黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表達(dá)

脂肪酶(EC 3.1.1.3,lipase)又稱為三?；视退饷福且活愔匾乃饷?，可催化酯水解、酯化和酯交換等反應(yīng)[1-3]。脂肪酶普遍存在于自然界中，在植物、動(dòng)物和微生物中均有發(fā)現(xiàn)[4]。目前脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要利用微生物發(fā)酵[5-6]。脂肪酶在兩相界面、水性介質(zhì)或有機(jī)相體系中均能進(jìn)行催化反應(yīng)，是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵酶，在生物柴油、食品、化妝品、皮革、紡織、洗滌業(yè)和制藥等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[7-8]。

黑曲霉作為外源蛋白表達(dá)宿主，具有優(yōu)異的蛋白分泌能力、準(zhǔn)確的翻譯后加工能力以及出色的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)具有良好的安全性。黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)重組蛋白領(lǐng)域具有巨大潛力，逐漸成為蛋白工廠[9-10]。黑曲霉脂肪酶多為胞外酶，因此不僅可以利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，還能采用低成本的固體培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)。朱思遠(yuǎn)[11]通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶的表達(dá)量，開展了CRISPR/Cas9技術(shù)在黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用，構(gòu)建了尿嘧啶缺陷型菌株。但是近年來對于微生物資源的開發(fā)利用率相對較低，僅在1%左右[12]。脂肪酶在工業(yè)化生產(chǎn)中也面臨著生產(chǎn)效率不高的問題，因此探索提高脂肪酶產(chǎn)量和活力的方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[13-14]。

本研究利用生物學(xué)信息庫進(jìn)行信息分析和對比，對黑曲霉基因組中的脂肪酶功能基因進(jìn)行挖掘和篩選。利用原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法構(gòu)建黑曲霉工程菌，實(shí)現(xiàn)8種黑曲霉來源脂肪酶基因的同源表達(dá)。通過對表達(dá)質(zhì)粒啟動(dòng)子和信號肽的優(yōu)化以提高蛋白表達(dá)水平，并對重組脂肪酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)表征。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

黑曲霉(Aspergillus niger)AS3.350、E.coli DH5α、E.coli Rosetta(DE3)、黑曲霉MA、質(zhì)粒pCAMBIA和質(zhì)粒pET-28a(+)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料與試劑

DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA凝膠回收試劑盒，寶日醫(yī)(北京)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、片段純化試劑盒和RNA提取試劑盒，北京全式金生物有限公司；一步克隆連接試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 黑曲霉脂肪酶基因的生物信息分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找黑曲霉來源脂肪酶并比對分析后，選取了8個(gè)黑曲霉脂肪酶，目的基因詳情見表1。利用在線工具M(jìn)AFFT對這8個(gè)脂肪酶的編碼序列進(jìn)行多序列比對，利用在線工具SignalP4.1對這8個(gè)脂肪酶進(jìn)行信號肽預(yù)測等生物信息學(xué)分析。

表1 脂肪酶基因來源和氨基酸信息
Table 1 The sources of lipase gene and amino acid information

1.4 黑曲霉脂肪酶基因克隆與表達(dá)

黑曲霉AS3.350總RNA的提取、cDNA的制備與純化按照試劑盒說明書進(jìn)行，質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物酶切、連接、熱激法轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法及轉(zhuǎn)化子篩選等均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[15]。

1.5 黑曲霉工程菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的優(yōu)化

1.5.1 含不同信號肽質(zhì)粒的構(gòu)建

分別設(shè)計(jì)引物pCAMBIA-F和pCAMBIA-ScbhΙ-R；pCAMBIA-F和pCAMBIA-SANL-R以pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3為模板擴(kuò)增。將含有不同信號肽的目的基因與載體連接構(gòu)建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3和pCAMBIA-PglaA-SANL-H3重組質(zhì)粒。將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主，通過對酶活力的測定和SDS-PAGE分析，選擇最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)信號肽。

1.5.2 含不同啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物pCAMBIA-PglaA-F和pCAMBIA-PglaA-R以pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3為模板擴(kuò)增。將PglaA啟動(dòng)子與載體連接構(gòu)建pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主，通過酶活力的測定和SDS-PAGE分析，選擇最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)啟動(dòng)子。

