用于增強結(jié)腸癌化療的腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)甘草酸膠束

作者：韓子意白雪峰王鈺璋陳其文張先正來源：《高分子學(xué)報》日期：2022-06-16人氣：3265

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康，且呈現(xiàn)年輕化、發(fā)病率和死亡率屢創(chuàng)新高的特點^[1]. 由于大多數(shù)CRC患者確診時即為晚期，伴隨遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)切除的機會. 因此，化療是CRC的主要治療手段^[2]. 然而，在反復(fù)給藥后，患者會產(chǎn)生耐藥性從而導(dǎo)致化療失敗. 其中，腫瘤細(xì)胞表面P-糖蛋白(P-gp)的過度表達(dá)是導(dǎo)致化療抵抗的主要原因之一^[3]. P-糖蛋白可以識別和結(jié)合大多數(shù)疏水性化療藥物，將藥物“泵”到腫瘤細(xì)胞外，降低胞漿內(nèi)有效藥物濃度，從而削弱化療療效^[4]. 癌癥患者一旦出現(xiàn)耐藥性問題，即使改用替代性化療藥物或者增大藥物用量，都很難改善治療效果，而且會產(chǎn)生更加嚴(yán)重的毒副作用^[5]. 因此，迫切需要解決腫瘤化療耐藥的問題.

抑制腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)是增強腫瘤化療的有效策略. 一些P-gp抑制劑，如基因干擾siRNA能直接沉默P-gp基因表達(dá)，具有良好治療潛力^[6]. 然而，siRNA是帶負(fù)電的生物大分子，容易在血液循環(huán)中被降解，細(xì)胞攝取差且轉(zhuǎn)染效率低^[7]. 采用納米顆粒^[8]，如脂質(zhì)體^[9]和聚合物納米粒子^[10]包裹化療藥物和siRNA，可以實現(xiàn)二者的高效遞送，減少P-gp表達(dá)，增強治療效果^[11]. 但是，這些納米載體通常十分復(fù)雜，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)^[12]. 其次，基因藥物siRNA和小分子化療藥物在理化性質(zhì)和藥代動力學(xué)上存在很大差異，影響治療效率^[13]. 再則，siRNA及納米載體的生物安全性評估也是個問題^[14]. 因此，開發(fā)符合臨床轉(zhuǎn)化需求的納米載體克服化療耐藥十分關(guān)鍵^[15,16].

腸道菌群紊亂在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色^[17]. 文獻(xiàn)表明，結(jié)腸癌患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，并伴隨大量分泌酶活性的增強: 如膽固醇脫氧酶，α-脫羥酶和β-葡萄糖醛酸酶^[18]等. 其中，β-葡萄糖醛酸酶的濃度在結(jié)腸區(qū)域和腫瘤部位的活性比正常組織提高12.1倍^[19]. 基于此，本文設(shè)計了一種腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)的甘草酸自組裝載藥膠束(DOX@GLCS)，實現(xiàn)原位P-gp抑制劑的生成和化療藥物的遞送，從而克服結(jié)腸癌化療耐藥(?如圖1). 甘草酸(glycyrrhizin, GL)是一種從甘草中提取的藥用分子，已在臨床上使用了二十多年，具有良好的生物相容性^[20]. GL由親水性的葡萄糖酸和疏水性的甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)通過糖苷鍵連接而成^[21]. 通過親疏水自組裝，GL形成膠束，包載疏水性藥物阿霉素(doxorubicin, DOX). 同時，在GL膠束表面靜電吸附正電性殼聚糖(chitosan, CS)，構(gòu)建DOX@GLCS載藥系統(tǒng). 作為一種前藥自組裝載藥體系，DOX@GLCS具有高載藥量、高穩(wěn)定性和高腫瘤選擇性特點^[22,23]. 口服給藥后^[24]，膠束在胃和小腸中保持穩(wěn)定，并有效地積累到結(jié)腸腫瘤區(qū)域. 這里，細(xì)菌分泌的葡萄糖醛酸酶^[25]迅速水解甘草酸的糖苷鍵，導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)破壞，釋放藥物DOX. 同時，甘草酸轉(zhuǎn)化為P-gp抑制劑甘草次酸，有效地降低了腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)^[26]. 在2種原位結(jié)腸癌小鼠模型中，口服DOX@GLCS顯著地抑制了腫瘤生長. 此外，殼聚糖作為一種益生元，被腸道有益菌代謝，調(diào)節(jié)失調(diào)的腸道菌群和過激的炎性狀態(tài)，修復(fù)受損的腸道黏膜^[27,28]. 該膠束結(jié)構(gòu)簡單，成藥性好，高效逆轉(zhuǎn)了腫瘤耐藥，為增強腫瘤化療提供了新可能.

