高脂肪酶活性菌株的選育及其發(fā)酵制備豆豉中磷脂類物質(zhì)含量的變化

豆豉為我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，具有調(diào)節(jié)血脂、改善心血管功能、降低血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等作用[1-2]。大豆在發(fā)酵過程中經(jīng)多種微生物酶的作用，一些成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，其中報(bào)道較多的如大豆異黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元、大豆蛋白轉(zhuǎn)化為小分子肽或氨基酸[3-4]，而磷脂類成分的變化鮮見報(bào)道。磷脂是組成人體細(xì)胞的主要成分,對(duì)肝病、高血壓、阿爾茲海默癥等疾病的防治有一定的效果[5-7]。大豆磷脂是植物型磷脂的主要來源，是多元醇與脂肪酸及其衍生物酯化而形成的弱極性化合物，根據(jù)堿基不同分為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)等。功能性磷脂的合成常采用脂肪酶作為催化劑實(shí)現(xiàn)富含特殊功能脂肪酸為底物的酰基供體與磷脂的酯交換反應(yīng)[8-9]。本研究首次結(jié)合常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)誘變育種技術(shù)[10-11]選育高脂肪酶活性的優(yōu)良菌株，考察其發(fā)酵制備豆豉過程中PC、PI和PE功能性成分的含量變化，確定富含功能性磷脂的豆豉制備工藝，提高豆豉的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

淡豆豉飲片，北京同仁堂哈爾濱藥店；黑豆，黑龍江和糧農(nóng)業(yè)有限公司。

PC對(duì)照品(純度≥ 99%)，Sigma; PI對(duì)照品(純度50%); PE對(duì)照品(純度≥ 99%),Aladdin。

維多利亞藍(lán)B, Aladdin;中性紅染色劑, Solarbio;馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基、大豆蛋白胨,青島海博生物技術(shù)有限公司;酵母膏, 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;正己烷、異丙醇，均為色譜級(jí)，Simark；冰乙酸(色譜級(jí))，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；三乙胺(色譜級(jí))， 福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)硝基苯酚棕櫚酸，Sigma。其他試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨10、葡萄糖15、酵母膏5、NaCl 2.5。

中性紅油脂平板(g/L)：大豆蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、MgSO4 0.5、瓊脂20、橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL、16 g/L中性紅溶液1 mL，pH 7.0～7.5。

維多利亞藍(lán)油脂平板(g/L)：大豆蛋白胨10、NaCl 2.5、(NH4)2SO4 2、K2HPO4 1、MgSO4 0.5、瓊脂20、維多利亞藍(lán)B 0.04，橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨10 g、NaCl 0.5、(NH4)2SO4 2、K2HPO4 1、MgSO4 0.5、酵母粉5，橄欖油聚乙烯醇乳化液120 mL，pH為7.0～7.5。

1.3 儀器與設(shè)備

LM17R冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾公司；Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，美國(guó)Biolog公司；ARTP-M誘變育種儀，清華無錫天木生物科技有限公司；XSR205DU電子天平、S40型pH計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO公司；BSA2245電子天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；DL-CJ-2N潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HNY-202B搖床培養(yǎng)箱，江蘇中和實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；LDZM-60KC高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LC-2030C3D高效液相色譜儀、ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光檢測(cè)器，日本島津制作所；CX31光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；UV-5200紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高脂肪酶活性菌株的選育

1.4.1.1 出發(fā)菌株篩選

初篩采用中性紅油脂平板與維多利亞藍(lán)平板相結(jié)合的方法[12]。將淡豆豉飲片粉碎，過二號(hào)篩，精密稱取1 g溶于10 mL滅菌的蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，靜置，吸取上層溶液1 mL置入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d，梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，分別吸取100 μL涂布于中性紅油脂平板，于30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取紅色變色圈或透明圈的菌落再轉(zhuǎn)接到維多利亞藍(lán)平板培養(yǎng)基中，于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d，挑選有深藍(lán)色水解圈或透明圈的菌落，作為初篩目的菌株。

將初篩目的菌株轉(zhuǎn)接入馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4 d(107～108孢子數(shù)/mL)，按照1%的接種量接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4 d，采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定上清液脂肪酶活力，確定復(fù)篩目的菌株。

1.4.1.2 脂肪酶活力測(cè)定

采用對(duì)-硝基苯酚法，37 ℃、pH 8.0時(shí)，1 μmol/min釋放對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活力單位[13]，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A，樣品酶活力，U/L；A1；樣品酶液的吸光度值；A0，滅活酶液的吸光度值；k，對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；k0，對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；n，酶液稀釋倍數(shù)；V1，酶液體積，mL；t，反應(yīng)時(shí)間，min。

