基于聚合物刷微圖案的生物素化梯度表面制備研究

三(2-苯基吡啶)合銥(Ir(ppy)₃)：純度>98%，武漢卓鑫科技公司；(11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基)十二烷基三氯硅烷：純度>95%，GELESF公司；低聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA，純度>99%，分子量500)、DBCO標(biāo)記的生物素(DBCO-PEG4-Biotin，純度>95%)、疊氮化鈉(NaN₃，純度>99.5%)：西格瑪奧德里奇有限公司；二甲基甲酰胺(DMF，純度≥99.9%)、2-溴異丁酰溴(BiBB，純度≥98%)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺、甲苯、硫酸（H₂SO₄，濃度98%）、碳酸氫鈉(NaHCO₃，純度≥99%)、無水硫酸鎂(MgSO₄，純度≥98%)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；去離子水、無水乙醇、丙酮、雙氧水(H₂O₂)、四氫呋喃(THF，純度≥99.8%)、二氯甲烷(CH₂Cl₂，純度≥99.6%)、4?分子篩(球形，直徑2~3 mm)：上海泰坦科技股份有限公司；牛血清蛋白(BSA)：上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；546納米鏈親和素?zé)晒鈭F(streptavidin-Alexa Fluor 546)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)：pH=7.4，上海麥克林生化科技有限公司；硅片：100 nm氧化層，尺寸1.0 cm×0.6 cm，蘇州晶硅科技有限責(zé)任公司. 所有的溶劑在使用前經(jīng)過4?分子篩除水.

用于光束圖案化的DMD投影系統(tǒng)由激光光源(455 nm，3 W)、擴束鏡、均光鏡、空間光調(diào)制器DMD (分辨率為1920×1080，微鏡尺寸為7.6 μm × 7.6 μm)及DMD控制器、投影鏡頭、分光鏡、CCD相機、計算機以及載物臺組成，如圖1所示. DMD芯片表面包含成千上萬緊密排列的可以沿+12°或-12°方向偏轉(zhuǎn)的微小正方形反射鏡片(又稱微鏡). 光源發(fā)出的光束經(jīng)擴束鏡、均光鏡整形后照射到DMD芯片表面，借助計算機將數(shù)字灰度圖像以位圖文件格式(BMP)加載到DMD控制器，DMD控制器根據(jù)位圖文件信息產(chǎn)生脈沖信號控制DMD表面不同區(qū)域微鏡的偏轉(zhuǎn)方向進而控制光反射，入射光經(jīng)DMD調(diào)制后形成與數(shù)字灰度圖像相對應(yīng)的光束圖像，并經(jīng)投影鏡頭投影于基體材料表面. 在投影鏡頭與基體材料之間設(shè)置一分光系統(tǒng)，使得從基體表面反射回來的圖案化光束經(jīng)分光鏡再次反射后進入CCD相機，最后被CCD相機捕獲并傳輸?shù)接嬎銠C. 通過觀察圖像清晰度可以實現(xiàn)系統(tǒng)的準(zhǔn)確對焦并對聚合反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測.

  

Fig. 1  Schematic of DMD-based patterning projection system.

