外源甘露醇復(fù)壯草菇退化菌株的研究

草菇(Volvariella volvacea)，又名稻草菇、中國(guó)菇，是我國(guó)重要的栽培食用菌之一[1]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，草菇年產(chǎn)量由2010年的33.08萬t降至2019年的23.43萬t，下降了29.17%。究其原因，可能與草菇不耐低溫儲(chǔ)藏，較其他食用菌更容易退化有關(guān)[2]。因此，尋找一種簡(jiǎn)單高效地復(fù)壯草菇退化菌種的方法是草菇產(chǎn)業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。

菌種退化是指食用菌由于惡劣的外界環(huán)境、病毒侵害或傳代次數(shù)過多等原因，導(dǎo)致產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等降低的變化。菌種退化是食用菌生產(chǎn)中普遍存在的現(xiàn)象，嚴(yán)重限制了食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并降低了它們的生物利用價(jià)值[3]。KIM等[4]發(fā)現(xiàn)金針菇退化菌株的菌絲生長(zhǎng)緩慢、子實(shí)體很少或沒有子實(shí)體。王巧莉等[5]研究發(fā)現(xiàn)草菇退化菌株的氣生菌絲密度稀疏、菌絲生長(zhǎng)速度及基質(zhì)降解酶活力顯著降低。

碳源是食用菌重要的營(yíng)養(yǎng)源之一，為食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。食用菌長(zhǎng)期使用相同的碳源，可能會(huì)導(dǎo)致菌絲營(yíng)養(yǎng)吸收能力降低，加速菌種退化。通過更換碳源，會(huì)一定程度上刺激菌絲代謝，從而提高菌絲對(duì)碳源的吸收能力。培養(yǎng)基中常使用的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等。牛宇等[6]發(fā)現(xiàn)白靈菇以甘露醇為碳源時(shí)的菌絲生物量最大，蔗糖和麥芽糖次之。謝永等[7]發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉是秀珍菇生長(zhǎng)的最佳碳源，其次為葡萄糖和果糖。

組織分離是指通過切取子實(shí)體、菌核或菌索的1塊組織來獲取純培養(yǎng)的方法。生產(chǎn)上常用組織分離法進(jìn)行食用菌菌種的提純和復(fù)壯，但過多的組織分離會(huì)導(dǎo)致菌種的退化。本文以連續(xù)組織分離法獲得的草菇退化菌株為試驗(yàn)材料，用同等碳量的6種碳源代替?zhèn)鹘y(tǒng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)中的葡萄糖，篩選出復(fù)壯效果較好的培養(yǎng)基碳源，并結(jié)合草菇菌絲體的生理性狀、色度培養(yǎng)基(liquid medium supplemented with bromothymol blue and lactose，LBL)脫色能力及基質(zhì)降解相關(guān)酶活力指標(biāo)的測(cè)定，為草菇及其他食用菌退化菌種的復(fù)壯研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

原種(D0)，草菇V844保藏于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

繼代菌種(D1-D3)，由課題組前期通過組織分離繼代法獲得；D1，連續(xù)組織分離繼代6次，產(chǎn)量降低7.89%；D2，連續(xù)組織分離繼代12次，產(chǎn)量降低35.46%；D3，連續(xù)組織分離繼代18次，產(chǎn)量降低90.75%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

對(duì)照組培養(yǎng)基PDA(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，KH2PO4 1，MgSO4 1，瓊脂粉20。

處理組培養(yǎng)基：將對(duì)照組中的20 g/L葡萄糖分別替換為同等碳量的19 g/L海藻糖、20 g/L甘露醇、19 g/L蔗糖、20 g/L果糖、20 g/L麥芽糖及18 g/L可溶性淀粉。

色度培養(yǎng)基LBL(g/L)：馬鈴薯200、乳糖20、NH4NO3 2、KH2PO4 1.5、MgSO4 0.5、溴百里香酚藍(lán)(bromothymol blue, BTB)0.06。

酶活測(cè)定培養(yǎng)基(g/L)：粉碎的棉籽殼10，酵母抽提物5，KH2PO4 0.6，MgSO4 0.5。

1.2.2 草菇菌絲生理性狀測(cè)定

氣生菌絲密度：將菌株D0～D3統(tǒng)一活化并培養(yǎng)3 d后，觀察并拍照記錄氣生菌絲密度。

菌絲生長(zhǎng)速度(mm/h)：參照文獻(xiàn)[8]的方法。將D0～D3統(tǒng)一活化并培養(yǎng)72 h后，在培養(yǎng)皿上通過十字交叉法劃線標(biāo)記草菇菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

菌絲生物量(g)：參照REN等[9]的方法。將菌株D0～D3統(tǒng)一活化并培養(yǎng)3 d后，收集菌絲，用蒸餾水洗滌3次后在60 ℃下干燥至恒重并稱重。

1.2.3 LBL脫色能力測(cè)定

參照CHEN等[10]的方法。將5塊直徑1 cm的菌絲瓊脂接種到100 mL LBL中，并取5塊同樣的空白瓊脂作為空白組。在黑暗中30 ℃、110 r/min搖瓶培養(yǎng)6 d，觀察顏色變化。

