代謝工程改造嘌呤合成途徑以提高核黃素產量

核黃素，又名維生素B2，是人和哺乳動物生長必不可少的一種營養(yǎng)物質，在生物體內參與多種氧化還原反應，尤其在作為黃素酶類的輔酶參與細胞中傳遞氫的相關代謝中起到了重要作用[1]。核黃素轉化為活性形式：黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸可以參與促進生物體內碳水化合物的合成、脂肪酸代謝以及呼吸電子鏈傳遞[2]。由于哺乳動物自身不能合成核黃素，因而其在飼料行業(yè)、食品醫(yī)藥行業(yè)中都著有廣泛的應用[3-4]。

鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate, GTP)是核黃素生物合成的直接前體[5]，它既可以以糖和氨基酸為底料進行從頭合成，也可以利用嘌呤堿為前體進行補救合成。嘌呤從頭合成途徑將戊糖磷酸途徑生成的5-磷酸核糖最終轉化成GTP和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。以合成GTP為例，其主要可以分為嘌呤操縱子催化5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate，PRPP)生成肌苷酸(inosincacid,inosinemonphosphate，IMP)，以及IMP催化生成GTP兩個階段。發(fā)酵過程中添加GTP可以提高核黃素產量[6-7]，證明嘌呤前體的有效供應對核黃素的生產至關重要。并且利用代謝工程策略增強GTP的合成也已有很多報道[8-10]。

本文選用的核黃素高產菌株S1在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵52 h，核黃素產量可達27 g/L。在此基礎上利用基于CRISPR/Cas9的堿基編輯器失活嘌呤操縱子阻遏蛋白基因以及鳥嘌呤核苷酸(guanylate,GMP)還原酶來分別提高GTP合成中2個階段的通量。另一方面嘗試過表達GMP到2,5-二氨基-6-(5-磷酸-D-核糖氨基)嘧啶-4(3H)酮(DARPP)合成途徑的基因以增強GTP的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與質粒

論文中涉及的菌株見表1，質粒見表2。

表1 本實驗所用菌株
Table 1 Strains used in this study

表2 本實驗所用質粒
Table 2 plasmids used in this study

1.1.2 引物

本實驗所涉及的基因序列均來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用SnapGene設計所用引物，由金唯智生物公司合成(表3)。

表3 本實驗所用引物
Table 3 Primers used in this study

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 10；滅菌前用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

SX培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl 5；滅菌前用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基YP(g/L)：玉米漿干粉5，蔗糖10、硫酸鎂5，酵母抽提物5，K2HPO4 3，KH2PO4 2，滅菌前用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。

補料培養(yǎng)基(g/L)：一水葡萄糖720，玉米漿干粉15，KH2PO4 0.3，滅菌前用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.2,115 ℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器與設備

GET3XG三槽獨立梯度基因擴增儀，杭州柏恒科技有限公司；水平電泳儀，北京市六一儀器廠；94-Z水平搖床，寧波新芝生物科技股份有限公司；V-1600可見分光光度儀，上海美譜達儀器有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀，山東生物傳感器重點實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 嘌呤合成途徑基因過表達及失活菌株的構建

1.2.1.1 質粒構建

以SG質粒為例，以pHP13-spe-PvegI-mcherry質粒為模板，用引物pHP131、PvegI-2擴增含壯觀霉素抗性基因以及PvegI啟動子的pHP13質粒骨架，以B.subtilis 168基因組為模板，用引物UP-gmk、DN-gmk擴增gmk基因片段，將擴增出來的2個片段用Gibson試劑盒兩片段連接，化學轉化DH5α后，挑取長出的菌落用CXPHP131、CXPHP132引物進行驗證，正確的轉化子大小為1 293 bp，驗證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～17 h提取質粒。