1.6 黑曲霉工程菌的活化與發(fā)酵培養(yǎng)

將4 ℃保藏的菌種劃線到潮霉素B抗性質(zhì)量濃度為200 μg/mL的PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)4 d，用無菌水沖洗孢子做成孢子懸液，充分振蕩30 min。按0.8%的接種量接入到75 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)6 d。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉50，玉米漿30，豆粕粉20。

1.7 黑曲霉脂肪酶的分離與純化

收集發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液，用300目的過濾篩濾去菌絲體，將粗酶液于10 000 r/min離心10 min，保留上清液，再用0.22 μm的微濾膜進(jìn)行微濾。將粗酶液用鎳柱親和層析樹脂純化，收集純化的酶液，透析去除高濃度咪唑獲得純化后的酶溶液。

1.8 脂肪酶的酶活力測定方法

利用對硝基苯酚乙酸酯(pNPA)作為底物進(jìn)行脂肪酶酶活力的檢測。脂肪酶能夠水解pNPA產(chǎn)生對硝基苯酚(p-NP)。在pH 7.0，40 ℃條件下，1 min釋放1 μmol的p-NP為1個(gè)酶活力單位。

1.9 黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.9.1 酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在不同溫度(25～60 ℃)下，通過測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的水解活性來確定酶的最適反應(yīng)溫度。將最適溫度條件下的酶活力定義為100%。將酶溶液分別放置于不同溫度(25～60 ℃)下孵育2 h，每隔20 min取樣檢測酶液的水解活性，觀察ANL-H3的熱穩(wěn)定性。將放置0 h酶液的酶活力定義為100%。

1.9.2 酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

在不同pH值(pH 5.0～9.0)下，使用pNPA作為底物測定脂肪酶ANL-H3的水解活性來確定酶的最適pH。在4 ℃條件下，將酶液分別置于(pH 5.0～9.0)的緩沖溶液中2 h，每隔20 min取樣測定酶液的水解活性，觀察ANL-H3的pH穩(wěn)定性。將放置0 h的酶液的酶活力定義為100%。各pH緩沖體系分別為：50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH 5.0～5.5)；50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0～8.0)；50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5～9.0)。

1.9.3 酶的催化底物特異性

以不同碳鏈長度脂肪酸(C2～C16)的對硝基苯酚酯為底物，在40 ℃，pH 7.0的條件下測水解活性。將最高酶活力定義為100%。

1.9.4 金屬離子對酶活性的影響

在酶溶液中分別加入終濃度為1和5 mmol/L的金屬離子(Na+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+和Zn2+)，在4 ℃放置1.5 h，隨后測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以未添加金屬離子處理的酶液作為對照組。計(jì)算相對酶活力，將對照組的酶活力定義為100%。

1.9.5 有機(jī)溶劑對酶活性的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別加入5%、10%的有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、丙酮、DMF、DMSO和四氫呋喃)，在4 ℃放置1.5 h，測定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以不加有機(jī)溶劑的酶液作為對照組。計(jì)算相對酶活力，將對照組的酶活力定義為100%。

1.10 黑曲霉脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

在最佳測定條件下，計(jì)算黑曲霉脂肪酶ANL-H3在不同pNPA濃度下(1～100 mmol/L)的反應(yīng)初速度。利用軟件Origin 8.5非線性擬合(參考Michaelis-Menten方程)得到米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉脂肪酶基因的克隆及工程菌的構(gòu)建

利用生物學(xué)信息庫信息分析和全基因組檢索發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能與已知酶類似的同源酶編碼序列和一些未探究的編碼片段，對黑曲霉全基因組中脂肪酶功能基因進(jìn)行挖掘篩選，選取了8個(gè)來源于黑曲霉，分子質(zhì)量為20～40 kDa的黑曲霉脂肪酶基因。以黑曲霉AS3.350的cDNA為模板，對該8個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并命名為H1～H8。重組質(zhì)粒pCAMBIA-H1(-8)轉(zhuǎn)化在黑曲霉MA中，獲得H1(-8)重組黑曲霉工程菌，命名為MA-H1(-8)。