1.2.4 相關(guān)酶活力的測(cè)定

粗酶液的制備：將活化好的草菇菌絲33 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)8 d，取適量發(fā)酵液，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

濾紙酶(filter paper activity，F(xiàn)PA)和內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)活力的測(cè)定參照GHOSE[11]的方法；外切葡聚糖酶(exoglucanase，CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase activity，BGL)活力的測(cè)定參照孟建宇等[12]的方法；漆酶(laccase，Lac)活力的測(cè)定參照CHEN等[13]的方法；錳過氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)活力的測(cè)定參照BILAL等[14]的方法；半纖維素酶(hemicellulase，HMC)活力的測(cè)定參照崔堂武等[15]的方法；木聚糖酶(xylanase，Xyl)活力的測(cè)定參照韋赟等[16]的方法。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用Origin 2018軟件作圖，采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源對(duì)草菇氣生菌絲密度的影響

如圖1所示，隨著繼代次數(shù)的增加，對(duì)照組氣生菌絲密度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。更換培養(yǎng)基碳源后，甘露醇、海藻糖和蔗糖處理組的氣生菌絲密度均明顯大于對(duì)照組，可溶性淀粉、麥芽糖、果糖處理組小于對(duì)照組。

圖1 不同碳源對(duì)草菇氣生菌絲密度的影響
Fig.1 Effects of different carbon sources on the density of mycelium of V.volvacea

2.2 培養(yǎng)基碳源對(duì)草菇菌絲生長(zhǎng)速度和生物量的影響

如圖2所示，對(duì)照組和處理組的菌絲生長(zhǎng)速度和生物量的大小順序依次為：甘露醇>海藻糖>蔗糖>對(duì)照>可溶性淀粉>麥芽糖>果糖。在甘露醇處理組中，D0、D1、D2和D3的菌絲生長(zhǎng)速度較對(duì)照組分別提高了13.67%、14.17%、24.89%、11.50%；菌絲生物量較對(duì)照組分別提高了55.03%、53.79%、105.19%、59.26%。甘露醇對(duì)D2菌株的菌絲性狀恢復(fù)最好。初篩試驗(yàn)表明，甘露醇處理組的復(fù)壯效果最好，選擇甘露醇處理組對(duì)D0～D3作進(jìn)一步的研究。

A-甘露醇;B-海藻糖；C-蔗糖；D-可溶性淀粉；E-麥芽糖；F-果糖 a-菌絲生長(zhǎng)速度；b-菌絲生物量
圖2 不同碳源對(duì)草菇菌絲生長(zhǎng)速度及生物量的影響
Fig.2 Effects of different carbon sources on mycelium growth rate and biomass of V.volvacea

2.3 添加甘露醇對(duì)LBL脫色能力的影響

LBL脫色法可以一定程度上判斷菌絲的活力和菌種退化程度。如圖3所示，草菇菌株D0和D1的脫色能力較強(qiáng)，培養(yǎng)基顏色呈淡黃色；甘露醇處理組和對(duì)照組培養(yǎng)基顏色無明顯變化。D2的脫色能力下降，對(duì)照組培養(yǎng)基的顏色加深，甘露醇處理組的顏色可恢復(fù)到淡黃色。D3的脫色能力最差，對(duì)照組培養(yǎng)基的顏色呈現(xiàn)出深綠色；更換為甘露醇碳源后，脫色能力較對(duì)照組增強(qiáng)，但培養(yǎng)基的顏色未能恢復(fù)至淡黃色。

圖3 LBL脫色能力的變化
Fig.3 Change of decolorization ability of LBL

2.4 添加甘露醇對(duì)基質(zhì)降解酶活力的影響

2.4.1 纖維素降解相關(guān)酶活力的變化

如圖4所示，隨著繼代次數(shù)的增加，F(xiàn)PA、EG活力顯著降低，BGL、CBH活力沒有明顯變化。更換為甘露醇碳源后，D1～D3的FPA、EG活力均有顯著升高(P<0.05)，D1的酶活力分別提高了8.35%、11.74%，D2分別提高了62.26%和50.26%，D3分別提高了58.16%、57.08%。而BGL、CBH活力變化不顯著(P>0.05)。甘露醇處理組對(duì)D1～D3的FPA、EG活力的恢復(fù)效果較好。

2.4.2 木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力的變化

如圖5所示，隨著繼代次數(shù)的增加，Lac、MnP活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。更換為甘露醇碳源后，Lac、MnP活力除D1外均顯著提高(P<0.05)；D0分別提高了7.79%、17.08%，D2分別提高了35.68%、206.46%，D3分別提高了219.40%、291.72%。甘露醇處理組對(duì)D2、D3的木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力恢復(fù)效果較好。