在氮氣氛圍下，將BiBB (13.6 mL，0.11 mol)逐滴加入三乙胺(20.77 mL，0.149 mol)、THF(150 mL)和OEGMA (45.5 mL，0.1 mol)混合溶液中. 將所得溶液置于冰水浴中反應(yīng)1 h至白色沉淀生成，之后在25 ℃水浴中反應(yīng)48 h. 反應(yīng)結(jié)束后，采用體積比1:1的飽和NaHCO₃水溶液清洗所得混合溶液，并用體積比1:1的CH₂Cl₂/THF溶液萃取分離3次. 所得有機層溶液用無水MgSO₄干燥2 h，之后在35 ℃下減壓蒸餾去除DMF及CH₂Cl₂，所得棕黃色黏稠液體為末端含溴基團的單體2-(2-溴-2-甲基丙氧基)甲基丙烯酸乙酯(BIBEMA). 然后將所得BIBEMA單體、NaN₃ (0.0025 mmol)和DMF (10 mL)溶液加入長頸瓶并用磁力攪拌器混合均勻. 在氮氣氛圍下將所得混合溶液置于45 ^oC的油浴中反應(yīng)24 h. 反應(yīng)結(jié)束后，采用體積比1:1的飽和NaHCO₃水溶液清洗所得混合溶液，并用體積比1:1的CH₂Cl₂/THF溶液萃取分離3次. 所得有機層溶液用無水MgSO₄干燥2 h，之后在35 ℃下減壓蒸餾去除DMF及CH₂Cl₂，所得棕黃色黏稠液體即疊氮功能化單體2-(2-疊氮-2-甲基丙氧基)甲基丙烯酸乙酯(AMEMA). 采用核磁共振儀(Bruker DPX 400 MHz)對AMEMA單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行表征，得到不同結(jié)構(gòu)H原子和C原子對應(yīng)的化學(xué)位移如下：¹H-NMR (DMF-d₇, TMS, δ): 6.10~5.71 (s, m, 2H, CH₂＝C(CH₃)CO―), 4.39~4.23 (m, 4H, (―COOCH₂CH₂)₂), 3.83~3.59 (s, 34H, ―?(CH₂O-CH₂)₉―), 1.94 (s, 2H, CH₂＝C(CH₃)CO―), 1.49 (s, 5H, ―COC(CH₃)₂N₃); ¹³C-NMR (DMF-d₇, TMS, δ): 172.51 (―C＝OC(CH₃)₂N₃), 166.78 (CH₂＝C―(CH₃)C＝O―), 136.43 (CH₂＝C(CH₃)―), 125.36 (CH₂＝C(CH₃)―), 70.42 (―(OCH₂CH₂)_n―), 68.76 (d, J=131.4 Hz, ―OCH₂CH₂―), 64.99~63.39 (―OCH₂CH₂OCO―), 56.60 (―C(CH₃)₂N₃), 24.67 (―C(CH₃)₂N₃), 17.73 (CH₂＝C(CH₃)―).

首先將硅片浸入丙酮溶液中超聲清洗5 min，之后用無水乙醇、去離子水、無水乙醇依次清洗硅片并在氮氣流下干燥. 然后將清洗好的硅片置于“食人魚溶液”(即30% H₂O₂和70% H₂SO₄的混合溶液，該溶液具有強腐蝕性且在過量有機物存在下會有爆炸危險，操作需注意規(guī)范及安全)中并在90 ℃的油浴下加熱處理3 h. 最后用防腐蝕鑷子取出硅片，用大量去離子水、無水乙醇沖洗其表面后在氮氣流下干燥即得到表面羥基化的硅片. 配制0.08 mol/L包含(11-(2-溴-2-甲基)丙酰氧基)十二烷基三氯硅烷(引發(fā)劑)、甲苯、三乙胺的反應(yīng)溶液，將表面羥基化的硅片置于溶液中(確?；w材料完全浸入溶液中)避光反應(yīng)12 h (氮氣氛圍)，反應(yīng)結(jié)束后采用丙酮、無水乙醇、去離子水清洗硅片并在氮氣流下干燥，得到接枝引發(fā)劑的硅片.

首先在Schlenk瓶中配置催化劑濃度和單體濃度分別為0.92 mmol/L和1.16 mol/L的AMEMA/Ir(ppy)₃/DMF反應(yīng)溶液，經(jīng)過3次冷凍循環(huán)脫氣后取40 μL所得溶液滴加在接枝引發(fā)劑的硅片表面并覆蓋厚度125 μm的蓋玻片形成均勻液膜，然后將硅片置于DMD圖案化投影系統(tǒng)載物臺上，調(diào)整載物臺高度確保硅片表面處于投影系統(tǒng)的焦點處. 根據(jù)需要繪制數(shù)字灰度圖像并將其以位圖文件格式加載到DMD控制器，DMD微鏡在DMD控制器作用下朝不同方向偏轉(zhuǎn)以對入射光進行調(diào)制，調(diào)制后的光束經(jīng)投影鏡頭投影于均勻覆蓋反應(yīng)溶液的硅片表面形成由明場和暗場構(gòu)成曝光圖像以選擇性引發(fā)聚合反應(yīng). 圖2為DMD光調(diào)控引發(fā)表面ATRP反應(yīng)在硅片表面制備PAMEMA聚合物刷微圖案的示意圖. 反應(yīng)10 min后，依次用無水乙醇、去離子水清洗硅片表面并在氮氣流下吹干，得到聚合物刷圖案化的硅片，所得材料儲存于干燥皿中用于表征測試.

