Arg54保守位點(diǎn)對(duì)嗜熱玫瑰紅球菌肌氨酸氧化酶的底物適應(yīng)性和催化效率的影響

肌氨酸氧化酶(sarcosine oxidase，SOX，EC.1.5.3.1)是一種黃素氧化酶，催化肌氨酸的甲基脫除反應(yīng)從而生成甘氨酸，其輔因子是黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)或黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)[1-2]。近年來，SOX已被廣泛應(yīng)用于臨床測(cè)試中，與肌酸酐酶、肌酸酐酶一起測(cè)定人體中肌酐含量[3]。此外，在食品工業(yè)中，基于SOX的生物傳感器和探針已被用于在葡萄酒發(fā)酵中測(cè)定有機(jī)酸和甘油的含量[4-5]。在之前的報(bào)道中，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的SOX(BSOX)基因(GenBank：A Y626822.2)在大腸桿菌中高效表達(dá)[6-7]，但由于疏水基團(tuán)容易暴露，較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間往往導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞和最終聚集，導(dǎo)致該酶的熱穩(wěn)定性較差[8]。為篩選出具有良好耐熱性的菌株，從來源于美國(guó)黃石公園堿性溫泉極端嗜熱菌Therommicrobium roseum DSM 5159[9]的全基因組中篩選出一個(gè)假設(shè)的SOX基因(GenBank：ACM06094.1)，命名為TrSOX。將TrSOX基因插入含有L-鼠李糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的pRhamTM質(zhì)粒中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，但大部分重組酶為包涵體。之后又通過隨機(jī)誘變，篩選到穩(wěn)定性低的可溶性突變體(F235V/F339L)[10]。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WB600是重組表達(dá)外源蛋白較為便利的宿主細(xì)胞[11-12]，所以為嘗試提高目的蛋白的可溶性，將TrSOX基因插入到pMA5質(zhì)粒中，然后在該系統(tǒng)中表達(dá)，結(jié)果表明TrSOX的可溶性表達(dá)水平升高并表現(xiàn)出明顯的耐熱性和有機(jī)溶劑耐受性[13]。為進(jìn)一步提高TrSOX在枯草芽孢桿菌WB600中的表達(dá)水平，構(gòu)建了含有木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子的pMA5-Pxyl質(zhì)粒并設(shè)計(jì)了S320R突變體來降低TrSOX[14]的表面疏水性。此外，TrSOX已被證明是一種手性特異性N-甲基脫除酶，能夠識(shí)別N-甲基-L-氨基酸類化合物和其他N-甲基非氨基酸化合物[13-14]。在之前的工作中，TrSOX還被證明可以促進(jìn)N-甲基氮農(nóng)藥的降解[15]，并且對(duì)環(huán)境的毒害較少，這為酶法降解此類農(nóng)藥開創(chuàng)了先河。

N-甲基脫除反應(yīng)對(duì)科研工作者仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，雖然人們已經(jīng)研究了許多化學(xué)方法[16-17]，但是所有這些化學(xué)反應(yīng)都需要極端的反應(yīng)條件，反應(yīng)速度較慢，而且所用試劑大多有一定的毒性。目前，雖然已經(jīng)報(bào)道了幾種能夠在溫和環(huán)境、友好反應(yīng)條件下通過特定的酶完成N-脫甲基化的反應(yīng)，然而，這些酶對(duì)底物沒有手性選擇性[18-19]。由于TrSOX能夠有效地去除具有手性特異性底物中的N-甲基[20]，因此在化學(xué)、醫(yī)藥和食品領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。但是野生型TrSOX對(duì)N-甲基-L-氨基酸類的底物適應(yīng)性仍然有限，有必要擴(kuò)大底物譜，提高催化活性。

