Arg54保守位點對嗜熱玫瑰紅球菌肌氨酸氧化酶的底物適應性和催化效率的影響

肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase，SOX，EC.1.5.3.1)是一種黃素氧化酶，催化肌氨酸的甲基脫除反應從而生成甘氨酸，其輔因子是黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)或黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)[1-2]。近年來，SOX已被廣泛應用于臨床測試中，與肌酸酐酶、肌酸酐酶一起測定人體中肌酐含量[3]。此外，在食品工業(yè)中，基于SOX的生物傳感器和探針已被用于在葡萄酒發(fā)酵中測定有機酸和甘油的含量[4-5]。在之前的報道中，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的SOX(BSOX)基因(GenBank：A Y626822.2)在大腸桿菌中高效表達[6-7]，但由于疏水基團容易暴露，較長的儲存時間往往導致二級結構的破壞和最終聚集，導致該酶的熱穩(wěn)定性較差[8]。為篩選出具有良好耐熱性的菌株，從來源于美國黃石公園堿性溫泉極端嗜熱菌Therommicrobium roseum DSM 5159[9]的全基因組中篩選出一個假設的SOX基因(GenBank：ACM06094.1)，命名為TrSOX。將TrSOX基因插入含有L-鼠李糖誘導的啟動子的pRhamTM質粒中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，但大部分重組酶為包涵體。之后又通過隨機誘變，篩選到穩(wěn)定性低的可溶性突變體(F235V/F339L)[10]。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600是重組表達外源蛋白較為便利的宿主細胞[11-12]，所以為嘗試提高目的蛋白的可溶性，將TrSOX基因插入到pMA5質粒中，然后在該系統(tǒng)中表達，結果表明TrSOX的可溶性表達水平升高并表現(xiàn)出明顯的耐熱性和有機溶劑耐受性[13]。為進一步提高TrSOX在枯草芽孢桿菌WB600中的表達水平，構建了含有木糖誘導啟動子的pMA5-Pxyl質粒并設計了S320R突變體來降低TrSOX[14]的表面疏水性。此外，TrSOX已被證明是一種手性特異性N-甲基脫除酶，能夠識別N-甲基-L-氨基酸類化合物和其他N-甲基非氨基酸化合物[13-14]。在之前的工作中，TrSOX還被證明可以促進N-甲基氮農藥的降解[15]，并且對環(huán)境的毒害較少，這為酶法降解此類農藥開創(chuàng)了先河。

N-甲基脫除反應對科研工作者仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，雖然人們已經研究了許多化學方法[16-17]，但是所有這些化學反應都需要極端的反應條件，反應速度較慢，而且所用試劑大多有一定的毒性。目前，雖然已經報道了幾種能夠在溫和環(huán)境、友好反應條件下通過特定的酶完成N-脫甲基化的反應，然而，這些酶對底物沒有手性選擇性[18-19]。由于TrSOX能夠有效地去除具有手性特異性底物中的N-甲基[20]，因此在化學、醫(yī)藥和食品領域有很大的應用潛力。但是野生型TrSOX對N-甲基-L-氨基酸類的底物適應性仍然有限，有必要擴大底物譜，提高催化活性。

氨基酸序列比對表明TrSOX第54位的Arg是同源家族催化中心限制性保守殘基之一，其蛋白結構中胍基可能和氨基酸類底物的羧酸基形成直接的相互作用，也可能會影響底物的手性選擇性，因此R54位的突變可能在TrSOX的催化活性中起著重要的作用[13-14]。然而，目前還不清楚該位點如何改造會影響催化性能，在某些酶的分子進化研究中發(fā)現(xiàn)，一些嚴格保守位點的突變帶來了有趣的結果[21-22]，因此本研究采用R54定點飽和突變來影響TrSOX對N-甲基底物的催化性質。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

克隆宿主Escherichia coli JM109、DH5α菌種、表達宿主B.subtilis WB600菌種，糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室保存；質粒pMA5(啟動子經過優(yōu)化)，目的基因TrSOX基因(GenBank:ACM06094.1)已經克隆于pMA5質粒上[14]，以下簡稱Pxyl-pMA5-TrSOX質粒，本實驗室完成。