底物溶液A：稱取90 mg對(duì)硝基苯酚棕櫚酸，溶于30 mL異丙醇。

底物溶液B：50 mmol/L Tris-HCl，含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)TritonX-100和0.1%阿拉伯樹膠(pH 8.0)。

測(cè)定方法:將空白對(duì)照和樣品試管作好標(biāo)記，每支試管中分別加入0.1 mL底物溶液A和1.8 mL底物溶液B，于37 ℃水浴保溫5 min，然后在空白對(duì)照管中分別加入0.1 mL酶液和0.1 mL滅活酶液，搖勻，在37 ℃水浴反應(yīng)10 min后立即加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.5 mL 100 g/L Na2CO3溶液顯色，于410 nm測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.1.3 ARTP誘變育種

菌懸液的制備：將復(fù)篩目的菌株作為出發(fā)菌株，用無菌生理鹽水將斜面菌絲蕩洗并稀釋成濃度為107～108孢子數(shù)/mL的菌懸液，備用。

ARTP誘變：吸取10 μL菌懸液于載片中央并涂勻，照射距離2 mm，氣流量10 SLM，功率120 W下進(jìn)行誘變處理20、30、40、50、60 s，然后用無菌生理鹽水沖洗載片，涂于PDA平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，3個(gè)平行樣本，按公式(2)計(jì)算致死率并繪出致死率曲線。

致死率

(2)

式中：n，經(jīng)ARTP處理后平板上平均菌落數(shù)；n0，未經(jīng)ARTP處理平板上菌落數(shù)。

脂肪酶活性測(cè)定：將誘變后的菌株按照1.4.1.2方法測(cè)定脂肪酶活性，并與出發(fā)菌株酶活性相比，確定高產(chǎn)脂肪酶活性的突變株，采用PDA試管斜面于4 ℃保存菌株。

1.4.1.4 菌株的鑒定

采用Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行鑒定。根據(jù) Biolog FF MicroPlateTM使用說明書，在吐溫-40接種液中輕微研磨制成均勻菌懸液，用濁度計(jì)比濁成75% T(T為接種濁度)，將菌懸液加于FF鑒定板檢測(cè)孔中，100 μL/孔，于33 ℃ 孵育24～96 h，每24 h讀取結(jié)果。

1.4.2 豆豉發(fā)酵工藝研究

1.4.2.1 樣品的制備

將黑豆用清水洗凈、浸泡16～18 h，瀝干水分，裝入滅菌袋，每袋200 g，于121 ℃滅菌30 min，放涼，按照1%的接種量分別接入出發(fā)菌株GD12菌液(1.6×105孢子/mL)和誘變菌株GD12-11菌液(5×105孢子/mL)，搖勻，于30 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、3、5、7、9、13、15 d取樣。

1.4.2.2 豆豉中PC、PI、PE的含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定不同樣品PC、PI、PE的含量[14]。

色譜條件：Shim-park GIS二醇柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相A: V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(冰醋酸)∶V(三乙胺)=814∶170∶15∶0.8;流動(dòng)相B：V(異丙醇)∶V(超純水)∶V(冰醋酸)∶V(三乙胺)=844∶140∶15∶0.8; 流速0.8 mL/min;柱溫38 ℃;進(jìn)樣量10 μL;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器溫度38 ℃；空氣壓力350 kPa。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取PC對(duì)照品2.69 mg、PI對(duì)照品7.86 mg、PE對(duì)照品8.13 mg，加入V(正己烷)∶V(異丙醇)=80∶20溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

供試品溶液的制備：精密稱取2.0 g豆豉及市售淡豆豉樣品細(xì)粉，加入硅膠柱，先用30 mL V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶1的溶液洗脫，棄去洗脫液，再用30 mL V(甲醇)∶V(氯仿)=1∶2的溶液洗脫，收集洗脫液，于100 ℃水浴蒸干，用V(正己烷)∶V(異丙醇)=80∶20復(fù)溶至5 mL容量瓶，備用。

方法學(xué)考察：

(1)線性關(guān)系考察。將不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3種磷脂的線性回歸方程。PC的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=954 814X-8 499.7，R2=0.983(0～0.308 mg/mL)；PI的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=3×10-7X+0.026 1，R2=0.999 7(0～6.05 mg/mL)；PE的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 5×10-7X-5×10-5，R2=0.999 1(0～1.40 mg/mL)，在此范圍內(nèi)線性良好。

(2)精密度試驗(yàn)。取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示PC、PI和PE峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)分別為1.42%、1.20%和1.13%，表明該方法精密度良好。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批次GD12-11發(fā)酵9 d的樣品，平行制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，PC、PI和PE峰面積的RSD分別為1.75%、1.34%和1.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批次GD12-11發(fā)酵9 d的樣品，平行制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，PC、PI和PE峰面積的RSD分別為1.42%、1.21%和1.13%，表明室溫下，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