2.4.3 半纖維素降解相關(guān)酶活力的變化

對(duì)D0～D3的半纖維素降解相關(guān)酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。隨著繼代次數(shù)的增加，HMC活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而Xyl活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。2種酶活力在甘露醇處理組和對(duì)照組之間均無顯著差異(P>0.05)。

a-FPA；b-BGL；c-EG；d-CBH
圖4 纖維素降解相關(guān)酶活力的變化
Fig.4 Changes in cellulose degradation-related enzymes activity 注：*代表同組內(nèi)有顯著性差異(P<0.05) (下同)

a-Lac；b-MnP
圖5 木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力的變化
Fig.5 Changes in lignin degradation-related enzymes activity

a-HMC；b-Xyl
圖6 半纖維素降解相關(guān)酶活力的變化
Fig.6 Changes in hemicellulose degradation-related enzymes activity

3 討論

MAGAE等[3]證實(shí)了金針菇退化菌株的LBL培養(yǎng)基脫色能力顯著低于正常菌株。林清泉等[17]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草退化菌株在LBL培養(yǎng)基上的脫色能力變?nèi)?。CHEN等[10]發(fā)現(xiàn)草菇菌絲體繼代菌株隨繼代次數(shù)的增加，其LBL脫色能力也隨之降低。本研究與之有相同結(jié)論。LBL培養(yǎng)基中通常以BTB作為指示劑，其在酸性環(huán)境中會(huì)變黃。在發(fā)酵過程中，菌株會(huì)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、氨基酸、CO2等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有高溶解度，并產(chǎn)生游離H+，使發(fā)酵液的pH降低。當(dāng)菌株發(fā)生退化時(shí)，菌株發(fā)酵代謝能力降低，發(fā)酵液pH值升高、顏色變深，脫色能力隨之降低[18]。本研究利用甘露醇代替PDA中的葡萄糖后，草菇退化菌株D2、D3的LBL脫色能力顯著增加(圖3)，表明D2、D3的發(fā)酵代謝能力得到有效恢復(fù)，甘露醇對(duì)草菇退化菌株有較好的復(fù)壯效果。

甘露醇是一種天然的六碳糖醇，易溶于水，廣泛存在于真菌的孢子、子實(shí)體和菌絲體中[19]。甘露醇在子囊菌和擔(dān)子菌中承擔(dān)著調(diào)節(jié)滲透壓、清除活性氧等重要的生物學(xué)功能[2]。PATEL等[20]發(fā)現(xiàn)甘露醇是良好的抗氧化劑，能保護(hù)真菌細(xì)胞免受活性氧侵害。WEINSTEIN等[21]發(fā)現(xiàn)嗜冷真菌Humicola marvinii中的甘露醇含量明顯增多，以幫助菌株抵御低溫脅迫。ZHAO等[2]發(fā)現(xiàn)，在草菇栽培中添加甘露醇可以增加子實(shí)體的低溫耐受性。本研究發(fā)現(xiàn)甘露醇對(duì)退化程度較輕的D1、D2菌株的復(fù)壯效果較好，多數(shù)指標(biāo)能基本達(dá)到D0水平；而對(duì)退化程度較重的D3菌株雖然也有一定的恢復(fù)作用，但無法恢復(fù)到D0狀態(tài)。

草菇是典型的草腐菌，栽培原料一般為廢棉、稻草和棉籽殼等，這些物質(zhì)的主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[22]。草菇分泌相關(guān)酶將這些基質(zhì)分解為小分子物質(zhì)，以滿足自身生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的需要[23]。纖維素的分解先由EG將長(zhǎng)鏈的纖維素裂解成較短的寡糖，再由CBH進(jìn)一步降解為纖維二糖，最后由BGL分解為D-葡萄糖[24]。半纖維素的主要成分為木聚糖，Xyl可以將長(zhǎng)鏈木聚糖水解成短鏈的低聚木糖，再進(jìn)一步降解為木糖等小分子[25]。木質(zhì)素的降解主要依賴于Lac和MnP，最終生成酚類單體等小分子化合物[22]。

本研究中以棉籽殼為基質(zhì)進(jìn)行相關(guān)酶活力的測(cè)定。結(jié)果表明，添加甘露醇為碳源后，草菇退化菌株D1～D3的FPA、EG活力顯著提高(圖4)，D2、D3的Lac和MnP活力顯著提高(圖5)?？赡苁怯捎诟事洞季哂休^高的抗氧化性和抗逆性[2]，有效清除了草菇退化菌株中積累的大量活性氧，從而使菌株分泌基質(zhì)降解酶的能力提高[26]，為草菇菌絲提供葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)了草菇菌絲生長(zhǎng)速度加快、氣生菌絲密度和菌絲生物量增加(圖7)。半纖維素通過共價(jià)鍵和氫鍵與木質(zhì)素分子緊密相連，將纖維素包裹在其中，只有當(dāng)木質(zhì)素被分解后，化學(xué)鍵斷裂，纖維素才能暴露出來，被進(jìn)一步酶解；木質(zhì)素的降解成為自然界碳循環(huán)的限速步驟[27]。而半纖維素對(duì)該過程沒有起到?jīng)Q定性作用且含量較低，對(duì)草菇菌絲作用不顯著，可能是半纖維素降解相關(guān)酶活力變化較小的原因。具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

圖7 外源添加甘露醇復(fù)壯草菇退化菌株的通路圖
Fig.7 Pathway diagram of exogenous addition of mannitol to rejuvenate degraded strains of V.volvacea