1.1.2 實驗試劑和培養(yǎng)基

氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、溶菌酶、2×Taq PCR Master Mix、辣根過氧化物酶、SDS-PAGE變性凝膠電泳試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；質粒抽提試劑盒，天根生物有限公司；咪唑、4-氨基-安替比林，國藥集團化學試劑有限公司；Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2突變試劑盒，諾唯贊生物科技有限公司；N-甲基底物，麥克林生化科技有限公司；DNA marker、蛋白質分子量標準品、限制性核酸內切酶(Nde I和Mlu I)，TaKaRa 公司(大連)；合成并且基因的測序，金唯智生物科技有限公司。

木糖誘導劑：無菌水配成200 g/L的木糖溶液裝于無菌容器中，在向菌液中加入誘導劑時，于超凈臺中用0.22 μm水系濾膜過濾。

顯色液：1 mmol/L 4-氨基-安替比林、6 mmol/L苯酚、7 000 U/L辣根過氧化物酶，緩沖液為20 mmol/L pH為8的Tris-HCl溶液。

LB(種子液)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5.0、蛋白胨10.0、氯化鈉10.0、LB固體培養(yǎng)基需要另加20.0 g的瓊脂。

TB(發(fā)酵)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨12.0、酵母提取物24.0、甘油4 mL、磷酸二氫鉀2.31、磷酸氫二鉀16.2。培養(yǎng)基使用時根據抗性選擇需要添加終質量濃度為0.1 mg/mL的氨芐青霉素/硫酸卡那霉素。

篩選平板：酵母培養(yǎng)基5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L,瓊脂粉20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入經滅菌0.22 μm針頭式過濾器過濾的200 g/L木糖誘導劑，0.1 mg/mL卡那抗生素，8.8 mmol/L的底物，1 mmol/L 4-氨基-安替比林、6 mmol/L苯酚、7 000 U/L辣根過氧化物酶[10]。

1.1.3 儀器與設備

紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；高溫滅菌鍋，致徽(廈門)儀器有限公司；雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；紫外檢測儀，上海金達生化儀器有限公司；恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；鎳柱，江蘇千純生物有限公司；EDG-81 PCR儀，東勝創(chuàng)新生物技術科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結構模擬

將高產突變菌株TrSOX(S320R)[14]進行蛋白結晶，使用NeXtal系列蛋白質結晶試劑盒(Qiagen, USA)篩選結晶條件，獲得的棒狀晶體于上海同步光源(SSFR)Beamline 17U進行X-射線晶體衍射，衍射收集數(shù)據使用CCP4 Program Suite 6.1.3軟件進行解析，獲得的結構已經上傳 RCSB Protein Data Bank 數(shù)據庫(PDB ID:7EXS)。原始TrSOX結構的構建在Discovery Studio 2019軟件 “Mutate Protein”模塊進行，TrSOX與底物的對接采用該軟件中“CDOCKER”模塊完成。

1.2.2 定點飽和誘變文庫的制備和篩選

根據已報道的方法[23-24]，設計含有簡并堿基(N=A/T/C/G，K=G/T)的引物，引物序列如表1所示。PCR反應在40 μL系統(tǒng)中進行，其中包括8 μL ddH2O，25 μL 2×max Buffer，1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)，1 μL pMA5-Pxyl-trsox質粒，2 μL上游引物，2 μL下游引物。PCR過程：在95 ℃反應30 s，67 ℃反應15 s，72 ℃反應8.5 min，最后72 ℃反應5 min，并進行30個循環(huán)。PCR反應產物用DpnⅠ酶切1～2 h，并對消化后的產物進行37 ℃、30 min的環(huán)化重組反應，環(huán)化重組產物冰水浴5 min后獲得含有目的基因的重組質粒。

