探究KCl代替NaCl對嗜酸乳桿菌和大腸桿菌的影響

NaCl是最重要的食品添加劑之一，不僅能增強食物的質地和風味，還具有防腐作用。過量攝入NaCl可能導致高血壓，是心血管疾病、中風和腎臟疾病的危險因素；同時增加肥胖及胃癌的發(fā)病風險[1]。因此，有必要使用代鹽以減少鈉鹽的攝入。由于KCl與NaCl的理化性質相似,在既往研究中常作為NaCl的理想替代品。GAN等[2]報道在臘肉加工過程中KCl部分替代NaCl可促進乳酸桿菌的生長，有利于生產過程中的蛋白質水解和脂質氧化；KAMLEH等[3]證實KCl部分替代NaCl(30%)對Akkawi奶酪處理后，微生物隨儲藏時間增加而增長，但與NaCl處理并無顯著性差異。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是一種常見的益生菌，在食品工業(yè)中廣泛應用，是生產面包、酸奶、奶酪等發(fā)酵食品的主要菌種[4]。L.acidophilus能提高食品的保鮮質量、風味和營養(yǎng)價值，與食品質量密切相關[5]。大腸桿菌(Escherichia coli)是腸道中最主要的細菌，是一種條件致病菌。某些血清型如E.coli O157:H7是高致病性的，可污染飲用水、奶制品、生鮮等，導致人群水樣腹瀉和嘔吐[6]。在食品工業(yè)中，必須嚴格控制E.coli數量低于國際安全標準，以確保食品質量和安全。因此，探究一種在不顯著影響L.acidophilus的情況下能有效抑制E.coli生長的代鹽至關重要。

增加鹽濃度使?jié)B透壓達到臨界值，革蘭氏陽性菌細胞質膜分離受到影響[7]。另一研究顯示當NaCl質量分數從5%增至10%時，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的細胞形態(tài)受到影響[8]。質膜分離的突然發(fā)生會導致營養(yǎng)物質吸收和脫氧核糖核酸復制受到抑制，并引發(fā)細胞三磷酸腺苷水平的增加，從而導致大分子生物合成受到抑制[9]。因此，檢測并找到合適的總鹽濃度非常重要。當NaCl質量分數從3%增至7%時，微生物磷酸己糖異構酶、異檸檬酸脫氫酶和醛縮酶受到抑制[8]。當NaCl質量分數從0增至5%時，細胞活力和酯酶活性降低[10]。因此本研究選擇總鹽濃度為6%的條件下對細菌細胞的影響。

研究表明，乳制品中不同的鹽濃度會影響細菌的細胞結構進而抑制細菌的生長和降低活性[11-13]。因此，本文將研究NaCl與KCl在總鹽質量分數(6%)下的替代效果，并尋找一個不影響益生菌生長又能抑制致病菌生長的濃度組合，為KCl替代NaCl的適宜濃度提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

Lactobacillus acidophilus CSCC 2400、Escherichia coli ATCC 2592，香港大學乳品和益生菌實驗室提供。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基和MRS(deMann Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基，美國Becton Dickinson公司。

BD-FACS-Aria III流式細胞儀，美國Becton Dickinson公司；FT-IR-8400S傅立葉變換紅外光譜儀，美國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)與鹽干預

無菌MRS和LB培養(yǎng)基中分別接種L.acidophilus和E.coli，獲得約108 CFU/mL的初始濃度。稀釋L.acidophilus和E.coli懸液至OD值為0.6～0.7。再將細胞置于室溫(18～20 ℃)的不同鹽溶液中：A(0% NaCl和0% KCl)、B(6% NaCl和0% KCl)、C(3% NaCl和3% KCl)、D(0% NaCl和6% KCl)。為了觀察上述NaCl和KCl干預后細胞的變化，在1 h、3、5和7 d等時間點進行監(jiān)測。為了長期維持細胞生長，在細胞懸浮液中加入乳糖(最終體積的2%)以提供足夠的營養(yǎng)。