2.2 高活力黑曲霉脂肪酶工程菌的篩選

檢測8個(gè)黑曲霉工程菌MA-H1(-8)發(fā)酵10 d的上清液的脂肪酶活力，結(jié)果如圖1所示。轉(zhuǎn)化子MA-H2和MA-H3的酶活力較高，最高酶活力分別為1.37和1.41 U/mL。分別取重組脂肪酶轉(zhuǎn)化子酶活力最高的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，MA-H2、MA-H3的酶活力最高，相應(yīng)泳道中目的蛋白條帶也較粗，說明了這2個(gè)重組黑曲霉菌株有較高的蛋白表達(dá)量，考慮到最高酶活力以及發(fā)酵周期長短等因素，最終選擇黑曲霉脂肪酶ANL-H3基因作為目標(biāo)脂肪酶基因進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化研究。

圖1 黑曲霉工程菌發(fā)酵上清液的酶活力情況
Fig.1 Enzyme activity in fermentation supernatant of A. niger engineering strain

2.3 黑曲霉脂肪酶基因信號肽和啟動(dòng)子的優(yōu)化

信號肽對蛋白質(zhì)的外源表達(dá)具有非常關(guān)鍵的影響，信號肽連接目的蛋白形成1個(gè)蛋白嵌合體，最終的分泌效率受到其構(gòu)型、表面電荷分布和分子質(zhì)量等因素的影響[16]。擴(kuò)增帶有cbhΙ信號肽和ANL信號肽的目的基因，構(gòu)建pCAMBIA-PglaA-ScbhΙ-H3和pCAMBIA-PglaA-SANL-H3重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主。經(jīng)酶活力測定，以glaA、cbhΙ和ANL為信號肽的脂肪酶活力分別為1.41、1.12和0.57 U/mL。因此選擇glaA為最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)信號肽。

以黑曲霉cDNA為模板擴(kuò)增PglaA啟動(dòng)子，構(gòu)建pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主，以PglaA為啟動(dòng)子的重組工程菌的蛋白表達(dá)量更高，而且其脂肪酶酶活力為1.68 U/mL，比以PgpdA為啟動(dòng)子的重組菌的酶活力高，因此選擇PglaA為最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)啟動(dòng)子。通過插入基因的修飾以提高黑曲霉脂肪酶表達(dá)量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終選擇pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 黑曲霉脂肪酶的分離與純化

利用鎳離子親和層析柱純化酶蛋白，洗脫下來的蛋白溶液經(jīng)超濾管(10 kDa)超濾除鹽和濃縮，純化后脂肪酶的比活力達(dá)31.44 U/mg，純化倍數(shù)為65.5倍，但酶活力的回收率較低，僅為7.84%。

2.5 黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同的溫度下，ANL-H3的酶活力變化結(jié)果如圖2所示。在25～45 ℃，ANL-H3活性隨著溫度升高逐漸增加，ANL-H3的最適溫度是45 ℃。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，酶活力顯著下降。

圖2 溫度對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響
Fig.2 Effects of temperature on the activity of ANL-H3

進(jìn)一步測定了ANL-H3在不同溫度條件下保持2 h酶殘留的活力，以考察其熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。在25～40 ℃下，ANL-H3酶活力基本保持不變；在45～55 ℃下的仍可以保持80%以上的酶活力，當(dāng)酶蛋白在60 ℃處理2 h，酶活力開始下降，維持在初始活力的60%左右，說明ANL-H3擁有良好的熱穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，結(jié)合最適溫度與溫度穩(wěn)定性這2個(gè)因素，選擇45 ℃為最適反應(yīng)溫度。

圖3 黑曲霉脂肪酶ANL-H3的溫度穩(wěn)定性
Fig.3 The thermal stability of ANL-H3

2.5.2 酶最適pH和pH穩(wěn)定性

考察不同pH條件下脂肪酶ANL-H3的水解活性，結(jié)果如圖4所示，ANL-H3的最適pH為7.5，在pH 7.0～8.0都具有較高的活性，酶活力保持在85%以上。隨著pH的進(jìn)一步下降或升高，酶活力均明顯下降，表明ANL-H3的最適pH范圍為中性條件。