表1 定點飽和突變體引物
Table 1 Degenerate primers used for site-saturation mutagenesis

注：下劃線為突變位點

將得到的質粒轉化到B.subtilis WB600感受態(tài)細胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，將得到的單菌落標號，用滅菌的牙簽挑取單菌落再斜插到篩選平板(含有顯色反應體系和N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-亮氨酸等底物)中，過夜培養(yǎng)。若篩選平板中出現(xiàn)粉紅色圈落，挑取對應的菌落接入含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃和200 r/min培養(yǎng)12 h，得到的新鮮菌液進行DNA測序，測序正確的菌液提取質粒并保存。

1.2.3 TrSOX的表達和制備

將驗證正確的突變體菌株質粒轉化到B. subtilis WB600感受態(tài)細胞中，將得到的單菌落進行菌液PCR驗證，引物如表2所示。

表2 菌液PCR引物
Table 2 PCR primers for bacterial liquid

將驗證成功的菌株接種于LB培養(yǎng)基(含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素)中，37 ℃培養(yǎng)12 h得到種子液，以5%的接種量轉接到TB培養(yǎng)基(含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素)中，37 ℃(200 r/min)培養(yǎng)10～11 h,當發(fā)酵液的OD600 nm達到2.0時加入2%的木糖誘導劑，2 h后離心收菌[14]。將收到的菌體與20 mmol/L pH為8的Tris-HCL溶液以1∶20(g∶mL)的比例重懸，并向重懸液里加入0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑和1%的溶菌酶，37 ℃靜置3 h，經過超聲波破碎細胞，高速離心(8 000 r/min，20 min)得到上清液即為粗酶液。粗酶液經過鎳親和層析柱純化，將400 mmol/L洗脫下來的蛋白經過超濾濃縮得到純化濃縮過的肌氨酸氧化酶蛋白。

1.2.4 蛋白濃度的測定

以牛血清白蛋白(bull serum albumin，BSA)為參照物，采用Bradford法測定蛋白質濃度。

1.2.5 酶活性的測定

為測定TrSOX對N-甲基底物的活性，用實時比色法測定OD500 nm的吸光度，以確定H2O2的產生量。以4-氨基安替比林和苯酚為顯色底物，與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)偶聯(lián)，在1 mL反應混合物 (200 mmol/L底物，1 mmol/L 4-氨基安替比林，6 mmol/L苯酚，7U HRP)中加入5 μg酶，在500 nm處測定吸光度，37 ℃反應5 min～3 h，用A500 nm計算反應生成的H2O2含量[25]。用Origin 2021軟件中的Michaelis-Menten方程通過“非線性曲線擬合”計算Km和kcat。

1.2.6 圓二色光譜(circular dichroism，CD)分析

使用CD對不同突變體進行二級結構的預測分析，用無菌水作為空白對照，通過195～250 nm的CD光譜掃描純化的TrSOX，掃描時間2 s，狹縫寬度4.0 nm，比色皿寬度1.0 nm，測定橢圓率(θ)，計算摩爾橢圓率[θ]。

1.2.7 Nano DSC熱穩(wěn)定性的測定

根據Nano-DSC(美國TA儀器)說明書，將300 μL的20 mmol/L pH 8的Tris-HCl緩沖液加入樣品槽中作為對照，再將等體積純化的突變TrSOX(1 mg/mL)注入樣品槽中進行實驗，以2 ℃/min的速度在-10～130 ℃掃描；響應時間為5 s，內置的加壓擾動達6 atm。然后測定樣品的熔化溫度(Tm)和變性焓(ΔH)[14]。

