫下黑暗中孵育12 h，然后用無水乙醇稀釋至734 nm處的吸光度為(0.70±0.02)。將0.1 mL不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)的樣品加入到0.9 mL ABTS溶液中，并在黑暗中孵育20 min。在734 nm處測量吸光度。維生素C和BHT作為陽性對照。ABTS陽離子清除活性按公式(3)計(jì)算:

ABTS陽離子清除活性

(3)

式中：A空白，空白對照的吸光度(包含除多糖之外的所有試劑)；A樣品，樣品的吸光度

1.7 多糖抗癌活性

1.7.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)物

HeLa細(xì)胞在含有10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活FBS和100 μg/mL青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃和5% CO2的中培養(yǎng)。

1.7.2 生長抑制試驗(yàn)

為了評(píng)估DESs提取多糖對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用，將細(xì)胞接種(5×104)在96孔板中，其中含有100 μL熱滅活培養(yǎng)基，并在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育24 h。然后，將含有來自DES提取物的0、50、100、200、300、400 μg/mL多糖的新鮮培養(yǎng)基加入到96孔板中，并在相同的條件下分別孵育24、48、72 h后，向每個(gè)孔中加入5 mg/mL MTT溶液(10 μL)，細(xì)胞在37 ℃和5% CO2下孵育4 h。除去培養(yǎng)基后，向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO。反應(yīng)后，在490 nm處測量樣品的吸光度。抑制率按公式(4)計(jì)算:

抑制率

(4)

式中：A空白和A樣品分別為對照和試驗(yàn)樣品的吸光度

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，差異之間顯著性通過方差分析(ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助DES提取多糖的工藝優(yōu)化

2.1.1 不同類型DESs對多糖提取效果的影響

為了評(píng)估最佳DES提取溶劑，本研究評(píng)估了9種不同類型的DES對多糖提取效果的影響(圖1)。

圖1 不同種類低共熔溶劑對螺旋藻多糖提取效果的影響
Fig.1 Effects of different DESs on the yield of polysaccharide from Spirulina platensis

分別以不同醇、有機(jī)酸和尿素與氯化膽堿的固定混合物質(zhì)的量比合成了3種醇基DES(DES-1、DES-2和DES-4)、3種有機(jī)酸基DES(DES-5、DES-6和DES-7)和1種脲基DES (DES-3)。DES-8和DES-9為3種組分的混合物。與常規(guī)溶劑相比，由于范德華力、氫鍵和不同組分間的靜電相互作用，DESs具有較高的黏度。為提高提取效率，以質(zhì)量比7∶3加水，用9種不同的DESs溶劑從螺旋藻中提取多糖，其中醇基DESs提取效果最好，其次是有機(jī)酸基 DESs和脲基DESs。與2種組分的混合物相比，DES-8和DES-9對多糖的提取能力不同，但均低于醇基DES。醇基DESs具有相對較小黏性和表面張力,1, 4-丁二醇內(nèi)部空間足夠大且醇基分支少, 且羥基的存在，增加了其與多糖的相互作用，其極性更適合多糖提取；此外，醇基DESs的提取效率高于水?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇由氯化膽堿和1, 4-丁二醇(物質(zhì)的量比為1∶4)組成的DES-4作為提取多糖的溶劑，并應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 DES含水量的影響

合成的DES具有一定的黏度，會(huì)影響萃取效率，具有一定含水量的DES體系有利于傳質(zhì)。由圖2-a可知，在DES中加入不同含量的水提取螺旋藻多糖時(shí)，提取效果依賴于DES含水量。

當(dāng)DES體系中的含水量從0%增加到30%時(shí)，螺旋藻多糖得率顯著增加。然而，含水量的進(jìn)一步增加(30%～50%)導(dǎo)致提取效果降低，這可能是因?yàn)镈ES系統(tǒng)中高濃度的水可能會(huì)限制多糖和DES組分之間的相互作用。因此，DES含水量選擇30%用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間、提取溫度和固液比的影響

