黃水芽胞桿菌抗逆性潛力挖掘及乙醇耐受機(jī)制分析

濃香型白酒是中國白酒典型代表之一，市場份額占全國白酒總量的70%以上[1]。根據(jù)GB/T 10781.1—2006 《濃香型白酒》，濃香型白酒以糧谷為原料，經(jīng)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，未添加食用酒精及非白酒發(fā)酵產(chǎn)生的呈香物質(zhì)，以已酸乙酯為主體復(fù)合香。微生物在白酒釀造過程中發(fā)揮重要作用，處于核心地位，能夠產(chǎn)生多種生物酶和香味成分及其前體物質(zhì)，參與淀粉糖化、酒精發(fā)酵、產(chǎn)酯生香等生化過程，對白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成具有重要作用[2]。

抗逆性是釀造微生物適應(yīng)白酒發(fā)酵過程、發(fā)揮功能特性的基礎(chǔ)。芽胞桿菌是白酒發(fā)酵過程中大曲、窖泥和酒醅中的優(yōu)勢類群，在大曲發(fā)酵的中后期開始大量繁殖，并成為優(yōu)勢種群。與其他微生物相比，芽胞桿菌除具有產(chǎn)生生物酶、氨基酸、風(fēng)味物質(zhì)等代謝物功能特性外，通常具有耐酸、耐鹽、耐高溫、耐膽鹽等顯著特征[3-4]，以適應(yīng)復(fù)雜多變的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境。黃水是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)濃香型大曲酒的副產(chǎn)物，為棕黃色黏稠液體，含有多種酸類、醇類等呈香味物質(zhì)以及經(jīng)過長期馴化的有益微生物[5]。實(shí)驗(yàn)室前期從四川省宜賓地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒的黃水樣品中分離到1株黃水芽胞桿菌(Bacillus aquiflavi)3H-10[6]，具有較好的產(chǎn)蛋白酶活力，可產(chǎn)生苯甲醛、正丁醇、已酸乙酯等多種代謝風(fēng)味物質(zhì)，且通過全基因組測序分析顯示，菌株在抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性方面風(fēng)險(xiǎn)較低。本研究對黃水芽胞桿菌3H-10進(jìn)一步開展乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等耐受性潛力挖掘，并結(jié)合菌種全基因組序列分析解析菌種潛在耐受機(jī)制，為該菌株應(yīng)用于濃香型白酒發(fā)酵的實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

本研究所用黃水芽胞桿菌3H-10分離自四川省宜賓地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵濃香型白酒的黃水樣品，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CICC 24755。菌種所使用的培養(yǎng)基為大豆酪蛋白(tryptic soy broth，TSB)培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂(tryptose soya agar，TSA)固體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與設(shè)備

無水乙醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；NaCl，西隴化工股份有限公司。

BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf微量可調(diào)移液器、5424R型臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；HG-50型高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；AC2-4S1型生物安全柜，新加坡Esco公司；FE20型pH計(jì)，梅特勒-托利多食品(上海)有限公司；2000型分光光度計(jì)，尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落接種到4 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)3 d后作為接種種子液。

1.2.2 乙醇耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結(jié)果。每個乙醇含量條件設(shè)置3個重復(fù)。以不接種的TSB液體培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.3 酸、堿耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于pH 2、4、6、8、10、12的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結(jié)果。每個pH條件設(shè)置3個重復(fù)。以不接種的TSB培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.4 NaCl耐受性測定

將種子液按1%接種量分別接種于NaCl質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160 g/L的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結(jié)果。每個NaCl質(zhì)量濃度條件設(shè)置3個重復(fù)。以不接種的TSB培養(yǎng)基作為空白對照。

1.2.5 溫度耐受性測定

取20 μL種子液接種至TSA固體培養(yǎng)基，分別置于4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌株生長情況，并記錄結(jié)果。每個溫度條件設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.6 基因功能注釋

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載黃水芽胞桿菌3H-10基因組序列(登錄號CP082780)，使用RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology, https://rast.nmpdr.org/)annotation server在線分析工具進(jìn)行基因功能注釋。其中，RAST注釋方案選擇“RASTtk”，并勾選“Automatically fix errors”選項(xiàng)，其余參數(shù)均使用默認(rèn)設(shè)置。

1.2.7 菌種乙醇代謝途徑KEGG分析

將下載的黃水芽胞桿菌3H-10基因組序列在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)在線網(wǎng)站[7]進(jìn)行代謝途徑分析，查找菌株乙醇代謝途徑及相關(guān)基因。