2 結果與分析

2.1 R54位點分析

如圖1-a所示，在TrSOX的三維結構(PDB ID:7EXS)中，Arg 54位于活性位點，其應靠近輔酶FAD。對接后，對接得分最高的被選為模型。在圖1-b和圖1-c中，對于初始底物肌氨酸(N-甲基-甘氨酸)，在R54的胍基和N-甲基-甘氨酸的羧酸基之間形成了氫鍵作用力而產生了直接相互作用；此外，對于另一個初始底物N-甲基-L-色氨酸，R54的胍基和N-甲基-L-色氨酸的羧酸基之間也形成了氫鍵而產生相互作用(圖1-d和圖1-e)。結果表明，催化中心保守的R54殘基可能通過與N-甲基氨基酸底物的酸性側鏈直接相互作用而有助于維持底物與催化中心的結合。

a-R54位于活性口袋的一側(綠色網狀標記)，而輔酶FAD位于活性中心的底部(紫色)；b、c-在N-甲基-甘氨酸與催化口袋的結合中， R54與底物的羧酸基形成氫鍵產生直接相互作用；d、e-在N-甲基-L-色氨酸與催化口袋的結合中，R54與底物的羧酸基形成氫鍵產生 直接的相互作用
圖1 TrSOX(R54)的三維結構和相互作用分析
Fig.1 Three-dimensional structure and interaction analysis of TrSOX(R54)

2.2 突變株的篩選

在含有不同N-甲基氨基酸底物的篩選平板上，由于反應產物H2O2在辣根過氧化物酶的作用下被降解成水和氧氣，而4-氨基安替比林則同酚類物質去氫縮合成紅色的醌類化合物，所以有活性的突變體則出現(xiàn)粉紅色圈落。通過N-甲基-甘氨酸篩選平板篩選到R54 N、R54K、R54D；N-甲基-L-丙氨酸篩選平板篩選出R54M/N/K/P/L/D；而N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-色氨酸和N-甲基-L-亮氨酸每種篩選平板都篩選出R54Y、R54A、R54I、R54Q、R54E、R54F、R54M、R54 N、R54G、R54K、R54P、R54L、R54D、R54V 14個突變體。R54S、R54C、R54H、R54T、R54 W未能夠在平板篩選得到的活性單克隆中獲得，則通過定點突變方式得到突變基因。

2.3 TrSOX的表達和純化

經DNA測序證實的質粒在表達前用Nde Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切，酶切結果顯示載體帶7 008 bp，目的基因條帶1 171 bp，將重組質粒轉化枯草桿菌WB600感受態(tài)細胞后，用菌液PCR方法驗證重組質粒的存在，野生型和突變體顯示存在1 500 bp左右的條帶，并將該菌液用于發(fā)酵。如之前的工作所述，突變體得到了表達和純化，并將純化濃縮后的突變體蛋白進行SDS-PAGE分析，天然TrSOX和突變體均在43 kDa左右顯示單一條帶(圖2)，證明15種突變體均得到了正確的表達；而R54C、R54 W、R54T和R54H四個突變體無法在該表達體系中完成可溶性表達，這與平板篩選的結果是一致的，因為攜帶上述4個突變體基因的質粒無法在宿主細胞中表達出可溶性的帶有活性的酶分子。

a-M-標準蛋白質分子質量，1～8-野生TrSOX，R54E， R54Y，R54A，R54F，R54I，R54V，R54 N；b-TrSOX 突變體蛋白純化產物；1～8-R54，R54G，R54M， R54P，R54D，R54K，R54L和R54Q
圖2 TrSOX突變體純化產物的 SDS-PAGE 電泳分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified product of TrSOX mutants

正確表達的15種突變體在1.5 L的發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定粗酶液的蛋白濃度發(fā)現(xiàn)R54D、R54K、R54Q和R54V的蛋白總量增加，而R54D的蛋白總量增加約2.5倍(表3)。

表3 TrSOX突變體的蛋白表達量
Table 3 The production of TrSOX mutants

注：野生型TrSOX的相對蛋白產量設為1；突變體的相對蛋白產量為其產量與野生型產量的比值

2.4 TrSOX的特性分析

對于Nano-DSC分析，R54突變體的解鏈溫度Tm和變性焓ΔH與野生TrSOX相比沒有明顯的波動(圖3)，這表明野生型TrSOX良好的熱穩(wěn)定性保持不變。