氨基酸序列比對(duì)表明TrSOX第54位的Arg是同源家族催化中心限制性保守殘基之一，其蛋白結(jié)構(gòu)中胍基可能和氨基酸類底物的羧酸基形成直接的相互作用，也可能會(huì)影響底物的手性選擇性，因此R54位的突變可能在TrSOX的催化活性中起著重要的作用[13-14]。然而，目前還不清楚該位點(diǎn)如何改造會(huì)影響催化性能，在某些酶的分子進(jìn)化研究中發(fā)現(xiàn)，一些嚴(yán)格保守位點(diǎn)的突變帶來了有趣的結(jié)果[21-22]，因此本研究采用R54定點(diǎn)飽和突變來影響TrSOX對(duì)N-甲基底物的催化性質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

克隆宿主Escherichia coli JM109、DH5α菌種、表達(dá)宿主B.subtilis WB600菌種，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMA5(啟動(dòng)子經(jīng)過優(yōu)化)，目的基因TrSOX基因(GenBank:ACM06094.1)已經(jīng)克隆于pMA5質(zhì)粒上[14]，以下簡(jiǎn)稱Pxyl-pMA5-TrSOX質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和培養(yǎng)基

氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、溶菌酶、2×Taq PCR Master Mix、辣根過氧化物酶、SDS-PAGE變性凝膠電泳試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，天根生物有限公司；咪唑、4-氨基-安替比林，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Mut Express ⅡFast Mutagenesis Kit V2突變?cè)噭┖?，諾唯贊生物科技有限公司；N-甲基底物，麥克林生化科技有限公司；DNA marker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品、限制性核酸內(nèi)切酶(Nde I和Mlu I)，TaKaRa 公司(大連)；合成并且基因的測(cè)序，金唯智生物科技有限公司。

木糖誘導(dǎo)劑：無菌水配成200 g/L的木糖溶液裝于無菌容器中，在向菌液中加入誘導(dǎo)劑時(shí)，于超凈臺(tái)中用0.22 μm水系濾膜過濾。

顯色液：1 mmol/L 4-氨基-安替比林、6 mmol/L苯酚、7 000 U/L辣根過氧化物酶，緩沖液為20 mmol/L pH為8的Tris-HCl溶液。

LB(種子液)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5.0、蛋白胨10.0、氯化鈉10.0、LB固體培養(yǎng)基需要另加20.0 g的瓊脂。

TB(發(fā)酵)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨12.0、酵母提取物24.0、甘油4 mL、磷酸二氫鉀2.31、磷酸氫二鉀16.2。培養(yǎng)基使用時(shí)根據(jù)抗性選擇需要添加終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的氨芐青霉素/硫酸卡那霉素。

篩選平板：酵母培養(yǎng)基5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L,瓊脂粉20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，加入經(jīng)滅菌0.22 μm針頭式過濾器過濾的200 g/L木糖誘導(dǎo)劑，0.1 mg/mL卡那抗生素，8.8 mmol/L的底物，1 mmol/L 4-氨基-安替比林、6 mmol/L苯酚、7 000 U/L辣根過氧化物酶[10]。

1.1.3 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；高溫滅菌鍋，致徽(廈門)儀器有限公司；雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；紫外檢測(cè)儀，上海金達(dá)生化儀器有限公司；恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；鎳柱，江蘇千純生物有限公司；EDG-81 PCR儀，東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)構(gòu)模擬

將高產(chǎn)突變菌株TrSOX(S320R)[14]進(jìn)行蛋白結(jié)晶，使用NeXtal系列蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑盒(Qiagen, USA)篩選結(jié)晶條件，獲得的棒狀晶體于上海同步光源(SSFR)Beamline 17U進(jìn)行X-射線晶體衍射，衍射收集數(shù)據(jù)使用CCP4 Program Suite 6.1.3軟件進(jìn)行解析，獲得的結(jié)構(gòu)已經(jīng)上傳 RCSB Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB ID:7EXS)。原始TrSOX結(jié)構(gòu)的構(gòu)建在Discovery Studio 2019軟件 “Mutate Protein”模塊進(jìn)行，TrSOX與底物的對(duì)接采用該軟件中“CDOCKER”模塊完成。