  

Fig. 2  Schematic of the fabrication of micropatterned PAMEMA brushes via DMD-modulated Photo-ATRP reaction.

首先將接枝了PAMEMA聚合物刷微圖案的硅片浸入PBS緩沖液中振蕩清洗2次(每次10 min)，然后將其轉(zhuǎn)移至10 μmol/L的DBCO-PEG4-Biotin/PBS溶液中進行生物素化，室溫振蕩反應(yīng)6 h后，用無水乙醇、去離子水循環(huán)清洗硅片并在氮氣流下干燥；之后將生物素化的硅片浸入5%的BSA/PBS溶液中振蕩1 h，以阻斷非特性蛋白吸附；之后將硅片轉(zhuǎn)移至0.01 mg/mL的streptavidin-Alexa Fluor 546/PBS溶液中，室溫振蕩反應(yīng)2 h；最后采用PBS溶液清洗硅片2次(每次20 min)后儲存于PBS溶液中以備激光共聚焦顯微鏡測試. 所有反應(yīng)在避光條件下進行.

采用舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司RX50M光學(xué)顯微鏡對PAMEMA聚合物刷圖案化表面進行觀察并拍攝圖像，放大倍數(shù)為5倍. 采用美國ZYGO公司NewView 8000型光學(xué)表面輪廓儀對PAMEMA聚合物刷微圖案的三維結(jié)構(gòu)進行表征，測試方法為3D相干掃描干涉法. 采用系科光電科技有限公司RISE Zenith V型橢圓偏光儀對聚合物刷的厚度進行表征，使用He-Ne激光探頭(λ =632.8 nm)，在入射角70°、75°和80°下測試. 采用美國PHI公司PHI5000 X射線光電子能譜儀(XPS)對PAMEMA聚合物刷的化學(xué)組成進行表征，使用鋁/鎂靶，在高壓14.0 kV，功率250 W，真空度大于1.333×10³ Pa條件下測試；通過RBD147數(shù)據(jù)采集卡和Auger Scan3.21軟件獲取數(shù)據(jù)，采用Casa XPS軟件對所得數(shù)據(jù)進行定量分析. 采用尼康公司Nikon A1R激光共聚焦顯微鏡(Ti顯微鏡頭)對PAMEMA聚合物刷圖案化硅片表面的熒光圖案進行觀察并拍攝，放大倍數(shù)為20倍，采用NIS-Elements Viewer軟件進行圖像處理. 采用IONTOF公司飛行時間二次離子質(zhì)譜儀(ToF-SIMS)對PAMEMA聚合物刷圖案化表面的化學(xué)組成分布進行測試，主要離子束為循環(huán)時間為100 μs、脈沖寬度為100 ns的35 keV Bi³⁺離子束；掃描面積為500 μm × 500 μm，像素尺寸為512×512.