圖3 TrSOX突變體的熱穩(wěn)定性
Fig.3 The thermal stability of TrSOX mutants

用Dichro Web (http://dichroweb.cryst.b bt.ac.uk/html/home.shtml)對獲得的數(shù)據進行分析和處理，得到突變體二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲的含量如表4所示，大多數(shù)突變體的二級結構都受到顯著的影響，這可能是因為R54位點本身對TrSOX整體結構的維持具有較為重要的作用，其突變影響了蛋白結構整體的折疊，而有趣的是，具有相似堿性側鏈的突變體R54K也能降低α-螺旋的含量，這表明R54作為一個限制性的保守殘基，可能在整個酶的結構中起著至關重要的作用。

表4 TrSOX突變體的二級結構
Table 4 The secondary structure of TrSOX mutants

雖然大多數(shù)突變體的二級結構受到影響，但是熱穩(wěn)定性并無太大影響，與理論有出入，這可能是因為二級結構產生變化的區(qū)域并不影響突變體的解鏈溫度，也不會對破壞蛋白整體結構的能量有所改變，從而造成突變體延續(xù)了天然TrSOX優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

2.5 TrSOX突變體的催化性能分析

用Origin 2021軟件中的Michaelis-Menten方程對反應中H2O2的含量進行非線性擬合，得到突變株對不同底物的Km和kcat，并分析TrSOX的酶催化活性。如圖4所示，R54位的各個突變體顯示出與野生型TrSOX相同的手性選擇性，它們能特異性識別N-甲基-L-氨基酸，但不能識別D-型。對于相似的堿性殘基突變體R54K，對N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、N-甲基-L-色氨酸和N-甲基-L-天冬氨酸的催化效率分別提高了3.17、5.99、9.12、7.61、1.00和2.07倍。然而，除了酸性殘基突變體R54D外，其他無堿性側鏈的突變體對相同底物的Km上升，kcat降低，甚至完全失活。這一現(xiàn)象應該與54位殘基的堿性側鏈與底物的羧酸基之間的直接相互作用有關，而K54可能有助于增強相互作用并降低這些底物的接近性。

通過研究分析發(fā)現(xiàn)酸性突變體R54D也能提高對N-甲基-L-氨基酸的催化效率，對N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸和N-甲基-L-色氨酸的催化效率分別提高了1.79、5.57、17.92、9.00和1.43倍。而對N-甲基-L-天冬氨酸活性的顯著降低可能是由于D54的羧酸基與底物之間的排斥所致。此外，與R54D類似的酸性殘基突變體R54E幾乎完全失活，這可能與其二級結構中α-螺旋含量的急劇下降有密切的關系，這進一步說明了R54位點對維持TrSOX的整體結構具有重要的影響(表3)。而R54S雖然獲得了可溶性的蛋白，但對于N-甲基-L-氨基酸類底物完全失活，這也是其無法在篩選平板中獲得的原因。

a-突變體對N-甲基氨基酸的Kcat；b-突變體對N-甲基氨基酸的Km；c-突變體對N-甲基氨基酸的kcat/km； d-突變體對N-甲基氨基酸的相對催化效率(kcat/Km倍數(shù))，將野生型TrSOX的kcat/Km設為1， 相對催化效率為各突變體與野生型TrSOX的比值，其中Novel為野生型不具備的催化活性
圖4 突變體對N-甲基氨基酸的催化特性
Fig.4 Catalytic properties of the mutants against N-methyl-amino acids

對于非氨基酸底物，天然TrSOX對除L-高脯氨酸外的底物，均未有活性。R54I/Q/N/G/K/P/D等突變體，在以吡咯烷[(3S)-(+)-3-(甲氨基)吡咯烷]、哌啶(哌啶和2-甲基哌啶)、甚至結構更大的(己內酰胺)或更復雜的(1，2，3，4-四氫異喹啉和1-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉)生物堿分子為底物時，檢測到了野生型TrSOX不具備的催化活性(圖5)。這表明R54的堿性胍基側鏈可能排斥這些底物，而在上述突變體中，底物可以進入活性口袋并轉化為相關產物。TrSOX突變體蛋白對N-甲基非氨基酸類底物的催化機制是把底物中—C—N—鍵氧化成—CN—鍵，釋放H2O2，水解釋放游離的伯氨基(圖6-b)，而原始的催化機制(如圖6-a)形成更穩(wěn)定的共軛體系，所以可能不會像末端N-甲基那樣通過水解反應釋放出伯氨基。TrSOX突變體蛋白催化N-甲基非氨基酸底物與催化N-甲基氨基酸類底物都伴隨H2O2的產生，證明原始催化機制并沒有改變，但是其具體產物還需進一步的液相色譜-質譜，以及核磁共振進行鑒定。N-甲基非氨基酸底物與N-甲基氨基酸類底物不同點在于其側鏈不含羧酸基，而R54突變體能夠對處于非側鏈位置的羧酸基也能產生相互作用也進一步證明了TrSOX蛋白對底物的特異性。