Fig. 1 (a) Preparation of gut microbial glucuronidase-responsive DOX@GLCS micelles for delivery of DOX and in situ generation of P-gp inhibitor to overcome colon cancer chemotherapy resistance. (b) The molecular illustration for the self-assembly of DOX@GLCS micelles and production of P-gp inhibitor, GA. (c) Schematic representation of DOX@GLCS micelles to overcome CRC drug resistance and intentinal mucosal repair.

1 實驗部分

1.1 主要原料

甘草酸和甘草次酸購自上海麥克林生化科技有限公司. 阿霉素、芘和FITC-葡聚糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司. 殼聚糖、冰醋酸、丙酮、DMSO和三乙胺購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司. 3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化銨(MTT)、RPMI 1640培養(yǎng)基、Dulbecco改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉菌、嘌呤霉素和胎牛血清(FBS)均來自GIBCO Invitrogen公司.

1.2 臨界膠束濃度(CMC)測定

膠束的CMC值根據(jù)芘熒光探針法測定^[29]. 分別向7個樣品管中加入0.1 mL芘的丙酮溶液(6 × 10^-6 mol/L)，靜置24 h，待溶液揮發(fā)完全后依次向樣品管中加入1 mL不同濃度的甘草酸溶液(濃度分別為1000，500，250，125，62.5，31.3和15.6 mg/L)，室溫靜置12 h后，用熒光分光光度計檢測熒光強度(發(fā)射波長為393 nm). 以熒光光譜(300~360 nm)的第三振動帶I₃和第一振動帶I₁的比值為縱坐標(biāo)，以甘草酸濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，曲線切線的交點即CMC值.

1.3 DOX@GLCS膠束的制備

將抗癌藥物鹽酸阿霉素溶于DMSO，加入三乙胺去除鹽酸以獲得疏水性藥物DOX.

將1 mg脫鹽阿霉素溶解于0.05 mL DMSO中，得到藥物溶液. 將制得的藥物溶液加入到甘草酸(1 mg/mL, 7 mL)溶液中，在室溫下避光攪拌1 h, 得到GL載藥膠束.

將1 mg殼聚糖加入到1 mL 2%冰醋酸溶液中，攪拌過夜，使殼聚糖充分溶解. 將殼聚糖溶液快速加入到上述GL載藥膠束溶液中，超聲10 min，11000 r/min離心收集最終產(chǎn)品DOX@GLCS.

1.4 膠束載藥量和體外釋藥行為測定

將1 mg DOX@GLCS膠束分散于1 mL DMSO中，通過DOX在DMSO中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(激發(fā)波長為488 nm)計算膠束中的DOX含量，并計算藥物的載藥量.

載藥量% = (材料中包載的藥物質(zhì)量/材料的質(zhì)量) × 100%

為研究阿霉素體外釋放行為，將1 mg/mL DOX@GLCS膠束分別在模擬胃液(SGF, pH=2.0)、模擬小腸液(SIF, pH=6.8)和模擬結(jié)腸液(SCF, pH=7.4, 20%小鼠糞便濾液)中孵育24 h^[30]，并于1、2、4、8、12、24 h收集上清液. 釋放出的DOX含量通過熒光分光光度計進(jìn)行檢測，最終參照DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出累積釋放量.

累積釋放量% = (某時刻已經(jīng)釋放的藥物量/材料中總的藥物量) × 100%

1.5 粒徑、電勢和透射電子顯微鏡(TEM)

膠束的粒徑和電勢在25 ℃條件下用Nano-ZS-ZEN 3600 (馬爾文儀器)進(jìn)行測定，所有數(shù)據(jù)均獨立測定3次，并以3次數(shù)據(jù)的平均值作為最終測定結(jié)果. 膠束的微觀形貌通過透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本)進(jìn)行觀測.