1.2.1.2 嘌呤合成途徑基因過表達

向目的菌株中用電轉化[11]的方法轉入相應基因的過表達質粒，以終質量濃度為150 μg/mL的壯觀霉素進行篩選獲得正確的轉化子后保藏。

1.2.1.3 堿基編輯器質粒的構建及嘌呤合成途徑基因失活

堿基編輯器失活guaC和purR的質?；趯嶒炇抑袠嫿ǖ膲A基編輯器質粒pHP13-spe-dcas9。質粒以pHP13為骨架包含復制起始位點Puc ori，復制蛋白Pep pTA1060，壯觀霉素抗性基因spe。其余部分包括乳糖/IPTG誘導的阻遏蛋白基因lacI，PgraC啟動子表達dcas9及脫氨酶(adenosine deaminase，AID)，其中dcas9缺失終止密碼子，PvegI啟動子連接僅缺少N20的向導RNA。在插入N20序列時，首先需要找到相應基因序列前中段合適的NGG序列，NGG序列上游20 bp為N20序列，由于在NGG上游15～20 bp更容易利用堿基編輯器發(fā)生編輯，所以在NGG上游15～20 bp尋找使C變?yōu)門而產生終止密碼子的突變，設計N20以構建質粒。以PDC質粒為例，以pHP13-spe-dcas9質粒為模板，用引物UP-dcas9-guaC、DN-dacs9擴增片段1，用引物UP-dac9、DN-dcas9-guaC擴增片段2，將擴增出來的2個片段用Gibson試劑盒兩片段連接，化學轉化DH5α后，挑取長出的菌落用CX13 spe2、CXJF2引物進行驗證，正確的轉化子大小為624 bp，驗證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～17 h后提取質粒。

向目的菌株中用電轉化的方法轉入相應基因的堿基編輯器質粒，以終質量濃度為150 μg/mL的壯觀霉素進行篩選獲得正確的轉化子后，進行傳代培養(yǎng)使目的位點發(fā)生編輯并且使質粒丟失，影印后對質粒丟失的菌進行測序，得到相應密碼子突變成終止密碼子的菌株進行保藏。

1.2.2 核黃素濃度的測定

取500 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP(eppendorf)管中，用0.1 mol/L NaOH溶液稀釋適宜倍數(shù)，避光堿溶20 min取出，12 000 r/min離心1 min，取上清液用分光光度計檢測444 nm處的吸光度值，以確定核黃素的濃度[12]。

1.2.3 殘?zhí)菧y定

取500 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數(shù)后，用進樣針取樣，用生物傳感分析儀對樣品的殘?zhí)沁M行檢測。

1.2.4 蔗糖測定

取200 μL發(fā)酵液樣品于1.5 mL EP管中，加入200 μL配制好的2 mol/L H2SO4溶液，于60 ℃水浴鍋中水解30 min，加入4 mol/L NaOH溶液200 μL進行中和，12 000 r/min離心1 min，取上清液用無菌水稀釋適宜倍數(shù)，用生物傳感分析儀對樣品水解后的葡萄糖進行檢測，蔗糖的濃度為測得的葡萄糖濃度的2倍。

1.2.5 搖瓶補料發(fā)酵驗證

從-80 ℃凍存管中取3 μL菌液于含有1 mL無菌水的EP管中，10倍稀釋后混勻，取3 μL涂布SX平板，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取直徑5～6 mm的1個單菌落接種2支固體試管SX含相應抗性的斜面培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用1 mL YP培養(yǎng)基清洗下一支斜面上的所有菌苔于2 mL EP管中，混勻，取300 μL菌液分別接種于含有80 mL YP培養(yǎng)基的500 mL瓶底有擋板的三角瓶中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)41 h。培養(yǎng)過程中分別在11和23 h加入補料培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵。

2 結果與分析

2.1 嘌呤合成途徑基因失活及補料發(fā)酵驗證

根據(jù)文獻報道，purR基因編碼嘌呤合成途徑的阻遏蛋白PurR，敲除purR基因可使嘌呤合成途徑基因轉錄水平大幅提升[13-14]：guaC基因為嘌呤合成途徑GMP還原酶編碼基因，敲除guaC基因[15]可阻斷GMP到IMP的合成，從而使GMP得到一定的積累，間接提高核黃素的產量。因此對這2個基因用CRISPER/Cas9介導的基因組堿基編輯器技術進行失活[16-17]，分別得到菌株SDR和SDC，并對這2個菌株進行補料發(fā)酵驗證。