1.2.2 細菌活菌數檢測

用平板計數法計算不同鹽干預對活菌數的影響。細胞懸液在不同鹽干預1 h、3、5和7 d后，用0.15%無菌蛋白胨水連續(xù)稀釋細胞(10-1～10-7)，將0.1 mL L.acidophilus和E.coli細胞懸液分別涂在MRS和LB瓊脂平板上。培養(yǎng)皿37 ℃孵育48 h，計數CFU，3次重復。

1.2.3 細胞膜完整性和酯酶活性檢測——流式細胞術(flow cytometry，FCM)

將鹽干預細胞(950 μL)與50 μL羧熒光素二乙酸酯(carboxyfluorescein diacetate，cFDA)在37 ℃水浴中孵育10 min，使cFDA在細胞內酶促轉化為羧熒光素(carboxyfluorescein，cF)。去除多余cFDA，并向細胞中添加30 μL 碘化丙二鈉(propylene sodium iodide，PI)。細胞在冰浴中孵育10 min，以標記細胞膜受損。通過熱殺死細胞(100 ℃水浴1 h)和活細胞調整正確的參數，并進行染色[14-15]，cF染色細胞在488 nm激光激發(fā)后在530 nm處發(fā)出綠色熒光，PI染色細胞在635 nm處發(fā)出紅色熒光[16]，數據采用FlowJo 7.6.2版(TreeStar Inc，美國阿什蘭州)分析，根據它們的熒光性能將4個細菌群分為4個象限。用公式(1)計算了不同鹽干預對細胞酯酶活性的影響。在Q3象限(四方圖右下)，僅用cF染色的細胞被認為是監(jiān)測鹽干預后細胞內殘留的酯酶活性。Q3是鹽干預后細胞Q3象限的百分比，Q3控制是鹽干預前細胞Q3象限的百分比。

細胞酯酶活性

(1)

1.2.4 細胞結構改變檢測——傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，FT-IR)

稀釋L.acidophilus和E.coli懸液至OD值分別為1.7和1.5左右。離心(4 000×g，4 ℃，10 min)收集鹽干預細胞并在無菌生理鹽水中通過再懸浮洗滌2次，離心(4 000×g，4 ℃，10 min)回收。將洗滌后的細胞懸浮在無菌蒸餾水中(100 mg濕細胞/mL)，取50 μL細胞懸液置于CaF2光學板上，在50 ℃的烘箱中干燥30 min。采用傅立葉變換紅外光譜儀進行掃描，平均掃描20次，掃描范圍為4 000～1 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。對光譜進行變換(使用SavitzkyGolay算法進行基線校正、平滑和歸一化)，并在閾值0.50%以上檢測到峰值。為了校正背景，在每個樣本之前記錄空氣光譜[17]。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

實驗結果用平均數±標準差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析進行多組間比較；雙側P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。采用Tukey事后檢驗比較不同鹽濃度下均值之間的差異。

2 結果與分析

2.1 菌數測定分析

活菌計數結果顯示(圖1)，在4個時間點，L.acidophilus經A鹽干預的活菌量均大于B、C、D鹽干預，且B的數量最少，提示B鹽干預的抑制作用最大，C鹽干預值<d鹽干預值，但均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。E.coli經1 h鹽處理后B、C和D鹽干預的活菌數與A鹽干預相比，差異顯著(P<0.05)，經鹽處理3 d后C和D鹽干預的活菌數與A鹽干預相比，差異顯著(P<0.05)。但5、7 d鹽處理后，與A鹽干預相比，差異不顯著(P>0.05)。結果表明B、C和D鹽干預對E.coli活菌數有明顯的抑制作用，且以C鹽干預效果最為顯著，但隨時間延長差異變小。