1.6 高效液相色譜(HPLC)分析

采用高效液相色譜法(HPLC)分析腸道菌群對DOX@GLCS膠束的體外降解行為^[31]. 簡單地說，從小鼠中取0.5 g盲腸內(nèi)容物，懸浮在含有1 mg/mL DOX@GLCS膠束的40 mL厭氧培養(yǎng)基中，將混合物在37 ℃下培養(yǎng)24 h. 將所有樣品液過濾以去除細(xì)菌. 在30 mL氯仿中超聲提取上清液，并將所有的提取物混合在一起，在水浴中蒸發(fā)至干燥. 將殘渣溶解于甲醇中，3000 r/min離心5 min，用于高效液相色譜分析. 采用C-18柱進(jìn)行測試. 流動相為甲醇/乙酸銨溶液(0.2 mol/L)/冰醋酸(65/34/1，V/V/V)；流速：1 mL/min；檢測波長為250 nm；進(jìn)樣20 μL；樣品運行時間為40 min.

1.7 細(xì)胞攝取實驗

CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1%青霉素-鏈霉素，10000 U/mL). 轉(zhuǎn)染熒光素酶的CT26^luc細(xì)胞在添加5%嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng). HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞和NCM460人正常腸上皮細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).

采用熒光共聚焦顯微鏡(CLSM)和流式細(xì)胞術(shù)探索結(jié)腸癌細(xì)胞對DOX@GLCS膠束攝取行為. 將CT26細(xì)胞接種于六孔板并在37 ℃下培養(yǎng)24 h. 同時，DOX和DOX@GLCS膠束(阿霉素含量為2和4 μg/mL)分別與模擬結(jié)腸液SCF共培養(yǎng)24 h. 收集上清，并與CT26細(xì)胞孵育4 h. 將CT26細(xì)胞洗滌3次，重懸于PBS中用CLSM觀察細(xì)胞內(nèi)熒光情況. 對于流式細(xì)胞分析實驗，細(xì)胞被消化收集來定量分析材料的內(nèi)吞行為.

1.8 細(xì)胞毒性檢測

用MTT法測定材料的細(xì)胞毒性. 為了評估GLCS空白膠束對正常細(xì)胞NCM460的細(xì)胞毒性，將NCM460細(xì)胞接種于96孔板并在37 ℃下培養(yǎng)24 h. 然后，分別加入不同濃度梯度的GLCS溶液(31.3、62.5、125、250、500和1000 μg/mL)，繼續(xù)孵育24 h. 接著，加入MTT溶液 (5 mg/mL, 10%). 4 h后，加入150 μL DMSO，在570 nm處測定溶解的甲瓚紫的吸光度.

為了評估DOX@GLCS膠束的細(xì)胞毒性，將CT26細(xì)胞或HCT116細(xì)胞接種于96孔板并在37 ℃下培養(yǎng)24 h. 同時，將不同濃度的游離DOX或DOX@GLCS膠束(DOX濃度: 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μg/mL)分別與SCF共培養(yǎng)24 h. 收集上清液，加入到CT26細(xì)胞或HCT116細(xì)胞中孵育24 h，用于后續(xù)MTT檢測.

為了直接證明腸道菌群代謝產(chǎn)生的甘草次酸的化療增敏作用，將1 mg/mL甘草次酸溶液和不同濃度的DOX溶液(DOX濃度: 0.25、0.5、1和2 μg/mL)共混，加入到CT26細(xì)胞中孵育24 h，用于后續(xù)MTT檢測.