1.2.2 定點(diǎn)飽和誘變文庫(kù)的制備和篩選

根據(jù)已報(bào)道的方法[23-24]，設(shè)計(jì)含有簡(jiǎn)并堿基(N=A/T/C/G，K=G/T)的引物，引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)在40 μL系統(tǒng)中進(jìn)行，其中包括8 μL ddH2O，25 μL 2×max Buffer，1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)，1 μL pMA5-Pxyl-trsox質(zhì)粒，2 μL上游引物，2 μL下游引物。PCR過程：在95 ℃反應(yīng)30 s，67 ℃反應(yīng)15 s，72 ℃反應(yīng)8.5 min，最后72 ℃反應(yīng)5 min，并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用DpnⅠ酶切1～2 h，并對(duì)消化后的產(chǎn)物進(jìn)行37 ℃、30 min的環(huán)化重組反應(yīng)，環(huán)化重組產(chǎn)物冰水浴5 min后獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒。

表1 定點(diǎn)飽和突變體引物
Table 1 Degenerate primers used for site-saturation mutagenesis

注：下劃線為突變位點(diǎn)

將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilis WB600感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板中，將得到的單菌落標(biāo)號(hào)，用滅菌的牙簽挑取單菌落再斜插到篩選平板(含有顯色反應(yīng)體系和N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-亮氨酸等底物)中，過夜培養(yǎng)。若篩選平板中出現(xiàn)粉紅色圈落，挑取對(duì)應(yīng)的菌落接入含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃和200 r/min培養(yǎng)12 h，得到的新鮮菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒并保存。

1.2.3 TrSOX的表達(dá)和制備

將驗(yàn)證正確的突變體菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B. subtilis WB600感受態(tài)細(xì)胞中，將得到的單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，引物如表2所示。

表2 菌液PCR引物
Table 2 PCR primers for bacterial liquid

將驗(yàn)證成功的菌株接種于LB培養(yǎng)基(含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素)中，37 ℃培養(yǎng)12 h得到種子液，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基(含0.1 mg/mL硫酸卡那霉素)中，37 ℃(200 r/min)培養(yǎng)10～11 h,當(dāng)發(fā)酵液的OD600 nm達(dá)到2.0時(shí)加入2%的木糖誘導(dǎo)劑，2 h后離心收菌[14]。將收到的菌體與20 mmol/L pH為8的Tris-HCL溶液以1∶20(g∶mL)的比例重懸，并向重懸液里加入0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑和1%的溶菌酶，37 ℃靜置3 h，經(jīng)過超聲波破碎細(xì)胞，高速離心(8 000 r/min，20 min)得到上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)過鎳親和層析柱純化，將400 mmol/L洗脫下來的蛋白經(jīng)過超濾濃縮得到純化濃縮過的肌氨酸氧化酶蛋白。

1.2.4 蛋白濃度的測(cè)定

以牛血清白蛋白(bull serum albumin，BSA)為參照物，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5 酶活性的測(cè)定

為測(cè)定TrSOX對(duì)N-甲基底物的活性，用實(shí)時(shí)比色法測(cè)定OD500 nm的吸光度，以確定H2O2的產(chǎn)生量。以4-氨基安替比林和苯酚為顯色底物，與辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)偶聯(lián)，在1 mL反應(yīng)混合物 (200 mmol/L底物，1 mmol/L 4-氨基安替比林，6 mmol/L苯酚，7U HRP)中加入5 μg酶，在500 nm處測(cè)定吸光度，37 ℃反應(yīng)5 min～3 h，用A500 nm計(jì)算反應(yīng)生成的H2O2含量[25]。用Origin 2021軟件中的Michaelis-Menten方程通過“非線性曲線擬合”計(jì)算Km和kcat。