2.2 細胞膜完整性和酯酶活性測定分析

菌落形成數不能反映鹽處理引起的細胞損傷程度和代謝活動的詳細情況，因此，本研究應用FCM進一步檢測，根據其結構或生理參數找到不同的亞群，以更好地了解細胞狀態(tài)。L.acidophilus鹽干預1 h結果如圖2-a所示：B鹽干預1 h的Q1象限的細胞數量(2.58%)在4個鹽干預中最多，表明B鹽干預的細胞死亡率最大，對L.acidophilus的生長有顯著的抑制作用。鹽干預1 h，從B鹽到D鹽，大部分細胞位于Q3象限且Q3象限的細胞數量增加，分別為73.0%、73.2%、79.4%，表明隨KCl濃度增加對L.acidophilus的抑制作用減弱；在3、5和7 d的試驗中，B、C和D鹽干預的Q3象限的結果類似。

LA-L.acidophilus；A-0% NaCl，0% KCl；B-6% NaCl，0% KCl；C-3% NaCl，3% KCl；D-0% NaCl，6% KCl(下同) a-1 h；b-3 d；c-5 d；d-7 d
圖1 不同濃度的鹽干預不同時長對L.acidophilus和E.coli活菌數的影響
Fig.1 The impact of salt treatment after different treatment time on cell viability of L.acidophilus and E.coli 注：*表示在P<0.05水平差異顯著；n=3(下同)

a-L.acidophilus 1 h鹽干預；b-E.coli 1 h鹽干預
圖2 cF與PI染色經鹽干預1 h后對L.acidophilus和E.coli酯酶活性和膜完整性的流式點圖分析
Fig.2 FCM dot plot of cF vs PI salt treatment after 1 h on esterase activity and membrane integrity of L.acidophilus and E.coli.

E.coli鹽干預1 h結果如圖2-b所示，B鹽干預1 h的Q1象限的細胞數量(15.2%)在4種不同鹽干預中最多，表明B鹽干預的細胞死亡率最大，對E.coli的生長有顯著抑制作用。鹽干預1 h，從B鹽到D鹽，Q3象限的細胞數量減少，分別為17.1%、16.5%和16.0%，表明隨KCl濃度增加對E.coli的抑制作用增強。在3 d的試驗中觀察到相同的結果，而在5和7 d的試驗中，B、C和D鹽處理的Q1象限的結果相似。此外，發(fā)現鹽干預1 h，大部分細胞位于Q2象限，而其他3個時間點大部分細胞位于Q4象限，即未染色細胞。

根據FCM點圖計算和分析酯酶活性的數據如圖3所示，L.acidophilus酯酶活性在不同鹽濃度下隨時間逐漸降低。在4個時間點，B鹽干預對酯酶活性的影響最為明顯，C鹽干預效果次之，D鹽干預效果最小。鹽干預1 h，B(90.58%)、C(92.41%)鹽干預組的酯酶活性均與A組有顯著性差異(P<0.05)，但D(96.78%)鹽干預組的酯酶活性與A組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鹽干預3、5和7 d，B、C、D鹽干預組的酯酶活性均與A組有顯著性差異(P<0.05)。

E.coli酯酶活性也在不同鹽濃度下隨時間逐漸降低。如圖3所示，不同鹽濃度干預1 h后，酯酶活性明顯下降至60%以下，但在3、5和7 d的實驗中，酯酶活性急劇上升至80%以上，可能與E.coli逐漸對各種鹽干預適應，細胞膜不同程度地得到修復相關，其酯酶活性也不同程度的提高。結果表明，鹽干預1 h，不同濃度的鹽均能顯著降低酯酶活性，與A鹽干預有顯著性差異(P<0.05)，其余3個時間點，僅D鹽干預組對酯酶活性的抑制作用最大，與A鹽干預有顯著性差異(P<0.05)。

a-1 h；b-3 d；c-5 d；d-7 d
圖3 鹽干預1 h、3 d、5 d和7 d對L.acidophilus和E.coli酯酶活性的影響
Fig.3 The impact of salt treatment after 1-hour, 3-days, 5-days and 1-week on esterase activity of L.acidophilus and E.coli