1.9 誘導(dǎo)DOX耐藥CT26細(xì)胞(CT26^DOX)

采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)耐阿霉素CT26細(xì)胞(CT26^DOX). 詳細(xì)地，將CT26^luc細(xì)胞與含50 ng mL^-1 DOX的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h. 去除死細(xì)胞，存活下來的細(xì)胞進(jìn)一步與含50 ng/mL DOX的培養(yǎng)基共孵育. 同樣地，收集活細(xì)胞再進(jìn)一步培養(yǎng). 經(jīng)過3個循環(huán)后，CT26^luc細(xì)胞能在含50 ng/mL DOX的培養(yǎng)基中正常生長. 接著，將DOX濃度提高到100 ng/mL，并重復(fù)上述篩選周期. 最終，CT26^luc細(xì)胞在含300 ng/mL DOX的培養(yǎng)基中生長良好，證明成功誘導(dǎo)了DOX耐藥的CT26細(xì)胞CT26^DOX.

1.10 體內(nèi)抗腫瘤效果評估

所有活體動物實驗均遵從武漢大學(xué)動物實驗中心動物護理機構(gòu)和使用委員會及依據(jù)動物管理條例進(jìn)行. 建立2種結(jié)腸癌小鼠模型用來評價DOX@GLCS膠束的抗腫瘤效果. 其中，將轉(zhuǎn)染熒光素酶的CT26^luc細(xì)胞(50 μL/小鼠，1×10⁶個細(xì)胞)植入BALB/c小鼠盲腸，建立原位結(jié)腸癌小鼠模型. 將轉(zhuǎn)染熒光素酶的CT26^DOX細(xì)胞(50 μL/小鼠，1×10⁶個細(xì)胞)植入BALB/c小鼠盲腸，建立原位耐阿霉素結(jié)腸癌小鼠模型.

在原位CT26荷瘤小鼠模型中，利用小動物活體成像系統(tǒng)(in vivo imaging system, IVIS)觀察CT26^luc腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光情況，以反映腫瘤大小. 臨床上，阿霉素通常靜脈給藥. 為了闡明口服載藥膠束具有比臨床標(biāo)準(zhǔn)療法更強的治療效果，阿霉素以靜脈注射方式給藥而載藥膠束以口服方式給藥. 將結(jié)腸癌小鼠隨機分為4組，每組5只. 分別靜脈注射PBS、DOX或口服GLCS，DOX@GLCS膠束. 每4天獲取1次小鼠腫瘤部位生物發(fā)光圖像，并對最后一次各組小鼠生物發(fā)光進(jìn)行定量分析. 治療結(jié)束后，收集小鼠腫瘤做進(jìn)一步分析. 在原位CT26^DOX荷瘤小鼠模型中，將小鼠隨機分為3組，每組5只，分別靜脈注射PBS、DOX或口服DOX@GLCS膠束. 每7天獲取1次小鼠腫瘤部位生物發(fā)光圖像. 在治療第15天后，通過CT成像檢測每組小鼠腫瘤大小. 實驗結(jié)束后處死小鼠，取腫瘤組織進(jìn)行病理分析和P-gp定量檢測. 所有動物實驗中DOX@GLCS膠束組DOX和游離DOX組DOX的劑量相同，均為5 mg/kg. 給藥頻率均為3天1次, 共計給藥5次.

1.11 腸道通透性評估

口服化療藥物會造成嚴(yán)重的腸道毒副作用. 殼聚糖具有良好的腸黏膜修復(fù)功能. 這里，通過體內(nèi)腸道通透性實驗研究DOX@GLCS膠束對腸道的保護作用^[32]. 簡而言之，在獲取完最后一次小鼠生物發(fā)光圖像后，小鼠被禁食禁水4 h，然后灌胃0.6 mg/g的4 kDa FITC-葡聚糖溶液，3 h后采集小鼠外周血，測定血清中FITC的熒光強度，來反映“腸漏”的嚴(yán)重程度(激發(fā)波長：485 nm，發(fā)射波長：525 nm).

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以平均值±SEM表示. 采用GraphPad Prism 8軟件分析差異的統(tǒng)計學(xué)意義. 兩組間差異采用雙尾t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比較檢驗. 統(tǒng)計學(xué)根據(jù)顯著性檢驗方法所得到的P 值，以P < 0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P < 0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，P < 0.001為有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 臨界膠束濃度測定

為驗證兩親性甘草酸能自組裝形成膠束，本文采用芘熒光探針法測定了甘草酸的臨界膠束濃度. 如圖2(a)所示，測得甘草酸的CMC值為0.57 mg/mL，說明甘草酸在濃度高于0.57 mg/mL時能自組裝形成膠束，可以將疏水藥物阿霉素包載在其疏水空腔內(nèi)，具有高效載藥能力.