1.2.6 圓二色光譜(circular dichroism，CD)分析

使用CD對(duì)不同突變體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析，用無菌水作為空白對(duì)照，通過195～250 nm的CD光譜掃描純化的TrSOX，掃描時(shí)間2 s，狹縫寬度4.0 nm，比色皿寬度1.0 nm，測(cè)定橢圓率(θ)，計(jì)算摩爾橢圓率[θ]。

1.2.7 Nano DSC熱穩(wěn)定性的測(cè)定

根據(jù)Nano-DSC(美國(guó)TA儀器)說明書，將300 μL的20 mmol/L pH 8的Tris-HCl緩沖液加入樣品槽中作為對(duì)照，再將等體積純化的突變TrSOX(1 mg/mL)注入樣品槽中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以2 ℃/min的速度在-10～130 ℃掃描；響應(yīng)時(shí)間為5 s，內(nèi)置的加壓擾動(dòng)達(dá)6 atm。然后測(cè)定樣品的熔化溫度(Tm)和變性焓(ΔH)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 R54位點(diǎn)分析

如圖1-a所示，在TrSOX的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID:7EXS)中，Arg 54位于活性位點(diǎn)，其應(yīng)靠近輔酶FAD。對(duì)接后，對(duì)接得分最高的被選為模型。在圖1-b和圖1-c中，對(duì)于初始底物肌氨酸(N-甲基-甘氨酸)，在R54的胍基和N-甲基-甘氨酸的羧酸基之間形成了氫鍵作用力而產(chǎn)生了直接相互作用；此外，對(duì)于另一個(gè)初始底物N-甲基-L-色氨酸，R54的胍基和N-甲基-L-色氨酸的羧酸基之間也形成了氫鍵而產(chǎn)生相互作用(圖1-d和圖1-e)。結(jié)果表明，催化中心保守的R54殘基可能通過與N-甲基氨基酸底物的酸性側(cè)鏈直接相互作用而有助于維持底物與催化中心的結(jié)合。

a-R54位于活性口袋的一側(cè)(綠色網(wǎng)狀標(biāo)記)，而輔酶FAD位于活性中心的底部(紫色)；b、c-在N-甲基-甘氨酸與催化口袋的結(jié)合中， R54與底物的羧酸基形成氫鍵產(chǎn)生直接相互作用；d、e-在N-甲基-L-色氨酸與催化口袋的結(jié)合中，R54與底物的羧酸基形成氫鍵產(chǎn)生 直接的相互作用
圖1 TrSOX(R54)的三維結(jié)構(gòu)和相互作用分析
Fig.1 Three-dimensional structure and interaction analysis of TrSOX(R54)

2.2 突變株的篩選

在含有不同N-甲基氨基酸底物的篩選平板上，由于反應(yīng)產(chǎn)物H2O2在辣根過氧化物酶的作用下被降解成水和氧氣，而4-氨基安替比林則同酚類物質(zhì)去氫縮合成紅色的醌類化合物，所以有活性的突變體則出現(xiàn)粉紅色圈落。通過N-甲基-甘氨酸篩選平板篩選到R54 N、R54K、R54D；N-甲基-L-丙氨酸篩選平板篩選出R54M/N/K/P/L/D；而N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-色氨酸和N-甲基-L-亮氨酸每種篩選平板都篩選出R54Y、R54A、R54I、R54Q、R54E、R54F、R54M、R54 N、R54G、R54K、R54P、R54L、R54D、R54V 14個(gè)突變體。R54S、R54C、R54H、R54T、R54 W未能夠在平板篩選得到的活性單克隆中獲得，則通過定點(diǎn)突變方式得到突變基因。