2.3 FT-IR分析

FT-IR被證明在研究細菌應激反應和微生物代謝方面有重要意義，細菌的主要細胞構件(蛋白質、脂類、多糖及其衍生物及其組合)的特征被記錄。L.acidophilus和E.coli的FT-IR結果觀察到不同峰的波長(閾值為0.5%)，如表1和表2所示。

表1顯示L.acidophilus觀察到不同波峰：不同濃度鹽干預1 h，L.acidophilus的所有峰均能被檢測到。其他3個不同時間點，僅在B鹽干預組的第3天檢測到1 377 cm-1的波峰，這與細胞壁蛋白中CH2的C—H彎曲模式有關，而其他L.acidophilus樣品中則完全缺失，表明細胞壁蛋白中CH2的結構受損。1 551 cm-1處的峰值代表酰胺II區(qū)蛋白質中較大的CH2變形，鹽干預第5天、第7天該峰值缺失，表明長時間的鹽干預影響L.acidophilus細胞壁蛋白和肽，導致細胞結構受損。3 302 cm-1處的峰值代表酰胺-A的N—H拉伸模式。這個峰值在第5天及第7天未檢測到，表明細胞壁蛋白酰胺-A受損，提示隨著鹽干預時間延長，細胞結構受損加重。2 958～2 854 cm-1峰值區(qū)域代表脂肪酸區(qū)域，鹽干預實驗的4個時間點都能檢測到該區(qū)域的所有峰值，波數沒有明顯的變化。脂肪酸區(qū)域與膜流動性有關，表明不同的鹽溶液對L.acidophilus細胞膜流動性沒有影響。此外，代表酰胺I和酰胺II區(qū)，在1 539、1 647 cm-1的波峰在L.acidophilus所有標本中有位移；代表酰胺-A區(qū)波長為3 292 cm-1，在所有L.acidophilus樣品中也有位移。綜上，表明L.acidophilus細胞壁蛋白和肽對鹽溶液敏感，但細胞膜流動性對鹽濃度的變化具有穩(wěn)定性。

表2顯示E.coli觀察到不同波峰：實驗干預的第3天，C和D鹽干預的E.coli均未出現1 551 cm-1的峰值，而在第5天和第7天，B、C和D鹽干預的E.coli該峰值完全缺失，表明E.coli的細胞壁蛋白和肽結構受損。3 089 cm-1的吸收帶主要是不飽和碳的C—H伸縮振動，其波峰值在1 h的C鹽及3 d的A鹽和C鹽干預的E.coli中未檢測到，在5及7 d鹽干預中均未檢測到。不同鹽干預的4個時間點均能觀察到代表酰胺A的N—H拉伸模式(3 290 cm-1)和脂肪酸區(qū)域(2 854、2 873、2 925、2 959 cm-1)的峰值，波數無明顯變化。1 235 cm-1處的峰值代表酰胺III區(qū)的β-片層，C鹽干預1 h觀察到波峰值移至1 231 cm-1，且在第5天和第7天C鹽和D鹽干預中分別檢測到波峰值向1 234、1 233 cm-1移動，表明E.coli從β-片層到不規(guī)則結構的變化，表明E.coli細胞壁蛋白質和肽可能受到影響。