Fig. 2 The synthesis and characterization of DOX@GLCS micelles. (a) The critical micelle concentration (CMC) of glycyrrhizin (GL). TEM images of (b) GLCS micelles and (c) DOX@GLCS micelles. (d) The size distribution of GLCS and DOX@GLCS micelles. (e) The size stability and (f) zeta potential stability of DOX@GLCS micelles.

2.2 膠束形貌和粒徑特征

圖2(b)和2(c)分別是空白膠束GLCS和載藥膠束DOX@GLCS的透射電鏡照片. 照片清晰地顯示膠束為規(guī)則的球形，分散良好. 動態(tài)光散射結(jié)果表明，膠束載藥前后的粒徑分別為252和165 nm，且有較窄的粒徑分布(PDI分別為0.223和0.164). 包載阿霉素后膠束粒徑變小，這歸功于正電性的阿霉素對整個膠束靜電體系的平衡，從而使得膠束更穩(wěn)定，粒徑更小(圖2(d)).

穩(wěn)定性是納米載藥體系臨床轉(zhuǎn)化的重要評價指標(biāo). 將DOX@GLCS膠束在PBS中保存1周，并于第1、2、3、5和7天分別測定膠束的粒徑和電勢. 結(jié)果如圖2(e)和2(f)所示，膠束在1周內(nèi)具有良好的時間穩(wěn)定性，這有利于膠束的體內(nèi)長循環(huán)，增強療效.

2.3 膠束載藥和釋藥性能研究

膠束的載藥量通過測定計算為17.1%，說明該體系能有效包載疏水藥物. DOX@GLCS膠束響應(yīng)腸道菌群觸發(fā)釋藥行為如圖3(a)和3(b)所示. 經(jīng)SIF和SGF培養(yǎng)后，藥物釋放緩慢，24 h內(nèi)的釋藥量不足10%. 動態(tài)光散射結(jié)果顯示膠束的粒徑在整個過程中也基本保持不變. 其優(yōu)異的穩(wěn)定性是由于帶正電荷的殼聚糖和阿霉素與帶負(fù)電荷的甘草酸間的強靜電相互作用. 相比之下，經(jīng)SCF共培養(yǎng)后，DOX釋放明顯，在8 h內(nèi)達(dá)到70%，24 h內(nèi)達(dá)到90%. 同樣，膠束粒徑也隨之變大，意味著膠束結(jié)構(gòu)被破壞. 以上結(jié)果表明，口服DOX@GLCS膠束可以實現(xiàn)藥物在富含細(xì)菌的腸道和腫瘤組織中特異性釋放，避免了在胃部的提前泄露.

Fig. 3 The gut microbiota-responsive drug release behaviour of DOX@GLCS micelles. (a) The release profiles of DOX from DOX@GLCS micelles in SGF, SIF, and SCF conditions. (b) The particle sizes of DOX@GLCS micelles under different conditions. (c) The HPLC analysis of GL after incubation with gut microbiota. The yellow curves represent the GL and decomposed GL under SCF conditions, respectively. The blue curve represents the produced GA.

隨后，通過高效液相色譜(HPLC)分析腸道菌群對甘草酸的代謝轉(zhuǎn)化行為. 如圖3(c)所示，膠束經(jīng)SCF共培養(yǎng)后，甘草酸的峰強度顯著降低(31 min). 同時，在27 min時出現(xiàn)了甘草次酸的特征峰，表明腸道菌群轉(zhuǎn)化了膠束中的甘草酸，生成了P-gp抑制劑甘草次酸.

