維生素B5對出芽短梗霉產(chǎn)普魯蘭多糖的影響

普魯蘭多糖是一種由酵母樣真菌出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)在深層發(fā)酵中以無定形黏液的形式，需氧狀態(tài)下產(chǎn)生的微生物胞外多糖，它是一種線性葡聚糖，由α-1，4糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位，經(jīng)α-1，6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖[1]。普魯蘭多糖是可食用和可生物降解的，還具有高保濕性能，限制水分遷移等作用[2]，通常用作低熱量食品添加劑、膠囊、黏合劑、增稠劑和延伸劑等。低分子質(zhì)量的多糖由于其在生物組織中的高擴散性而比高分子質(zhì)量的多糖更具優(yōu)勢[3]。而高分子質(zhì)量的普魯蘭多糖因其具有較高黏度而有很高的價值，在食品、制藥和化妝品等行業(yè)的應(yīng)用較廣，因此可將其制成微丸、不透氧膜、藥物膠囊等[4-6]。目前對普魯蘭多糖的研究還集中在其生產(chǎn)方面，如菌株和發(fā)酵工藝的優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件等因素均能影響普魯蘭多糖生產(chǎn)[7-9]。普魯蘭多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量是決定聚合物收率和特性的重要參數(shù)[10]。而普魯蘭多糖硬膠囊主要是由平均分子質(zhì)量為1.0×105～2.0×105 Da的商業(yè)普魯蘭制造的[4]，因此，在提高產(chǎn)量的同時進行分子質(zhì)量的調(diào)控具有一定的意義。

維生素B5又稱遍多酸或泛酸，是一種水溶性維生素，它是能量代謝所必需的微量營養(yǎng)素，且是合成輔酶A和?；d體蛋白的關(guān)鍵前體，輔酶A對脂肪酸代謝和檸檬酸循環(huán)至關(guān)重要[11]。EDWARDS等[12]在酵母發(fā)酵過程中添加了維生素B5從而增加H2S的生成。SLYSHENKOV等[13]在研究人類淋巴母細胞增加的機制時發(fā)現(xiàn)，將泛酸用于人淋巴母細胞培養(yǎng)時會大大增加谷胱甘肽的含量。

本研究通過在培養(yǎng)基中添加維生素B5，探討其對普魯蘭多糖的產(chǎn)量和分子質(zhì)量的影響。對發(fā)酵過程中關(guān)鍵酶活性進行測定，并對發(fā)酵前期(24 h)和后期(84 h)兩個時間點鑒定出的差異蛋白進行生物學(xué)分析，目的在于了解維生素B5對普魯蘭合成的影響，為出芽短梗霉合成普魯蘭的機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC NO.7055。

1.1.2 主要試劑

蔗糖、(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl、K2HPO4、酵母浸粉、牛肉粉，所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

α-淀粉酶活性測定試劑盒(G0510F)、普魯蘭酶活性測定試劑盒(G0578F)、磷酸葡萄糖變位酶試劑盒(G0563F)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶試劑盒(G0535F)，蘇州格瑞思生物科技有限公司；真菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(JL49526)，上海將來實業(yè)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

08-F25型5 L自動發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A型高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；5977B-7890B氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國安捷倫科技有限公司；LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖100，酵母浸粉3，(NH4)2SO4 1，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 2.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，以6.0 mol/L HCl及6.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 150，牛肉粉 5，K2HPO4 7，MgSO4·7H2O 0.4，NaCl 3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，以6.0 mol/L HCl及6.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

其中，實驗組是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 g/L的維生素B5。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取4 ℃冰箱中保存待用的新鮮斜面于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中活化2 h，然后從中挑取1環(huán)孢子接入種子培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)20～22 h，制得種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以6%體積分數(shù)的接種量，將種子液接種至裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在180 r/min搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵前24 h溫度維持在32 ℃，后64 h溫度調(diào)節(jié)為28 ℃。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：按照6%體積分數(shù)的接種量，將種子液接入到5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中，發(fā)酵前24 h溫度維持在32 ℃，后72 h溫度調(diào)節(jié)為28 ℃，罐壓恒定在0.02 MPa，通風(fēng)比為1∶1.25(體積比)，初始pH 6.0，轉(zhuǎn)速400 r/min，培養(yǎng)周期96 h。

1.2.3 指標測定

細胞干重及普魯蘭產(chǎn)量的測定方法參照文獻[14]。參照文獻[15]的方法測定普魯蘭分子質(zhì)量。磷酸葡萄糖變位酶(glucose phosphate mutase，PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGP)、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)、α-淀粉酶和普魯蘭酶的活性用試劑盒測定。

1.2.4 出芽短梗霉蛋白質(zhì)組學(xué)