1.2.8 潛在乙醇耐受基因的靶向檢測

通過文獻(xiàn)檢測已報(bào)道的與乙醇耐受相關(guān)基因，并從NCBI nucleotide數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)基因序列，使用本地比對工具blastv2.2.21在基因組序列中進(jìn)行序列比對，定向檢測黃水芽胞桿菌3H-10基因組是否存在已報(bào)道的與乙醇耐受相關(guān)的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水芽胞桿菌3H-10對乙醇的耐受性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對乙醇的耐受范圍為0～4%，最適生長乙醇體積分?jǐn)?shù)為0，說明該菌株對乙醇有一定的耐受性。乙醇為半極性溶劑，其性能介于極性與非極性溶劑之間，對細(xì)胞的毒性主要表現(xiàn)為增加質(zhì)膜的流性，破壞膜蛋白的功能[8]。乙醇耐受性能夠維持菌體在乙醇脅迫下保持正常生長。黃水芽胞桿菌3H-10分離自濃香型白酒發(fā)酵過程的黃水樣品，后者富含醇類、酸類等呈香味物質(zhì)[5]，推測該菌株的乙醇耐受性是其與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果，有助于菌種在發(fā)酵過程中維持存活、生長繁殖并發(fā)揮功能特性。

2.2 黃水芽胞桿菌3H-10對酸、堿的耐受性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對酸堿的耐受范圍為pH 6.0～10.0，最適pH 8.0。在pH 1.0～5.0環(huán)境中生長、但pH>5.5時不能生長的微生物稱為嗜酸微生物；將最適生長pH>9.0的微生物稱為嗜堿微生物；將能在高pH條件下生長，但最適值并不在堿性pH范圍內(nèi)的微生物稱為耐堿菌[9]。黃水芽胞桿菌3H-10對堿性環(huán)境具有輕微耐受性。

2.3 黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl的耐受性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl的耐受范圍為0～20 g/L，最適生長NaCl質(zhì)量濃度為0 g/L。根據(jù)Kushner的分類原則，一般將最適生長NaCl濃度為0.5～2.5 mol/L、2.5～5.2 mol/L的微生物分別稱為中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌[10]。黃水芽胞桿菌3H-10對NaCl無顯著耐受性。

2.4 黃水芽胞桿菌3H-10對溫度的耐受性

試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃水芽胞桿菌3H-10對溫度的耐受范圍為20～45 ℃，最適生長溫度為37 ℃。通常最大生長溫度>50 ℃的微生物為嗜熱菌，將在溫度<10 ℃時才能生長的微生物為嗜冷菌[9]。黃水芽胞桿菌3H-10對溫度無顯著耐受性。

2.5 黃水芽胞桿菌3H-10基因注釋分析

使用RAST annotation server對菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組進(jìn)行注釋。結(jié)果顯示，該菌株基因組大小為3 806 094 bp，G+C含量為35.70 mol%，預(yù)測到4 097個蛋白質(zhì)編碼基因。蛋白質(zhì)編碼基因經(jīng)注釋可歸為27個類別(圖1)，其中與氨基酸及其衍生物，蛋白質(zhì)代謝，碳水化合物代謝，輔助因子、維生素、輔基和色素相關(guān)的基因較多，分別為331、215、172和166個，推測黃水芽胞桿菌3H-10對氨基酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物等基礎(chǔ)物質(zhì)的代謝能力較旺盛。其中，注釋到26個與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因，分別與氧化應(yīng)激、滲透調(diào)節(jié)、解毒和周質(zhì)壓力等相關(guān)。

圖1 利用RAST工具對黃水芽胞桿菌3H-10基因注釋的結(jié)果
Fig.1 Gene annotation result of B.aquiflavi 3H-10 with RAST

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃水芽胞桿菌3H-10基因組中含有15個熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因，可編碼產(chǎn)生HSP90、HSP20、HSP33、GroES、GroEL、ClpB、Hfq、CopZ、DnaJ和DnaK等HSP(表1)。

表1 菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組中的熱休克蛋白基因
Table 1 Genes encoding for heat shock proteins in the genome of B.aquiflavi 3H-10

HSP是生物受到環(huán)境中物理、化學(xué)和生物等刺激時發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的一類高度保守的糖蛋白，普遍存在于原核和真核生物中。生物體或組織受到應(yīng)激刺激后，需要度過一個絕對恢復(fù)期，細(xì)胞在此期間合成HSP，其后才能耐受應(yīng)激刺激，當(dāng)超出一定期限時，HSP便會失去保護(hù)作用[11]?？锼胤嫉?span id="hzcpr1e" class="superscript" tag="12" style="font-size: 0.6em; vertical-align: super; color: rgb(0, 153, 255);">[12]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)丙酮丁醇梭菌過量表達(dá)相應(yīng)編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白基因groESL、grpE和htpG時，重組菌的丁醇耐受性大大提高。MIAO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母的分子伴侶HSP 90、HSP70等相關(guān)基因在乙醇環(huán)境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。李偉麗等[14]通過將超嗜熱菌強(qiáng)烈火球菌的小分子HSP基因sHsp導(dǎo)入枯草芽胞桿菌中表達(dá)，使菌株對乙醇的耐受性顯著增強(qiáng)。黃水芽胞桿菌3H-10基因組中檢測到數(shù)量和種類較多的HSP編碼基因，這有利于菌株在乙醇等不良環(huán)境中維持細(xì)胞存活、生長繁殖并發(fā)揮功能。