(5)加樣回收率試驗(yàn)。取同一批次GD12-11發(fā)酵9 d樣品6份，每份精密稱取2.0 g，分別精密加入3種對(duì)照品溶液各1 mL，相當(dāng)于PC 0.269 mg、PI 0.786 mg和PE 0.813 mg，平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，PC、PI、PE加樣回收率分別見表1～表3，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

樣品中3種磷脂類成分的含量測(cè)定：按供試品溶液的制備方法平行制備各供試品溶液，于相同色譜條件測(cè)定并記錄峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3種磷脂類成分的含量。

表1 PC加樣回收率
Table 1 Recovery rate of phosphatidylcholine

表2 PI加樣回收率
Table 2 Recovery rate of phosphatidylinositol

表3 PE加樣回收率
Table 3 Recovery rate of phosphatidylethanolamine

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株的篩選及鑒定結(jié)果

從淡豆豉飲片中分離篩選出產(chǎn)脂肪酶的菌株5株(表4)，其中GD12酶活力最高，為(4 403±108)U/L，作為出發(fā)菌株，采用ARTP技術(shù)進(jìn)一步誘變以獲得高脂肪酶活性的菌株。出發(fā)菌株GD12脂肪酶活性初篩平板如圖1，經(jīng)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為傘枝梨頭霉(Absidia corymbifera)。

表4 產(chǎn)脂肪酶菌株的酶活性 單位：U/L

Table 4 Enzyme activities of lipase-producing strains

a-中性紅;b-維多利亞藍(lán)
圖1 GD12脂肪酶活性初篩平板
Fig.1 Preliminary screening plates of lipase activity produced by GD12

2.2 ARTP誘變育種結(jié)果

2.2.1 誘變時(shí)間的確定

圖2為GD12誘變時(shí)間-致死率曲線，誘變20 s后該菌的致死率迅速升高，誘變50 s時(shí)致死率達(dá)到最高為(90±3)%。通常情況下，當(dāng)致死率>90%，菌株發(fā)生突變的概率較高且不易回突，因此，最終采用ARTP誘變處理時(shí)間為50 s。

圖2 GD12 ARTP致死率曲線
Fig.2 Fatality rate curve of GD12 with the ARTP treatment

2.2.2 高產(chǎn)脂肪酶菌株的選育結(jié)果

出發(fā)菌株經(jīng)50 s誘變處理后，將菌液涂于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到12株突變株，將出發(fā)菌株和各突變株通過脂肪酶活性的初篩和復(fù)篩，獲得4株脂肪酶活性高于出發(fā)菌株的突變株，其中GD12-11的活性最高，脂肪酶活性為(5 547±305)U/L，比出發(fā)菌株GD12酶活性提高了25.98%。

2.2.3 豆豉發(fā)酵過程中PC、PI和PE的含量變化

2.2.3.1 對(duì)照品和樣品的HPLC圖

如圖3所示。相同色譜條件下，PC、PI(純度50%)和PE對(duì)照品的保留時(shí)間分別為8.7、13.0、7.5 min, 樣品在與對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)處顯示相同的色譜峰，且分離度較好。

圖3 PC、PI、PE對(duì)照品及樣品的HPLC圖
Fig.3 HPLC diagrams of PC， PI， PE reference substances and the sample

2.2.3.2 豆豉發(fā)酵過程中PC、PI和PE的含量變化

圖4為GD12和GD12-11發(fā)酵制備豆豉不同時(shí)間PC、PI和PE的含量變化曲線。黑豆未發(fā)酵前(0 h)PC、PI和PE的含量?jī)H為(0.049±0.012)、(0.094±0.011)、(0.031±0.002)mg/g，PC于發(fā)酵7 d含量達(dá)到最高，突變菌株發(fā)酵的豆豉PC含量略高于出發(fā)菌株，但差異不明顯，7 d分別達(dá)到(0.341±0.018)和(0.354±0.012)mg/g，隨后含量逐漸下降，發(fā)酵15 d時(shí)，含量降至接近發(fā)酵前(圖4-a)；PI也于發(fā)酵7 d達(dá)到峰值，但出發(fā)菌株制備的豆豉PI含量高于突變株，含量分別為(3.217±0.011)和(2.395±0.015)mg/g，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其含量逐漸下降，于發(fā)酵15 d降至接近發(fā)酵前(圖4-b)；PE在第7天出發(fā)菌株發(fā)酵樣品含量達(dá)到最高為(1.332±0.008)mg/g，突變菌株發(fā)酵樣品于第9天達(dá)到峰值為(1.399±0.011) mg/g，高于出發(fā)株(圖4-c)。對(duì)比發(fā)酵7 d和9 d豆豉中3種磷脂的總含量，7 d為(3.993±0.034)mg/g，9 d為(3.969±0.021)mg/g，確定7 d為豆豉的最佳發(fā)酵時(shí)間。

a-PC;b-PI;c-PE
圖4 豆豉發(fā)酵過程中磷脂類成分含量的變化
Fig.4 Content change of phosphlipid in Douchi during fermentation