取適量84 h的發(fā)酵液于2.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，棄上清液留菌體。然后將菌體用PBS重懸，10 000 r/min下精準快速離心10 min，此操作重復(fù)3次，最后將菌體用液氮速凍10 min，保存至-80 ℃下備用。取1管樣品液氮研磨，然后加入8 mol/L尿素(50∶1體積比加入蛋白酶抑制劑)超聲2 s,停2 s，共2 min。14 000 r/min離心20 min，取上清液，分裝，留取10 μL定量，其余凍入-80 ℃。

酶解脫鹽及質(zhì)譜色譜條件參照文獻[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)為3組平行樣品計算結(jié)果的平均值。Origin 2019b軟件作圖。GO和KEGG的注釋用Uniprot的Yeast注釋數(shù)據(jù)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B5對普魯蘭合成的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，不同濃度維生素B5對出芽短梗霉細胞生長和普魯蘭合成的影響如圖1所示。

圖1 不同梯度濃度維生素B5對普魯蘭發(fā)酵的影響
Fig.1 Effect of different gradient concentrations of vitamin B5 on pullulan fermentation

維生素B5的添加提高了普魯蘭產(chǎn)量和菌體量，降低了黏度和普魯蘭的重均分子質(zhì)量。當維生素B5添加量為0.2 g/L時，普魯蘭產(chǎn)量達到最大值92.57 g/L，比對照提高了8.82%，單位菌體產(chǎn)量也從3.34 g/L提高到3.41 g/L；而普魯蘭多糖的重均分子質(zhì)量在此濃度下最低，比對照降低了50.20%。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)基中維生素B5的存在有利于普魯蘭多糖產(chǎn)量的提高，同時能降低它的重均分子質(zhì)量。

2.2 發(fā)酵罐驗證維生素B5對普魯蘭多糖的影響

在5 L發(fā)酵罐中對出芽短梗霉進行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測了0.2 g/L維生素B5和對照條件下的菌體量、分子質(zhì)量和普魯蘭多糖合成情況。通過圖2分析可知，0～12 h內(nèi)，對照組和實驗組的菌體量一致，24 h以后，對照組和實驗組的菌體量開始出現(xiàn)變化，維生素B5的添加刺激了出芽短梗霉的生長，同時普魯蘭的產(chǎn)量由對照組的87.3 g/L提高至實驗組的102 g/L,產(chǎn)量增加了16.8%。單位菌體產(chǎn)量也從5.45 g/L提高到5.9 g/L，在維生素B5存在的情況下，普魯蘭最終重均分子質(zhì)量由對照組的2.14×102 kDa下降到實驗組的1.11×102 kDa,降幅為48.2%。分子質(zhì)量在發(fā)酵的早期達到最大值，隨著發(fā)酵的進行逐漸降低，與AN等[17]研究的結(jié)果一致。這可能是因為在培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中分泌的普魯蘭酶和α-淀粉酶導(dǎo)致了普魯蘭多糖的分子質(zhì)量在生長后期顯著降低[18]。

a-菌體量；b-普魯蘭產(chǎn)量；c-重均分子質(zhì)量
圖2 添加維生素B5對普魯蘭多糖發(fā)酵的影響
Fig.2 Effect of adding vitamin B5 on pullulan fermentation

2.3 普魯蘭多糖生物合成和降解中關(guān)鍵酶的活性

由圖3可知，在出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭過程中，與空白組相比，實驗組的PGM、UGP和GTF都有所提高，關(guān)鍵酶活性的增強從而使得多糖合成有所加強。

a-磷酸葡萄糖變位酶活性；b-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性；c-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性；d-α-淀粉酶活性；e-普魯蘭酶活性
圖3 普魯蘭多糖生物合成和降解過程中關(guān)鍵酶活性
Fig.3 Key enzyme activities in the biosynthesis and degradation of pullulan

而對于實驗組分子質(zhì)量大幅度的降低，實驗測定了發(fā)酵過程中α-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性的變化趨勢，α-淀粉酶隨著發(fā)酵的進行活性也在增大，實驗組任意時間點的α-淀粉酶活性均大于空白組。發(fā)酵前中期并未檢測到普魯蘭酶活性，可能是由于活性太低或者發(fā)酵前中期沒有普魯蘭酶的合成，在發(fā)酵后期72 h和發(fā)酵末期96 h，實驗組的普魯蘭酶活性均大于空白組。因此可以推斷，實驗組中維生素B5的添加使得重均分子質(zhì)量的降低可能是由于胞內(nèi)α-淀粉酶和普魯蘭酶活性的增強。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.4.1 差異表達蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計分析結(jié)果