圖3(a)為DMD光調(diào)控引發(fā)表面ATRP制備聚合物刷微圖案時CCD相機獲取的圖案化光束激發(fā)基體材料表面反應(yīng)溶液產(chǎn)生的熒光圖像. 圖3(b)為PAMEMA聚合物刷圖案化硅片表面的光學(xué)顯微鏡圖像，圖中可以觀察到明顯的具有亮度反差的方形圖案，表明PAMEMA聚合物刷在硅片表面選擇性生長. 圖3(c)為所制得的聚合物刷微圖案的3D形貌圖像，結(jié)合橢圓偏光儀測得的聚合物刷膜厚和微圖案3D形貌得到圖案化聚合物刷的厚度輪廓曲線(電子支持信息圖S1)，結(jié)果表明制備得到的圖案化PAMEMA刷的厚度約為27 nm，在光學(xué)顯微鏡圖像(圖3(b))中較暗區(qū)域為接枝引發(fā)劑表面，較亮區(qū)域為接枝PAMEMA聚合物刷表面. 比較熒光圖像、光學(xué)顯微鏡圖像和3D形貌圖像可知，PAMEMA聚合物刷生長區(qū)域?qū)?yīng)熒光圖像的明場區(qū)域，引發(fā)劑區(qū)域?qū)?yīng)熒光圖像的暗場區(qū)域，這是因為在明場區(qū)域，光輻照Ir(ppy)₃引發(fā)表面ATRP反應(yīng)生成PAMEMA聚合物刷，而在暗場區(qū)域，沒有光輻照的條件下Ir(ppy)₃無法引發(fā)表面ATRP反應(yīng). 圖3(d)~3(f)為制備得到的各種形狀PAMEMA聚合物刷微圖案的光學(xué)顯微鏡圖像，邊界清晰且完整的復(fù)雜圖案表明DMD光調(diào)控引發(fā)表面ATRP技術(shù)不僅適用于形狀簡單微圖案的制備，在制備形狀相對復(fù)雜的聚合物刷微圖案時依然能夠取得較好的效果.

  

Fig. 3  (a) Exposure image projected onto the substrate surface covered with monomer/catalyst solution; (b) Optical image from the silicone substrate with PAMEMA brush micropatterns; (c) 3D topography image of the obtained PAMEMA brush micropatterns; (d-f) Optical images of PAMEMA brush micropatterns with various complicated shapes.

圖4(a)為接枝PAMEMA聚合物刷硅片表面的XPS高分辨率C1s元素分譜圖. 由圖可知，在288.6、286.3和284.8 eV譜峰處對應(yīng)的O―C＝O、C―O/C―N和C―C/C―H結(jié)構(gòu)^[24]的譜峰強度比例分別為8.6%、70.1%、21.3%，與AMEMA單體中對應(yīng)基團的比例基本一致. 進一步采用TOF-SIMS對PAMEMA聚合物刷圖案化表面化學(xué)組成分布情況進行表征. 圖4(b)和4(c)分別為PAMEMA刷圖案化表面Si^-和N₃^-離子片段的高分辨率TOF-SIMS掃描圖像，圖中觀察到明顯的具有信號強度反差的2個區(qū)域. 參照PAMEMA聚合物刷微圖案的光學(xué)顯微鏡圖像(圖3(b))可知，在引發(fā)劑區(qū)域檢測到大量對應(yīng)于硅基體表面二氧化硅氧化層的Si^-離子片段，而PAMEMA聚合物刷微圖案區(qū)域則檢測到明顯的對應(yīng)PAMEMA刷末端疊氮結(jié)構(gòu)的N₃^-離子片段. 以上結(jié)果表明通過在基體材料表面制備PAMEMA聚合物刷微圖案可以實現(xiàn)具有疊氮基團反差特性的圖案化表面的成功制備.

  

Fig. 4  (a) XPS high resolution C1s spectra of PAMEMA brushes grafted silicon substrate; (b, c) TOF-SIMS mapping images of Si^- fragments and N₃^- fragments from PAMEMA brushes patterned silicon substrate.

疊氮基團與DBCO之間的高特異性點擊反應(yīng)賦予PAMEMA聚合物刷微圖案作為功能化模板以固定各種材料(如生物分子、納米粒子等)的能力^[25,26]. 本文借助DBCO修飾的生物素對各種形狀PAMEMA聚合物刷微圖案表面功能化特性進行研究. 如圖5(a)所示，以疊氮基團為反應(yīng)位點，通過點擊反應(yīng)將DBCO修飾的生物素分子錨固到PAMEMA聚合物刷微圖案表面，然后借助生物素和鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合實現(xiàn)熒光標(biāo)記的鏈霉親和素在生物素化表面黏附. 圖5(b)~5(d)為不同形狀PAMEMA聚合物刷圖案化硅片表面經(jīng)點擊反應(yīng)和鏈霉親和素特異性結(jié)合后的熒光圖像，圖中可觀察到不同形狀的紅色熒光圖案，每種圖案都具有非常清晰的邊界，表明鏈霉親和素分子在微圖案區(qū)域的黏附，間接表明生物素分子的區(qū)域選擇性分布.