2.4 載藥膠束的腫瘤細(xì)胞抑制效果評估

膠束經(jīng)腸道菌群代謝產(chǎn)生的甘草次酸是一種有效的P-gp抑制劑，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)藥物積累，增敏結(jié)腸癌化療. 因此，我們評估了載藥膠束在細(xì)胞水平上克服化療耐藥性的能力. 為了確保DOX@GLCS膠束的安全性，首先對膠束進(jìn)行生物相容性研究. 如圖4(a)所示，空白膠束對正常腸上皮細(xì)胞NCM460沒有明顯毒性. 隨后，通過MTT法探究了膠束對結(jié)腸癌細(xì)胞的化療增敏作用. 將游離DOX和DOX@GLCS膠束分別與模擬結(jié)腸液SCF共培養(yǎng)后，測定其對CT26細(xì)胞或HCT116細(xì)胞的殺傷效果. 如圖4(b)和4(c)所示，相比游離DOX，DOX@GLCS膠束具有更強的細(xì)胞毒性. 將甘草次酸和阿霉素共混后，阿霉素毒性增強，說明DOX@GLCS膠束能增強化療效果是產(chǎn)生的甘草次酸的結(jié)果(圖4(d)).

Fig. 4 The enhanced chemotherapy effect of micelles in vitro. (a) The cell viability of NCM460 cells treated by DOX free GLCS micelles. The cell viability of CT26 cells (b) and HCT116 cells (c) treated by free DOX and DOX@GLCS micelles with different DOX concentrations. (d) The cell viability of CT26 cells treated by free DOX and DOX+GA with different DOX concentrations. (e) The CLSM images of CT26 cells treated by free DOX and DOX@GLCS micelles (DOX concentrations were 2mg/L and 4mg/L, respectively). The scale bar is 100 μm. (f) The mean fluorescence intensity (MFI) of DOX in CT26 cells measured by flow cytometer. (g) The P-gp expression of CT26 cells treated by free DOX and DOX@GLCS micelles.

共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)結(jié)果顯示相比游離DOX，DOX@GLCS膠束處理后的CT26細(xì)胞具有更強的熒光強度，意味著更多的DOX積累(圖4(e)). 流式定量結(jié)果進(jìn)一步表明，該膠束顯著提高了腫瘤細(xì)胞對阿霉素的攝取能力(圖4(f)). 為了證明DOX@GLCS膠束通過抑制腫瘤細(xì)胞P-gp的表達(dá)來提高藥物攝入，通過定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析腫瘤細(xì)胞在mRNA水平上P-gp的表達(dá)情況. 與DOX處理相比，DOX@GLCS膠束顯著地抑制了CT26細(xì)胞的P-gp表達(dá)(圖4(g)). 以上結(jié)果表明，DOX@GLCS膠束在腸道菌群作用下，生成甘草次酸抑制了腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)，提高了胞內(nèi)有效藥物濃度，從而增強了阿霉素化療效果.

接著，我們進(jìn)一步在耐阿霉素CT26細(xì)胞株(CT26^DOX)中評估了載藥膠束的化療增敏效果. 如圖5(a)~5(c)所示，DOX對CT26^DOX細(xì)胞的半致死量濃度(IC₅₀)值是正常CT26細(xì)胞的3倍. CT26^DOX的P-gp表達(dá)也增加了3倍，表明成功誘導(dǎo)了阿霉素耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞(圖5(d)). 和游離DOX相比，DOX@GLCS膠束表現(xiàn)出對CT26^DOX細(xì)胞更強的殺傷效果(圖5(e)). 與CT26細(xì)胞的實驗結(jié)果一致，經(jīng)DOX@GLCS膠束處理后，CT26^DOX細(xì)胞P-gp表達(dá)也明顯降低(圖5(f)).

Fig. 5 The enhanced chemotherapy effect of micelles for DOX-resistant CT26 cells as compared with free DOX. The cell viability of CT26 cells (a) and CT26^DOXcells (b) treated by free DOX with different concentrations. (c) The IC₅₀ value of CT26 cells and DOX-resistant CT26^DOXcells. (d) The P-gp expression of CT26 cells and DOX-resistant CT26^DOXcells. (e) The cell viability of CT26^DOXcells treated by free DOX and DOX@GLCS micelles. (f) The P-gp expression of DOX-resistant CT26^DOX cells treated by free DOX and DOX@GLCS micelles.