3 討論

活菌計數結果顯示B鹽干預對L.acidophilus抑制作用最顯著，C鹽干預對E.coli抑制作用最顯著。圖1可觀察到E.coli在鹽干預的第3天、第5天和第7天的活菌量急劇增加，并且都大于1 h。推測鹽干預早期E.coli處于應激狀態(tài)，活菌量減少，隨著鹽干預時間延長，E.coli適應性提高并以完整或最小受損的代謝能力迅速生長[18-19]。綜合L.acidophilus和E.coli的活菌計數結果，C鹽干預(3% NaCl，3% KCl)對E.coli生長抑制作用最顯著，對L.acidophilus生長的抑制作用弱，是理想鹽組合。FCM結果如圖2、3所示，可觀察到D鹽干預對L.acidophilus細胞膜完整性和酶活力的損傷最小；而對E.coli損傷最大，表明D鹽干預(6% KCl，0% NaCl)是L.acidophilus和E.coli理想鹽組合。FT-IR常用于研究細胞結構變化，記錄分子的官能團波數。4 000～3 100 cm-1的區(qū)域代表了廣泛的構象特征，3 300 cm-1的條帶歸于酰胺A族的N—H拉伸模式[17,20]。3 100～2 800 cm-1的波數代表烷基烴和脂肪酸區(qū)域，其主要有—CH3、>CH2和>CH，通常存在于各種膜親脂成分上的官能團的拉伸振動[21]。1 800～1 500 cm-1的區(qū)域是酰胺區(qū)，主要由細胞壁蛋白質和肽的酰胺Ⅰ(1 700～1 600 cm-1)和酰胺Ⅱ(1 550～1 453 cm-1)條帶控制[22-23]。1 500～1 200 cm-1的區(qū)域代表混合區(qū)域，即包含蛋白質、脂肪酸和磷酸鹽攜帶化合物信息的光譜區(qū)域[23]。1 330～1 295 cm-1代表蛋白質二級結構α-螺旋；1 295～1 270 cm-1代表β-轉角；1 270～1 250 cm-1代表無規(guī)卷曲；1 245～1 220 cm-1代表β-片層；1 245～1 250 cm-1的邊界區(qū)域可能同時具有無規(guī)卷曲和β-片層結構；1 300～1 295 cm-1的邊界區(qū)域可能同時來自α-螺旋和β-轉角結構[24]。該實驗結果顯示L.acidophilus細胞壁蛋白和肽對鹽溶液敏感，但細胞膜流動性對鹽濃度的變化具有穩(wěn)定性。E.coli在C鹽干預1 h后，3 089 cm-1的波峰值缺失，而B和D鹽干預E.coli的結果無影響，表明C鹽干預早期影響E.coli結構；同時1 235 cm-1處的峰值在C鹽干預1 h后移至1 231 cm-1，而在D鹽干預的第5天和第7天移至1 234、1 233 cm-1，表明C鹽和D鹽可破壞E.coli細胞壁蛋白的二級結構，與D鹽比較，C鹽對E.coli細胞壁蛋白結構的破壞出現的更早，更明顯。綜合L.acidophilus和E.coli的FT-IR結果，發(fā)現C鹽干預(3% KCl，3% NaCl)是L.acidophilus和E.coli 理想鹽組合。

4 結論

活菌計數和FT-IR光譜分析的結果表明在終鹽質量分數為6%時，3% KCl、3% NaCl的鹽組合與6% NaCl相比可顯著抑制E.coli而不顯著影響L.acidophilus，是替代鈉鹽的理想鹽組合；而FCM的結果顯示6% KCl、0% NaCl是替代鈉鹽的理想鹽組合。實際應用中鉀鹽替代鈉鹽能降低血壓，但用鉀鹽替代100%鈉鹽會使腎功能不全或使用保鉀利尿藥的人群出現高鉀血癥，從而導致心律失常和猝死。因此，為避免高鉀血癥及其他并發(fā)癥的出現，不推薦采用鉀鹽替代100%鈉鹽。綜合考慮，用KCl替代50% NaCl即3% KCl、3% NaCl的鹽組合是替代鈉鹽的理想鹽組合，對一般人而言是安全的、有益的。本研究為探究理想代鹽濃度組合以減少鈉鹽攝入，同時保障食品微生物安全，提供了實驗數據，但鉀鹽替代鈉鹽在食品安全與生產中的應用有待進一步研究。