為了研究提取時(shí)間、提取溫度和固液比對螺旋藻多糖提取率的影響，樣品在這些因素變化的條件下依次提取，而保持其他提取條件不變。如圖2所示，提取效率受提取時(shí)間、溫度和固液比的影響?；谶@些結(jié)果，Box-Behnken設(shè)計(jì)選擇了以下最佳DES提取條件：提取時(shí)間30 min、提取溫度80 ℃和固液比為20 mg/mL。

2.1.4 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上初步確定提取變量的范圍后，使用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，響應(yīng)面分析的因素和水平見表2。

a-DES含水量；b-提取時(shí)間；c-提取溫度；d-固液比
圖2 DES含水量、提取時(shí)間、提取溫度和固液比對多糖提取效果的影響
Fig.2 Effects of different extraction parameters on the yield of polysaccharides.DES water content, extraction time, extraction temperature, and solid-liquid ratio

表2 響應(yīng)面分析中的因素和水平
Table 2 Factors and levels in the response surface analysis

整個(gè)研究包括29個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。與該實(shí)驗(yàn)相關(guān)的編碼變量和響應(yīng)如表3所示。

表3 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果
Table 3 Results of the BBD for extraction optimization

預(yù)測模型的截距、線性、二次和交互作用項(xiàng)的回歸系數(shù)見表4。模型P<0.000 1，表明該預(yù)測模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A、B、AC、BC、A2、B2、C2、D2參數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；說明實(shí)驗(yàn)因子與方程之間不是簡單線性關(guān)系；DES水含量(A)和提取時(shí)間(B)是多糖提取工藝的主要決定參數(shù)。響應(yīng)變量的決定系數(shù)(R2)為0.96，這意味著該回歸模型可以預(yù)測結(jié)果。

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果
Table 4 The results the response surface analysis of variance

失擬項(xiàng)P值為0.098 1，差異不顯著 (P>0.05)，說明預(yù)測模型可準(zhǔn)確地反映實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

基于對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸分析，使用二階多項(xiàng)式方程來表示預(yù)測模型?；貧w模型方程如下：

Y=108.05-1.57A-1.77B+0.027C-0.26D+1.84AB-3.26AC-1.51AD-2.15BC+0.96BD+0.76CD-9.98A2-4.77B2-5.50C2-6.48D2

式中：Y，多糖得率；A，DES含水量；B，提取時(shí)間；C，提取溫度；D，固液比。

通過對二階多項(xiàng)式方程的分析，得出最佳提取條件為：DES含水量28.89%；提取時(shí)間27.74 min；提取溫度80.78 ℃，固液比19.81 mg/mL，獲得的多糖得率為108.34 mg/g。在實(shí)驗(yàn)過程中，考慮到實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作條件，對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行修正：DES含水量29%、提取時(shí)間28 min、提取溫度81 ℃、固液比20 mg/mL，在此條件下，獲得的多糖平均得率為109.80 mg/g，說明此法可用于多糖的提取。

2.1.5 微波輔助DES提取與其他提取方法的比較

為了評(píng)價(jià)微波輔助DES提取法在提高提取效率方面的優(yōu)勢，將微波輔助DES提取法與包括熱堿浸提[5]、超聲波輔助提取[20]、回流提取[6]、三相萃取[21]和內(nèi)部沸騰法[22]在內(nèi)的其他螺旋藻多糖提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果本法采用微波輔助提取具有最高的多糖得率。由于DES-4溶劑黏性和表面張力小, 1, 4-丁二醇內(nèi)部空間足夠大且醇基分支少, 氫鍵和多糖相互作用強(qiáng)，且極性更適合多糖提??；另外，微波的輻射作用穿透螺旋藻細(xì)胞，使得細(xì)胞壁破裂，有利于多糖的溶出。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的微波輔助DES提取方法有效地提高了多糖的產(chǎn)量。

2.2 多糖的回收和部分純化

根據(jù)最佳提取條件制備螺旋藻多糖，并按照1.5的方法對粗多糖提取物進(jìn)行純化。分別對3種洗脫組分(洗脫液1、洗脫液2和洗脫液3)進(jìn)行收集、減壓濃縮和透析、干燥處理。洗脫液1、洗脫液2和洗脫液3中多糖質(zhì)量分別為(4.57±0.22)、(86.59±0.17)和(3.96±0.24) mg；多糖含量分別為(19.58±1.24)%、(88.96±0.47)%和(84.10±1.21)%。洗脫液2含有最高的多糖，其多糖含量相對高于洗脫液1和洗脫液3。因此，選擇并大量產(chǎn)生洗脫液2，用于體外進(jìn)一步的活性檢測。