2.3 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對(duì)比

如圖5所示，GD12和GD12-11發(fā)酵7 d制備的豆豉(新型豆豉)PC含量分別為(0.341±0.016)和(0.354 ±0.012)mg/g，約為市售淡豆豉(0.065±0.008)mg/g的5倍；PI含量分別為(3.217±0.032)和(2.395±0.015)mg/g，約為市售淡豆豉(0.288±0.011)mg/g的為8～11倍；PE含量分別為(1.332±0.021)和(1.244±0.021)mg/g，約為市售淡豆豉(0.042±0.006)mg/g的30倍。新型豆豉3種磷脂類成分的含量均明顯高于市售淡豆豉飲片。

圖5 新型豆豉與市售淡豆豉3種磷脂類成分的含量對(duì)比
Fig.5 Contents of three phospholipids between new-type Douchi and Semen Sojae Praeparatumon

3 結(jié)論與討論

課題組前期從6個(gè)產(chǎn)地淡豆豉中分離出14個(gè)野生型菌株，包括3株細(xì)菌和11株霉菌，其中傘枝犁頭霉為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌[15]。又以傘枝犁頭霉為發(fā)酵菌株，考察了淡豆豉和豆豉純種發(fā)酵過程中17種游離氨基酸的含量變化，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，精氨酸和絲氨酸的含量下降，脯氨酸、組氨酸、谷氨酸和甘氨酸的含量升高，其余氨基酸未發(fā)生明顯變化[16]。本研究從淡豆豉中篩選出較高脂肪酶活性的菌株經(jīng)鑒定也是傘枝犁頭霉，可用于制備富含功能性磷脂型豆豉，傘枝梨頭霉在釀造大曲[17]和豆糝[18]中均有發(fā)現(xiàn)，該菌具有很強(qiáng)的耐熱、生長(zhǎng)能力，能高產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶[19]。本研究從淡豆豉飲片中篩選高脂肪酶活性野生菌株并采用ARTP技術(shù)誘變處理，使出發(fā)菌株的脂肪酶活性提高了25.98%。出發(fā)菌和突變菌發(fā)酵制備的豆豉中3種磷脂類成分含量均明顯高于市售淡豆豉，但出發(fā)菌和突變菌之間差異不顯著，可進(jìn)一步采用復(fù)合誘變方法以顯著提高菌株的脂肪酶活性，以期更大幅度地提高磷脂類成分的含量。不同磷脂由于其組成的基團(tuán)不同而具有不同的性質(zhì)和功能，本研究制備的豆豉中PI和PE的含量明顯高于PC的含量，表明該豆鼓可能具有更好的降血脂作用。有研究證明，豆豉中富含功能性磷脂，并含有大豆異黃酮、活性肽等成分，有利于保護(hù)豆豉中功能性磷脂的穩(wěn)定性[20-21]。

通過優(yōu)選的菌株制備豆豉，3種磷脂的含量呈先升高再下降的趨勢(shì)，可能是由于磷脂在脂肪酶或磷脂酶的作用下進(jìn)一步水解為甘油磷脂酰膽堿，后續(xù)可進(jìn)一步考察其穩(wěn)定性。另外，采用優(yōu)選菌株制備的豆豉中3種磷脂類成分的含量明顯高于市售淡豆豉，可能是由于淡豆豉發(fā)酵時(shí)間過短或過長(zhǎng)而導(dǎo)致磷脂類成分含量較低，或市售淡豆豉發(fā)酵菌種復(fù)雜多樣，產(chǎn)生的脂肪酶活性較低而不能保證催化反應(yīng)充分進(jìn)行，因此，可采用高脂肪酶活性菌種純種發(fā)酵制備富含功能性磷脂的豆豉。本研究?jī)H考察了高脂肪酶活性菌株發(fā)酵制備豆豉中3種磷脂類成分的含量變化，而功能性磷脂通常連接多不飽和脂肪酸，后續(xù)還將通過GC分析豆豉發(fā)酵過程中多不飽和脂肪酸含量的變化，為新型豆豉的藥理活性及作用機(jī)制研究提供參考。