  

Fig. 5  (a) Schematic of "click" immobilization of biotins to the PAMEMA brushes through the highly specific orthogonal reactivity between azido groups and dibenzocyclooctyne (DBCO) groups and subsequent streptavidin-fluorophore conjugate binding. (b-d) Fluorescence images of the obtained biotinylated surfaces with various shapes after streptavidin-Alexa Fluor 546 binding.

進一步研究圖案化PAMEMA聚合物刷結(jié)構(gòu)參數(shù)對表面固定生物素分子空間分布的影響. 設(shè)計圖6(a)所示的包含不同灰度值同心正方形圖案的數(shù)字灰度圖像，通過DMD圖案化投影系統(tǒng)的灰度曝光方式產(chǎn)生包含不同區(qū)域曝光強度的曝光圖案(圖6(b))以引發(fā)聚合反應(yīng)制備PAMEMA聚合物刷微圖案. 圖6(c)和6(d)分別為制備得到的PAMEMA聚合物刷微圖案的3D形貌圖像及厚度分析曲線，由圖可知區(qū)域灰度值差異將導(dǎo)致聚合物刷厚度的變化，從而實現(xiàn)臺階結(jié)構(gòu)聚合物刷微圖案的制備. 厚度分析表明，在低灰度值下，PAMEMA刷的厚度隨灰度值增加而顯著增大，這是因為灰度值越大意味著光照強度越高，激發(fā)產(chǎn)生的自由基數(shù)量越多，從而提高ATRP聚合反應(yīng)速率. 當(dāng)灰度值超過一定值時，反應(yīng)溶液中自由基濃度趨于飽和，ATRP聚合反應(yīng)速率不再發(fā)生變化，PAMEMA刷的厚度也不再發(fā)生變化. 圖6(e)和6(f)分別為具有臺階結(jié)構(gòu)的PAMEMA聚合物刷微圖案表面經(jīng)點擊反應(yīng)和鏈霉親和素特異性固定后的熒光圖像及熒光強度分析曲線. 圖中可以觀察到熒光強度由邊緣向中心呈階梯狀增大的熒光圖案，間接表明生物素分子在PAMEMA聚合物刷微圖案表面的分布密度由邊緣向中心逐漸增大，這是因為PAMEMA刷越厚的區(qū)域，其表面疊氮基團密度越大，則點擊固定的生物素分子數(shù)量越多. 以上結(jié)果表明，通過控制PAMEMA刷的厚度可以對其表面錨固生物素分子的空間分布進行調(diào)控以制備具有密度變化的生物素化表面. 圖6(g)~6(h)為具有不同臺階結(jié)構(gòu)的PAMEMA聚合物圖案化表面經(jīng)生物素分子錨固及鏈霉親和素染色后的熒光圖像，各種形狀微圖案表面明顯的熒光強度變化表明以疊氮功能化聚合物刷微圖案為模板制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)生物素化梯度表面的能力.

  

Fig. 6  Designed digital grayscale image (a) with different gray values for fabricating PAMEMA brush micropattern and corresponding exposure image (b). 3D topography image (c) and corresponding height analysis (d) of the obtained PAMEMA brush micropattern. Fluorescence image (e) and corresponding fluorescence intensity profile (f) of pyramid PAMEMA brush micropattern with biotin immobilization and streptavidin-Alexa Fluor 546 binding. (g, h) Fluorescence images of biotinylated gradient surfaces in arbitrary complex shapes after streptavidin-Alexa Fluor 546 staining.