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性

從螺旋藻中提取的多糖的抗氧化活性如圖3所示。DPPH經(jīng)常被用作檢測化合物的自由基清除活性的代表性試劑。如圖3-a所示，樣品顯示出濃度依賴性的DPPH自由基清除活性。與對照相比，活性水平依次增加順序?yàn)椋禾崛∥铩HT和維生素C。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度從0.1 mg/mL增加到5 mg/mL時(shí)，提取物的DPPH自由基清除活性從19.58%增加到89.1%。提取多糖的IC50值(能夠清除50% DPPH的提取物濃度)為0.97 mg/mL?；谶@些結(jié)果，可以初步推斷，在最佳條件下使用DES從螺旋藻中提取的多糖顯示出優(yōu)異的DPPH 自由基清除活性，因此其可以作為主要抗氧化劑。

a-DPPH自由基；b-ABTS陽離子自由基
圖3 螺旋藻多糖DPPH自由基和ABTS陽離子 自由基清除活性
Fig.3 DPPH radical and ABTS cation radical-scavenging activities of the polysaccharides extracted from S. platensis

2.3.2 ABTS陽離子自由基清除活性

與DPPH自由基清除活性類似，樣品的ABTS陽離子自由基清除活性在較高濃度下逐漸增強(qiáng)，與對照組相比，清除活性依次增加順序?yàn)椋禾崛∥?、BHT和維生素C(圖3-b)。以上結(jié)果證實(shí)了用DES體系提取的螺旋藻多糖具有顯著的體外ABTS陽離子自由基清除活性，IC50值為0.91 mg/ mL。DES被認(rèn)為適合用于從螺旋藻中微波輔助提取多糖的溶劑體系，因此，所獲得的純化多糖顯示出優(yōu)異的體外抗氧化活性。

2.4 多糖的抗癌活性

從螺旋藻中提取的多糖在抗癌活性中起著重要作用。然而，用DES提取的螺旋藻多糖的抗癌活性的研究報(bào)道很少。因此，在本研究中評(píng)估了所獲得的螺旋藻多糖的抗癌活性。由圖4可知，用多糖處理后，測定24、48和72 h的HeLa細(xì)胞抑制率。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度從50 μg/mL增加到200 μg/mL時(shí)，多糖提取物對HeLa細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)。在200 μg/mL質(zhì)量濃度下72 h對HeLa細(xì)胞的最高抑制率為48.59%。隨著樣品質(zhì)量濃度從200 μg/mL增加到400 μg/mL，多糖對HeLa細(xì)胞的抑制率反而降低。這可能是因?yàn)镠eLa癌細(xì)胞在高濃度下可能產(chǎn)生了某種耐藥性。因此，采用DESs從螺旋藻提取的多糖在一定濃度范圍內(nèi)可抑制了HeLa癌細(xì)胞的體外自我增殖。

圖4 不同濃度多糖樣品對HeLa細(xì)胞的抑制率的影響
Fig.4 Inhibition rate of HeLa cells by polysaccharide samples of different concentrations

3 結(jié)論

基于DES的高效、簡單和環(huán)保的微波輔助提取方法被應(yīng)用于螺旋藻中多糖的提取。最佳提取溶劑為氯化膽堿和1,4-丁二醇(物質(zhì)的量比為1∶4)組成的DES-4，提取效率優(yōu)于其他溶劑。響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件有效提高了提取效率，最終優(yōu)化條件為：DES含水量29%、提取時(shí)間28 min、提取溫度81 ℃、固液比20 mg/mL，在此條件下，獲得的多糖平均得率為109.80 mg/g。經(jīng)大孔樹脂純化后多糖具有良好的抗氧化活性和較強(qiáng)抑制HeLa細(xì)胞生長的作用。因此，DES作為一種綠色溶劑，可廣泛用于天然植物材料中有效生物活性物質(zhì)的提取。