2.5 載藥膠束體內(nèi)抗腫瘤效果評估

根據(jù)體外實驗結(jié)果，我們對膠束體內(nèi)抗腫瘤效果進(jìn)行了評估. 通過小動物活體成像系統(tǒng)定量腫瘤組織的發(fā)光強度，以反映腫瘤大小. 如圖6(a)和6(b)所示，DOX@GLCS膠束處理的小鼠生物發(fā)光最弱，表明腫瘤體積最小. 單獨使用GLCS或DOX治療組的小鼠生物發(fā)光很強，意味著其不能有效抑制腫瘤生長. 治療結(jié)束后，收集各組腫瘤，同樣表明DOX@GLCS膠束抗腫瘤效果最好(圖6(c)).

Fig. 6 The antitumor efficacy of micelles in orthotopic CT26-bearing mice models as compared with free DOX. (a) In vivo whole-body bioluminescence images of tumor-bearing mice treated by PBS, DOX, GLCS, and DOX@GLCS micelles. Three representative mice per treatment group are shown. (b) Mean bioluminescence intensity of mice after different treatments. (c) Representative images of excised tumors at the end of experiments.

為了更好地證明DOX@GLCS膠束的化療增敏能力，我們進(jìn)一步建立了原位耐阿霉素結(jié)腸癌小鼠模型. 如圖7(a)所示，對照組小鼠由于腫瘤負(fù)荷過大，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象. DOX@GLCS膠束處理的小鼠生物發(fā)光最弱，表明腫瘤體積最小. 游離DOX不能有效抑制腫瘤生長. 在治療15天后，小鼠CT成像同樣表明DOX@GLCS膠束處理的小鼠腫瘤最小(圖7(b)). 治療結(jié)束后處死小鼠，收集各組腫瘤組織，H&E切片和Ki67免疫熒光染色顯示經(jīng)DOX@GLCS膠束治療后，腫瘤組織呈現(xiàn)出最明顯的細(xì)胞凋亡(圖7(c)). 隨后，檢測了各組腫瘤的P-gp表達(dá)情況. 反復(fù)注射DOX后，腫瘤組織P-gp表達(dá)明顯升高，這與化療誘導(dǎo)耐藥的臨床問題一致. 相反地，DOX@GLCS治療顯著下調(diào)了P-gp表達(dá)，增強了藥物療效(圖7(d)). 最后，對小鼠腸道通透性進(jìn)行了評估. 如圖7(e)所示，經(jīng)殼聚糖修飾的載藥膠束DOX@GLCS治療后，小鼠腸道通透性得到了明顯改善，說明該藥物遞送系統(tǒng)具有良好的腸道黏膜修復(fù)功能.

Fig. 7 The antitumor efficacy of micelles in orthotopic CT26^DOX-bearing mice models as compared with free DOX. (a) In vivo whole-body bioluminescence images of orthotopic CT26^DOX-bearing mice treated by PBS, DOX, and DOX@GLCS micelles. Three representative mice per treatment group are shown. (b) CT images of mice after different treatments. (c) H&E images and Ki67 images of intestinal tissues of orthotopic CT26^DOXtumor-bearing mice treated by PBS, DOX and DOX@GLCS micelles (Scale bar = 50 μm). (d) The P-gp expression of CT26^DOX tumor tissues treated by PBS, DOX and DOX@GLCS micelles. (e) The intestinal permeability of mice after different treatments.

3 結(jié)論

本文設(shè)計了一種腸道菌群葡萄糖醛酸酶響應(yīng)載藥膠束用于克服結(jié)腸癌化療耐藥. 通過親疏水自組裝，構(gòu)建包載疏水藥物DOX的GL膠束. 隨后，在GL膠束表面修飾殼聚糖構(gòu)建DOX@GLCS載藥體系. 口服給藥后，DOX@GLCS在腸道菌群作用下裂解，釋放DOX. 同時，細(xì)菌分泌的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化甘草酸生成甘草次酸，抑制腫瘤耐藥蛋白P-gp表達(dá). 在2種原位結(jié)腸癌小鼠模型中，DOX@GLCS治療均顯著地增強了化療效果，并修復(fù)了受損的腸道黏膜. 該菌群觸發(fā)釋藥型膠束為克服CRC化療耐藥性提供了新策略.

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