按照表達倍數(shù)變化1.5倍以上的標準篩選差異表達蛋白質(zhì)，結(jié)果如表1所示，出芽短梗霉發(fā)酵合成普魯蘭多糖的過程中，前期(24 h)和后期(84 h)實驗組與對照組相比分別鑒定出差異蛋白387和381種。

表1 差異蛋白質(zhì)定量結(jié)果統(tǒng)計
Table 1 Statistics of protein quantification results

2.4.2 差異表達蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計分析結(jié)果

采用層次聚類算法對比較組的差異表達蛋白質(zhì)分別進行聚類分析，如圖4所示。紅色代表上調(diào)蛋白，藍色代表下調(diào)蛋白，顏色越深表示差異越加明顯。其中主要差異蛋白變化情況如表2所示。

1-對照組；2-實驗組
圖4 全局分析聚類熱圖
Fig.4 Global analysis cluster heat map

表2 差異蛋白結(jié)果統(tǒng)計
Table 2 Differential proteins statistics

2.4.3 差異表達蛋白質(zhì)標準化分類體系功能富集分析

差異表達蛋白質(zhì)標準化分類體系，它從生物學(xué)的3個方面對蛋白質(zhì)功能進行分類，即細胞組分、分子功能和生物過程。通過對不同時間點(24和84 h)實驗組和對照組差異蛋白的GO功能富集分析，結(jié)果如圖5所示。

發(fā)酵前期(24 h)差異蛋白GO功能富集分析顯示，實驗組與對照組差異蛋白主要參與核糖體生物起源、甾醇生物合成的過程、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄、RNA轉(zhuǎn)錄tRNA和RNA聚合酶的終止等生物過程。富集到的差異蛋白主要定位到出芽短梗霉細胞膜的組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核質(zhì)和核糖體等位置。差異蛋白在分子功能上主要體現(xiàn)在Zn2+結(jié)合、蛋白酶活性、RNA聚合酶Ⅰ活性、大核糖體亞基rRNA及核酸結(jié)合。發(fā)酵后期(84 h)實驗組與對照組差異蛋白所參與的生物過程主要是麥角固醇的生物合成過程、核糖體生物起源、RNA聚合體的轉(zhuǎn)錄、核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解代謝過程及組氨酸生物合成的過程。富集到的差異蛋白主要定位到出芽短梗霉細胞的膜的組成部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核糖體等位置上。這與24 h差異蛋白在細胞組分上的定位一致。差異蛋白在分子功能上主要體現(xiàn)在Zn2+結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA聚合酶I活性等。

a-24 h;b-84 h
圖5 24 h和84 h差異蛋白GO功能富集分析
Fig.5 24 h,84 h differential protein GO terms enrichment analysis

2.4.4 差異表達蛋白質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

通過對鑒定出來的差異蛋白進行KEGG功能注釋，將其按照所屬的不同代謝途徑進行功能分類。并對不同途徑中富集到的蛋白數(shù)目進行統(tǒng)計，按照蛋白統(tǒng)計數(shù)目排列出前20的代謝通路，統(tǒng)計注釋結(jié)果如圖6所示。

a-24 h;b-84 h
圖6 24 h和84 h差異蛋白KEGG通路富集度分析
Fig.6 24 h,84 h differential protein KEGG pathway enrichment analysis

發(fā)酵前期(24 h)差異蛋白參與的代謝通路主要有類固醇生物合成、甘油肌醇代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、不飽和脂肪酸的生物合成、組氨酸代謝、β-丙氨酸代謝及磷酸肌醇代謝。發(fā)酵后期(84 h)差異蛋白主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、磷酸肌醇代謝、類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、果糖和甘露糖代謝、組氨酸代謝、精氨酸生物合成及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等途徑。由此可見，實驗組中維生素B5的存在，影響了發(fā)酵過程中碳代謝、氨基酸代謝及脂肪酸代謝，這些均可能與普魯蘭多糖產(chǎn)量和重均分子質(zhì)量的變化有關(guān)。

2.4.5 差異蛋白代謝途徑分析

有學(xué)者提出了一種通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝圖的基因重要性確定代謝途徑的活性和方向性的方法[19]。因此，根據(jù)篩選出的主要差異蛋白質(zhì)，結(jié)合KEGG通路和關(guān)鍵酶活性的測定分析了差異蛋白對代謝途徑的影響，同時結(jié)合LIU等[20-21]的研究并繪制了差異蛋白對出芽短梗霉代謝途徑影響圖，如圖7所示。