2.3 TrSOX的表達(dá)和純化

經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)的質(zhì)粒在表達(dá)前用Nde Ⅰ和Mlu Ⅰ雙酶切，酶切結(jié)果顯示載體帶7 008 bp，目的基因條帶1 171 bp，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞后，用菌液PCR方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒的存在，野生型和突變體顯示存在1 500 bp左右的條帶，并將該菌液用于發(fā)酵。如之前的工作所述，突變體得到了表達(dá)和純化，并將純化濃縮后的突變體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，天然TrSOX和突變體均在43 kDa左右顯示單一條帶(圖2)，證明15種突變體均得到了正確的表達(dá)；而R54C、R54 W、R54T和R54H四個(gè)突變體無法在該表達(dá)體系中完成可溶性表達(dá)，這與平板篩選的結(jié)果是一致的，因?yàn)閿y帶上述4個(gè)突變體基因的質(zhì)粒無法在宿主細(xì)胞中表達(dá)出可溶性的帶有活性的酶分子。

a-M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，1～8-野生TrSOX，R54E， R54Y，R54A，R54F，R54I，R54V，R54 N；b-TrSOX 突變體蛋白純化產(chǎn)物；1～8-R54，R54G，R54M， R54P，R54D，R54K，R54L和R54Q
圖2 TrSOX突變體純化產(chǎn)物的 SDS-PAGE 電泳分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified product of TrSOX mutants

正確表達(dá)的15種突變體在1.5 L的發(fā)酵液中發(fā)酵培養(yǎng)，通過測(cè)定粗酶液的蛋白濃度發(fā)現(xiàn)R54D、R54K、R54Q和R54V的蛋白總量增加，而R54D的蛋白總量增加約2.5倍(表3)。

表3 TrSOX突變體的蛋白表達(dá)量
Table 3 The production of TrSOX mutants

注：野生型TrSOX的相對(duì)蛋白產(chǎn)量設(shè)為1；突變體的相對(duì)蛋白產(chǎn)量為其產(chǎn)量與野生型產(chǎn)量的比值

2.4 TrSOX的特性分析

對(duì)于Nano-DSC分析，R54突變體的解鏈溫度Tm和變性焓ΔH與野生TrSOX相比沒有明顯的波動(dòng)(圖3)，這表明野生型TrSOX良好的熱穩(wěn)定性保持不變。

圖3 TrSOX突變體的熱穩(wěn)定性
Fig.3 The thermal stability of TrSOX mutants

用Dichro Web (http://dichroweb.cryst.b bt.ac.uk/html/home.shtml)對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，得到突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量如表4所示，大多數(shù)突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)都受到顯著的影響，這可能是因?yàn)镽54位點(diǎn)本身對(duì)TrSOX整體結(jié)構(gòu)的維持具有較為重要的作用，其突變影響了蛋白結(jié)構(gòu)整體的折疊，而有趣的是，具有相似堿性側(cè)鏈的突變體R54K也能降低α-螺旋的含量，這表明R54作為一個(gè)限制性的保守殘基，可能在整個(gè)酶的結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。

表4 TrSOX突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)
Table 4 The secondary structure of TrSOX mutants

雖然大多數(shù)突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)受到影響，但是熱穩(wěn)定性并無太大影響，與理論有出入，這可能是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化的區(qū)域并不影響突變體的解鏈溫度，也不會(huì)對(duì)破壞蛋白整體結(jié)構(gòu)的能量有所改變，從而造成突變體延續(xù)了天然TrSOX優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。

2.5 TrSOX突變體的催化性能分析

用Origin 2021軟件中的Michaelis-Menten方程對(duì)反應(yīng)中H2O2的含量進(jìn)行非線性擬合，得到突變株對(duì)不同底物的Km和kcat，并分析TrSOX的酶催化活性。如圖4所示，R54位的各個(gè)突變體顯示出與野生型TrSOX相同的手性選擇性，它們能特異性識(shí)別N-甲基-L-氨基酸，但不能識(shí)別D-型。對(duì)于相似的堿性殘基突變體R54K，對(duì)N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸、N-甲基-L-色氨酸和N-甲基-L-天冬氨酸的催化效率分別提高了3.17、5.99、9.12、7.61、1.00和2.07倍。然而，除了酸性殘基突變體R54D外，其他無堿性側(cè)鏈的突變體對(duì)相同底物的Km上升，kcat降低，甚至完全失活。這一現(xiàn)象應(yīng)該與54位殘基的堿性側(cè)鏈與底物的羧酸基之間的直接相互作用有關(guān)，而K54可能有助于增強(qiáng)相互作用并降低這些底物的接近性。