2.6 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇代謝途徑分析

KEGG分析顯示，菌株黃水芽胞桿菌3H-10基因組中含有1個乙醇脫氫酶基因adh和3個乙醛脫氫酶基因aldh，分別編碼乙醇脫氫酶[(alcohol dehydrogenase，ADH), EC1.1.1.1]和乙醛脫氫酶[(aldehyde dehydrogenase，ALDH), EC.1.2.1.3]，組成較完整的乙醇脫氫酶系(圖2)。ADH和ALDH參與催化乙醇的分解代謝，乙醇通過ADH氧化成為乙醛，乙醛通過ALDH氧化成為乙酸，乙酸進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，最終氧化成CO2和水。其中，ADH是乙醇代謝的重要限速酶之一，一般為以氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)、氧化型輔酶II(NADP+)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)為輔酶的鋅金屬酶，具有廣泛的特異性，是許多有機(jī)體中短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，可逆催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應(yīng)的羧基化合物。ALDH是生物體內(nèi)用于降解乙醛的重要酶類，以NADP+為輔酶的含鋅類酶，催化包括乙醇在內(nèi)的某些物質(zhì)以及二級醇、醛和酮的脫氧反應(yīng)。ADH和ALDH廣泛存在于微生物、植物和動物體中，其代謝活性直接影響生物體內(nèi)乙醇的代謝，從而對生物體的生理狀態(tài)產(chǎn)生直接影響。鞠建松等[15]將假堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌中adh和aldh進(jìn)行克隆并異源表達(dá)，能夠較大程度提高宿主對乙醇的耐受性。此外，黃水芽胞桿菌3H-10基因組中還含有1個乙醛脫氫酶(EC1.2.1.10)，可催化乙醛生成乙酰輔酶A，后者進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，協(xié)助促使乙醇代謝，最終氧化成CO2和水。

圖2 黃水芽胞桿菌3H-10中的乙醇代謝途徑
Fig.2 The alcohol metabolism pathway in B.aquiflavi 3H-10

2.7 黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受相關(guān)基因的定向檢索

目前關(guān)于芽胞桿菌乙醇耐受性的研究仍相對較少，微生物類群以枯草芽胞桿菌[14-15]為主。具有乙醇耐受特性的微生物當(dāng)前主要集中在釀酒酵母[16-19]、大腸埃希氏菌[20-21]和惡臭假單胞菌[22]等，其耐受乙醇的機(jī)制主要包括：(1)提高糖類和氨基酸等轉(zhuǎn)運(yùn)能力；(2)利用排出泵將有機(jī)溶劑排出細(xì)胞；(3)合成和積累海藻糖與脯氨酸等，減少膜的滲透性改變；(4)合成氨基酸等。將相關(guān)基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示該菌株不含有這些基因(表2)。說明上述機(jī)制不是黃水芽胞桿菌3H-10耐受乙醇的主要原因。

表2 已報(bào)道的乙醇耐受相關(guān)基因在黃水芽胞桿菌3H-10基因組中的檢測結(jié)果
Table 2 The detection result of reported genes related with alcohol tolerance in the genome of B.aquiflavi 3H-10

芽胞桿菌作為白酒發(fā)酵過程中的重要微生物類群往往對乙醇等極端環(huán)境具有一定耐受性，對其機(jī)制的研究能夠?yàn)榫陸?yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，值得深入探討。本研究首次對我國四川省宜賓地區(qū)首株釀酒微生物新種菌株黃水芽胞桿菌3H-10乙醇耐受機(jī)制進(jìn)行解析，為后續(xù)相關(guān)研究提供了參考。

3 結(jié)論

黃水芽胞桿菌3H-10是從濃香型白酒發(fā)酵樣品黃水中分離的1株芽胞桿菌，具有顯著的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力，在抗生素耐藥性、產(chǎn)毒與致病性方面安全性風(fēng)險(xiǎn)較低，在白酒發(fā)酵過程中具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。本文從乙醇、酸、堿、NaCl和溫度等方面對黃水芽胞桿菌3H-10的抗逆性潛力進(jìn)行挖掘，并探究其抗逆性潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，菌株可在4%乙醇環(huán)境生長，對乙醇具有一定耐受性?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)，菌株含有數(shù)量較多的HSP編碼基因，可通過應(yīng)激反應(yīng)減弱乙醇對細(xì)胞的毒害作用；菌株基因組中含有完整的乙醇代謝途徑相關(guān)基因，可將乙醇依次氧化生成乙醛、乙酸，后者進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，最終生成CO2和水。因此，豐富的HSP和完整的乙醇代謝途徑是黃水芽胞桿菌3H-10耐受乙醇的主要原因。研究為黃水芽胞桿菌3H-10應(yīng)用于濃香型白酒發(fā)酵的實(shí)際生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。