己糖激酶是參與糖酵解、果糖和甘露糖代謝中的酶[22]，同時也是普魯蘭多糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。在糖酵解中，己糖激酶是參與α-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成β-D-6-磷酸葡萄糖的酶[22]，實驗組中檢測到己糖激酶相關(guān)蛋白表達量的提高，促使更多的α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-6-磷酸葡萄糖合成，從而加強了普魯蘭的合成過程及三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)的進行。在果糖和甘露糖代謝中，己糖激酶可以促進D-甘露糖轉(zhuǎn)化成D-6-磷酸甘露糖，而D-6-磷酸甘露糖又將生成β-D-6-磷酸葡萄糖進入普魯蘭多糖合成的主途徑中，因此，己糖激酶表達量的提高有利于普魯蘭多糖的合成。

圖7 維生素B5引起的差異蛋白對出芽短梗霉代謝途徑的影響
Fig.7 Effect of differential protein caused by vitamin B5 on the metabolic pathway of A.pullulans

在戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化途徑中，木糖還原酶表達量的下降抑制了D-木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，因此更多的D-木糖向著丙酮酸轉(zhuǎn)換，丙酮酸最終進入TCA循環(huán)為發(fā)酵提供大量能量。

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶是連接氨基酸代謝和碳水化合物代謝的關(guān)鍵代謝酶，并且通過參與天冬氨酸/蘋果酸穿梭將產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移到線粒體[23]。在丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝途徑中，丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶表達量的上調(diào)促使L-丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸，而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸合酶表達量的下調(diào)，抑制草酰乙酸與L-天冬氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化及α-酮戊二酸合成谷氨酸。而TCA循環(huán)是許多合成代謝和分解代謝途徑整合的重要紐帶，它被認為是能量代謝的核心過程[24]。丙酮酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸含量的提高，加強了TCA循環(huán)，從而為出芽短梗霉菌體的生長和普魯蘭多糖的合成提高更多的能量。

在甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝途徑中，蘇氨酸可以轉(zhuǎn)化為甘氨酸，甘氨酸又可以轉(zhuǎn)化為絲氨酸，最后由絲氨酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，蘇氨酸醛縮酶表達量的提高增強了蘇氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸途徑，而L-絲氨酸裂解酶表達量的提高使更多的絲氨酸向著丙酮酸方向進行。

在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解中，纈氨酸進入TCA循環(huán)是通過轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A，琥珀酰輔酶A會進一步的合成琥珀酸，而琥珀酸是TCA循環(huán)中必不可少的物質(zhì)，醛脫氫酶表達量的提高加強了纈氨酸的降解，促進了琥珀酰輔酶A的生成，使TCA循環(huán)更加高效的進行。

在磷酸肌醇代謝中，α-D-6-磷酸葡萄糖是合成肌醇的出發(fā)物質(zhì)，同時也是普魯蘭多糖合成路徑中的關(guān)鍵物質(zhì)，肌醇磷酸合成酶是α-D-6-磷酸葡萄糖合成肌醇過程中的酶，其表達量的下降減弱了磷酸肌醇代謝，同時也保證了α-D-6-磷酸葡萄糖維持在較高的水平參與到普魯蘭多糖的合成途徑中去。

檸檬酸也是TCA循環(huán)中必不可少的物質(zhì)，由草酰乙酸合成檸檬酸的過程中，檸檬酸合酶表達量的提高及前面分析得到的乙酰輔酶A的增強，可以增大檸檬酸的含量并加速TCA循環(huán)的進行。

維生素B5使PGM、UGP、GTF、α-淀粉酶和普魯蘭酶活性的提高，有利于向普魯蘭多糖合成的方向進行，最終使其產(chǎn)量提高。而在α-淀粉酶和普魯蘭酶的作用下，高分子質(zhì)量的普魯蘭多糖被分解，從而降低了普魯蘭多糖的分子質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

本研究考察了維生素B5在普魯蘭生物合成中的作用，采用非標記定量技術(shù)對出芽短梗霉進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比，0.2 g/L維生素B5顯著提高了普魯蘭多糖的產(chǎn)量和菌體量，同時顯著降低了它的重均分子質(zhì)量。而添加維生素B5的實驗組PGM、UGP、GTF、α-淀粉酶和普魯蘭酶活性都有所提高。發(fā)酵前期(24 h)共篩選出387個差異蛋白，包括196個上調(diào)蛋白和191個下調(diào)蛋白，發(fā)現(xiàn)后期(84 h)共篩選出381個差異蛋白，其中包括182個上調(diào)蛋白和199個下調(diào)蛋白。通過對這些差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)維生素B5影響了參與發(fā)酵過程中碳代謝、氨基酸代謝及脂肪酸代謝等，最終在提高了普魯蘭產(chǎn)量的同時降低了普魯蘭的分子質(zhì)量。研究結(jié)果有助于理解維生素B5在普魯蘭生物合成中的作用機制，同時也為出芽短梗霉合成普魯蘭的機理研究提供了參考。