然而，這些非氨基酸結合的底物的催化效率遠遠低于N-甲基氨基酸的催化效率(圖5-c)，此外，氨基酸的催化機理和產物尚不清楚。在未來工作中，有必要進一步強化對這類底物的催化能力，并對產物進行純化和表征。同時，對氨基酸類底物活性急劇下降的R54Y/A/E/F/M/L/V/S等突變體對上述底物完全未顯示活性，這進一步說明，其二級結構中α-螺旋含量的顯著下降導致了其活性部位的錯誤折疊。R54Y/A/L等突變導致二級結構中α-螺旋含量的降低，可能對活性部位的正確折疊具有較大的影響。但從重組整體表達來看，并沒有產生因為錯誤折疊而導致的包涵體增多現(xiàn)象，由此證明酶分子只是進行錯誤的折疊并未影響其蛋白的可溶性表達。

a-突變體對非氨基酸底物的Kcat；b-突變體對非氨基酸底物的Km；c-突變體對非氨基酸底物的Kcat/km； d-突變體對非氨基酸底物的相對催化效率(Kcat/Km倍數(shù))，將野生型TrSOX的kcat/Km設為1， 相對催化效率為各突變體與野生型TrSOX的比值，其中Novel為天然TrSOX不具備的催化活性
圖5 突變體對非氨基酸類底物的催化特性
Fig.5 Catalytic properties of the mutants against non-amino acid substrates

a-TrSOX對N-甲基-甘氨酸的催化反應過程； b-TrSOX對1，2，3，4-四氫異喹啉的潛在作用機制
圖6 TrSOX的N-甲基脫除反應
Fig.6 N-methyl removal of TrSOX

3 結論與討論

在本次工作中，為研究R54保守位點對TrSOX催化性能的影響，采用定點飽和突變試圖獲得19個突變體。進一步通過活性顯色平板篩選配合定點突變獲得了14個具有活性以及1個完全失活的突變體。R54位的單點突變體保持了天然TrSOX優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。在具有活性的突變體中，R54K和R54D對大多數(shù)N-甲基-氨基酸的催化效率顯著提高而其他二級結構中α-螺旋含量急劇下降的突變體則顯著降低。這表明R54對TrSOX的折疊與整體結構的維持具有重要的意義。此外，54位殘基的堿性或酸性側鏈可以直接與底物的活性側鏈相互作用并引導底物的進入與產物的釋放，從而提高催化效率。

由于天然TrSOX對大多數(shù)非氨基酸相關底物都不起作用，R54上的突變體可以幫助拓寬底物的適應性。一些吡咯烷、哌啶相關的底物甚至更大的含氮雜環(huán)類底物都可以被催化，這些天然TrSOX不具備催化活性的催化效率雖然沒有N-甲基氨基酸類底物高，但是仍有進一步優(yōu)化的潛力。由于R54突變體對N-甲基非氨基酸類底物的反應機理尚不清楚，還需要更多的研究來鑒定產物，而TrSOX突變體對此類底物的催化活性，在食品行業(yè)具有一定的應用價值，能夠用于食品添加劑(如N-甲基-D-天冬氨酸的手性拆分)的制備，生物毒性物質(如含氮雜環(huán)類生物堿)的檢測與降解，以及N-甲基-有機氮農藥的降解等方面。