通過研究分析發(fā)現(xiàn)酸性突變體R54D也能提高對(duì)N-甲基-L-氨基酸的催化效率，對(duì)N-甲基-甘氨酸、N-甲基-L-丙氨酸、N-甲基-L-苯丙氨酸、N-甲基-L-亮氨酸和N-甲基-L-色氨酸的催化效率分別提高了1.79、5.57、17.92、9.00和1.43倍。而對(duì)N-甲基-L-天冬氨酸活性的顯著降低可能是由于D54的羧酸基與底物之間的排斥所致。此外，與R54D類似的酸性殘基突變體R54E幾乎完全失活，這可能與其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的急劇下降有密切的關(guān)系，這進(jìn)一步說明了R54位點(diǎn)對(duì)維持TrSOX的整體結(jié)構(gòu)具有重要的影響(表3)。而R54S雖然獲得了可溶性的蛋白，但對(duì)于N-甲基-L-氨基酸類底物完全失活，這也是其無法在篩選平板中獲得的原因。

a-突變體對(duì)N-甲基氨基酸的Kcat；b-突變體對(duì)N-甲基氨基酸的Km；c-突變體對(duì)N-甲基氨基酸的kcat/km； d-突變體對(duì)N-甲基氨基酸的相對(duì)催化效率(kcat/Km倍數(shù))，將野生型TrSOX的kcat/Km設(shè)為1， 相對(duì)催化效率為各突變體與野生型TrSOX的比值，其中Novel為野生型不具備的催化活性
圖4 突變體對(duì)N-甲基氨基酸的催化特性
Fig.4 Catalytic properties of the mutants against N-methyl-amino acids

對(duì)于非氨基酸底物，天然TrSOX對(duì)除L-高脯氨酸外的底物，均未有活性。R54I/Q/N/G/K/P/D等突變體，在以吡咯烷[(3S)-(+)-3-(甲氨基)吡咯烷]、哌啶(哌啶和2-甲基哌啶)、甚至結(jié)構(gòu)更大的(己內(nèi)酰胺)或更復(fù)雜的(1，2，3，4-四氫異喹啉和1-甲基-1，2，3，4-四氫異喹啉)生物堿分子為底物時(shí)，檢測(cè)到了野生型TrSOX不具備的催化活性(圖5)。這表明R54的堿性胍基側(cè)鏈可能排斥這些底物，而在上述突變體中，底物可以進(jìn)入活性口袋并轉(zhuǎn)化為相關(guān)產(chǎn)物。TrSOX突變體蛋白對(duì)N-甲基非氨基酸類底物的催化機(jī)制是把底物中—C—N—鍵氧化成—CN—鍵，釋放H2O2，水解釋放游離的伯氨基(圖6-b)，而原始的催化機(jī)制(如圖6-a)形成更穩(wěn)定的共軛體系，所以可能不會(huì)像末端N-甲基那樣通過水解反應(yīng)釋放出伯氨基。TrSOX突變體蛋白催化N-甲基非氨基酸底物與催化N-甲基氨基酸類底物都伴隨H2O2的產(chǎn)生，證明原始催化機(jī)制并沒有改變，但是其具體產(chǎn)物還需進(jìn)一步的液相色譜-質(zhì)譜，以及核磁共振進(jìn)行鑒定。N-甲基非氨基酸底物與N-甲基氨基酸類底物不同點(diǎn)在于其側(cè)鏈不含羧酸基，而R54突變體能夠?qū)μ幱诜莻?cè)鏈位置的羧酸基也能產(chǎn)生相互作用也進(jìn)一步證明了TrSOX蛋白對(duì)底物的特異性。