由圖1-b可知，嘌呤合成途徑的阻遏蛋白purR堿基編輯器失活后核黃素產量從2.81降至2.68 g/L，證明高產菌S1中嘌呤合成途徑由PRPP到IMP部分基因轉錄水平滿足核黃素的合成，不是該途徑中的限速步驟；而嘌呤合成途徑的回補途徑基因guaC堿基編輯器失活后，阻斷了GMP到IMP的合成，核黃素產量由2.81 g/L提升至3.04 g/L，產量提升8%。41 h時S1菌以及SDR菌葡萄糖有少量剩余，SDC菌葡萄糖剩余2.67 g/L(圖1-c)，17 h時搖瓶內蔗糖已耗盡。SDC菌株核黃素轉化率由S1菌株1 g糖(0.392 g蔗糖、0.608 g葡萄糖)產0.027 5 g核黃素提高至1 g糖(0.399 g蔗糖、0.601 g葡萄糖)產0.030 3 g核黃素，轉化率提升10.2%。

a-最大OD600測定值；b-發(fā)酵結束核黃素終產量；c-補糖前葡萄糖測定
圖1 失活基因搖瓶補料發(fā)酵
Fig.1 Feeding fermentation of inactivated gene in shake flask

2.2 嘌呤合成途徑基因過表達

以上實驗表明guaC基因失活使產量有所增加，推測GMP的供給并沒有達到飽和?；诖送普?，嘗試將gmk和ndk基因進行過表達(gmk編碼鳥苷酸激酶，催化GMP生成GDP，ndk編碼核苷二磷酸激酶，催化GDP生成GTP)，期望通過增加GMP的消耗拉動IMP向GMP的轉化過程。因此對這2個基因以pHP13為質粒骨架，PvegI為啟動子構建質粒PG和PN，電轉化進S1菌株，分別得到菌株SG和SN，并且用攜帶不含啟動子及目的基因的空載質粒S1-空菌株作為對照，進行補料發(fā)酵驗證。

由圖2-a可知，過表達gmk及ndk后對菌株生長無明顯影響。圖2-b為核黃素終產量，與對照菌株S1-空相比，SG菌株及SN菌株產量無明顯提高，41 h時葡萄糖無剩余(圖2-c)，17 h時搖瓶內蔗糖已耗盡。這說明單獨表達這2個基因并沒有拉動GMP的合成，而GTP進入核黃素合成途徑可能是更關鍵的反應。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結束核黃素終產量;c-補糖前葡萄糖測定
圖2 gmk、ndk基因過表達搖瓶補料發(fā)酵
Fig.2 Feeding fermentation of overexpression of gmk and ndk genes in shake flask

2.3 ribA基因異源引入及過表達

根據(jù)文獻報道以及BRENDA數(shù)據(jù)庫(https://www.brenda-enzymes.info/index.php)查詢得到枯草自身RibA雙功能酶(EC 3.5.4.25及EC 4.1.99.12)，但該酶無法將2個酶的功能拆分，為了將GTP環(huán)水解酶II單獨過表達，查找到希瓦氏菌來源的ribA(EC 4.1.99.12)。以pHP13為質粒骨架，以PvegI及Pr為啟動子分別對希瓦氏菌ribA基因進行過表達，構建質粒PSA和PRA，電轉化進S1菌株，分別得到菌株SSA和SRA，用含空載質粒的S1-空菌株作為對照，進行補料發(fā)酵驗證。

圖3-a可知，S1-空菌株最大OD600為32.2，SSA及SRA菌株最大OD600有不同程度的下降，分別為30.2和23.3。表明希瓦氏菌ribA的表達對菌的生長產生一定的影響，可能與GTP在GTP環(huán)水解酶II催化下產生的DARPP具有一定的細胞毒性有關。而Pr啟動子表達強度強于PvegI啟動子，對菌的生長抑制也表現(xiàn)的較為明顯，導致核黃素產量下降。圖3-b為發(fā)酵結束時核黃素終產量，SSA菌產量提升至3.33 g/L，并且發(fā)酵結束搖瓶中仍有4.6 g/L的葡萄糖剩余。而SRA菌產量則明顯下降至2.69 g/L，耗糖進一步減少，發(fā)酵結束搖瓶中葡萄糖剩余18.4 g/L(圖3-c)，17 h時搖瓶內蔗糖已耗盡。SSA菌株核黃素轉化率為1 g糖(0.407 g蔗糖、0.593 g葡萄糖)產0.033 8 g核黃素，轉化率較S1提升22.9%。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結束核黃素終產量;c-補糖前葡萄糖測定
圖3 異源引入基因搖瓶補料發(fā)酵
Fig.3 Feeding fermentation of heterologous introduction of genes in shake flask

2.4 guaC基因失活及ribA基因過表達組合驗證

由以上實驗可知，失活guaC基因可以提高GMP的供給，PvegI啟動子過表達希瓦氏菌來源的ribA基因可以加快GTP的利用，從而拉動嘌呤途徑產物的合成使核黃素產量增加，并且認為這2種效果是可以疊加的。于是在失活guaC基因的SDC菌中分別轉入PSA質粒以及PRA質粒，得到菌株SDCA和SDCR，并將pHP13-spe空載質粒轉入SDC菌中得到菌株SDCS，用SDCS菌株作為對照，進行補料發(fā)酵驗證。

圖4-a表明，搖瓶補料發(fā)酵時Pr啟動子表達希瓦氏菌來源ribA在SDC菌中仍會抑制生長。SDCA菌株產量進一步提升，達到3.43 g/L，相較于SDCS菌產量提高9.2%，相較于初始菌株S1產量提升21.7%(圖4-b)；并且SDCA菌耗糖也有所減少，發(fā)酵結束時搖瓶中剩余葡萄糖3.87 g/L。SDCS菌發(fā)酵結束時沒有葡萄糖剩余(圖4-c)，SDCA菌株轉化率為1 g糖(0.404 g蔗糖、0.596 g葡萄糖)產0.034 6 g核黃素，較S1菌株提升25.8%，具有一定的工業(yè)生產應用價值。

a-最大OD600測定值;b-發(fā)酵結束核黃素終產量;c-補糖前葡萄糖測定
圖4 組合基因搖瓶補料發(fā)酵
Fig.4 Feeding fermentation of combined gene in shake flask

3 結論與討論

S1是1株經過誘變及篩選所得的枯草芽孢桿菌核黃素高產菌株，但核黃素合成必須的鳥嘌呤合成途徑并未發(fā)生突變。為了使S1菌株核黃素合成能力進一步提升，主要對嘌呤合成途徑的相關基因進行失活以及質粒過表達，結果如下：

(1)嘌呤合成途徑支路基因失活：運用CRISPER/dCas9介導的基因組堿基編輯器技術失活guaC基因(編碼GMP還原酶)，阻斷了GMP到IMP的合成，核黃素產量由2.81提升至3.04 g/L，提升8.2%，轉化率提升10.2%。

(2)嘌呤合成途徑下游基因過表達：通過質粒將GMP下游合成基因gmk(鳥苷酸激酶)和ndk(核苷二磷酸激酶)進行過表達，核黃素產量沒有明顯提升，由此確定了這兩步反應不是核黃素合成的瓶頸。

(3)希瓦氏菌ribA基因引入及過表達：枯草芽孢桿菌中ribA基因編碼的蛋白為一種雙功能酶，希瓦氏菌中ribA(EC 3.5.4.25)和ribB(EC 4.1.99.12)2種酶可以拆分單獨存在，故單獨引入了希瓦氏菌ribA基因(EC 3.5.4.25)，過表達GTP環(huán)水解酶II部分，將GTP更多的轉化為DARPP，增強嘌呤前體的利用。在搖瓶補料發(fā)酵中核黃素產量由3.09提升至3.33 g/L，并且耗糖有所減少，發(fā)酵結束時葡萄糖剩余4.6 g/L，核黃素轉化率較S1提升22.9%

(4)將guaC基因失活與希瓦氏菌ribA基因過表達進行組合，核黃素產量進一步提升至3.43 g/L，較初始菌株S1產量提升21.7%，并且耗糖有少量減少，核黃素轉化率提升25.8%，具有工業(yè)生產價值。