然而，這些非氨基酸結(jié)合的底物的催化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于N-甲基氨基酸的催化效率(圖5-c)，此外，氨基酸的催化機(jī)理和產(chǎn)物尚不清楚。在未來工作中，有必要進(jìn)一步強(qiáng)化對(duì)這類底物的催化能力，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和表征。同時(shí)，對(duì)氨基酸類底物活性急劇下降的R54Y/A/E/F/M/L/V/S等突變體對(duì)上述底物完全未顯示活性，這進(jìn)一步說明，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的顯著下降導(dǎo)致了其活性部位的錯(cuò)誤折疊。R54Y/A/L等突變導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量的降低，可能對(duì)活性部位的正確折疊具有較大的影響。但從重組整體表達(dá)來看，并沒有產(chǎn)生因?yàn)殄e(cuò)誤折疊而導(dǎo)致的包涵體增多現(xiàn)象，由此證明酶分子只是進(jìn)行錯(cuò)誤的折疊并未影響其蛋白的可溶性表達(dá)。

a-突變體對(duì)非氨基酸底物的Kcat；b-突變體對(duì)非氨基酸底物的Km；c-突變體對(duì)非氨基酸底物的Kcat/km； d-突變體對(duì)非氨基酸底物的相對(duì)催化效率(Kcat/Km倍數(shù))，將野生型TrSOX的kcat/Km設(shè)為1， 相對(duì)催化效率為各突變體與野生型TrSOX的比值，其中Novel為天然TrSOX不具備的催化活性
圖5 突變體對(duì)非氨基酸類底物的催化特性
Fig.5 Catalytic properties of the mutants against non-amino acid substrates

a-TrSOX對(duì)N-甲基-甘氨酸的催化反應(yīng)過程； b-TrSOX對(duì)1，2，3，4-四氫異喹啉的潛在作用機(jī)制
圖6 TrSOX的N-甲基脫除反應(yīng)
Fig.6 N-methyl removal of TrSOX

3 結(jié)論與討論

在本次工作中，為研究R54保守位點(diǎn)對(duì)TrSOX催化性能的影響，采用定點(diǎn)飽和突變?cè)噲D獲得19個(gè)突變體。進(jìn)一步通過活性顯色平板篩選配合定點(diǎn)突變獲得了14個(gè)具有活性以及1個(gè)完全失活的突變體。R54位的單點(diǎn)突變體保持了天然TrSOX優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。在具有活性的突變體中，R54K和R54D對(duì)大多數(shù)N-甲基-氨基酸的催化效率顯著提高而其他二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量急劇下降的突變體則顯著降低。這表明R54對(duì)TrSOX的折疊與整體結(jié)構(gòu)的維持具有重要的意義。此外，54位殘基的堿性或酸性側(cè)鏈可以直接與底物的活性側(cè)鏈相互作用并引導(dǎo)底物的進(jìn)入與產(chǎn)物的釋放，從而提高催化效率。

由于天然TrSOX對(duì)大多數(shù)非氨基酸相關(guān)底物都不起作用，R54上的突變體可以幫助拓寬底物的適應(yīng)性。一些吡咯烷、哌啶相關(guān)的底物甚至更大的含氮雜環(huán)類底物都可以被催化，這些天然TrSOX不具備催化活性的催化效率雖然沒有N-甲基氨基酸類底物高，但是仍有進(jìn)一步優(yōu)化的潛力。由于R54突變體對(duì)N-甲基非氨基酸類底物的反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，還需要更多的研究來鑒定產(chǎn)物，而TrSOX突變體對(duì)此類底物的催化活性，在食品行業(yè)具有一定的應(yīng)用價(jià)值，能夠用于食品添加劑(如N-甲基-D-天冬氨酸的手性拆分)的制備，生物毒性物質(zhì)(如含氮雜環(huán)類生物堿)的檢測(cè)與降解，以及N-甲基-有機(jī)氮農(nóng)藥的降解等方面。