圖4 pH對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響
Fig.4 Effects of pH on the activity of ANL-H3

將該酶在4 ℃，不同pH條件下處理2 h，結(jié)果如圖5所示，ANL-H3在最適pH下最為穩(wěn)定，酶活力保持在95%以上；在pH 6.0～8.0，ANL-H3的酶活力均保持在75%以上，具有良好的穩(wěn)定性。在pH酸性或者強(qiáng)堿性條件下處理2 h，酶殘留活力下降至55%左右，結(jié)果表明該酶是一種pH中性酶。

圖5 黑曲霉脂肪酶ANL-H3的pH穩(wěn)定性
Fig.5 The pH stability of ANL-H3

2.5.3 酶的催化底物特異性

分別以不同碳鏈長度脂肪酸(C2～C16)的對硝基苯酚酯為催化底物，探究脂肪酶ANL-H3的底物特異性。由圖6可知，ANL-H3對不同碳鏈長度底物的水解活性不同，其中對pNPA的催化活性最高，具有較廣的底物特異性，對不同碳鏈長度脂肪酸酯的底物都有良好的催化活性。

圖6 黑曲霉脂肪酶ANL-H3對p-NP酯的底物特異性
Fig.6 Substrate specificity of ANL-H3 towards pNP esters

2.5.4 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子是影響酶催化性能的重要參數(shù)之一[17]。金屬離子可以通過與酶的二硫鍵作用，從而改變酶的結(jié)構(gòu)?？疾觳煌饘匐x子對ANL-H3的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明在離子濃度較低(1 mmol/L)時(shí)，金屬離子對脂肪酶的抑制作用不明顯，其中Mg2+、K+等有激活作用；當(dāng)離子濃度為5 mmol/L時(shí)，Mn2+、Cu2+完全抑制脂肪酶的活性，酶活力只有對照組的10%左右。Mg2+、K+等金屬離子對ANL-H3有較明顯的激活作用，可分別提高20%～30%左右的酶活力。

圖7 金屬離子對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響
Fig.7 Effects of metal ions on the activity of ANL-H3

2.5.5 有機(jī)溶劑對酶活力的影響

酶催化反應(yīng)可在非水相介質(zhì)中進(jìn)行，由于有機(jī)溶劑等非水相介質(zhì)對催化體系pH值、離子濃度及極性等性質(zhì)的改變，使得酶蛋白分子在非水相介質(zhì)中容易失去催化活性[18-19]。在酶催化反應(yīng)體系中分別加入5%和10%的有機(jī)溶劑，以不加有機(jī)溶劑作為對照組。由圖8可知，甲醇和DMSO對ANL-H3酶活力有一定的促進(jìn)作用，在甲醇和DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶活力分別為對照組126.5%和116.23%，其余4種溶劑對ANL-H3有不同程度的抑制作用。

圖8 有機(jī)溶劑對黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響
Fig.8 Effects of organic solvents on the activity of ANL-H3

2.6 黑曲霉脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以pNPA為底物，在0.1～3.0 mmol/L濃度下測定脂肪酶ANL-H3的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所得結(jié)果如圖9所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算，通過Origin 8.5擬合獲得的米氏常數(shù)Km為1.893 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為1.610 mmol/(L·min)，催化常數(shù)kcat為90.45 min-1，催化效率kcat/Km為47.78 L/(min·mmol)，kcat/Km被認(rèn)為能最全面的衡量酶催化能力的指標(biāo)，數(shù)值越大催化效率越高。ANL-H3的Km值低表明其對底物pNPA的親和力高，酶促反應(yīng)易于進(jìn)行[20]，且ANL-H3的Kcat/Km值較高，表明酶的催化效率較高。

圖9 黑曲霉脂肪酶ANL-H3以pNPA為底物的米氏方程圖
Fig.9 Michaelis-Menten equation diagram of ANL-H3 using pNPA as substrate

3 結(jié)論

本研究以1株低蛋白背景的黑曲霉MA作為表達(dá)宿主，構(gòu)建以潮霉素B抗性為篩選標(biāo)記的重組表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)8種不同黑曲霉脂肪酶基因在黑曲霉中的同源表達(dá)，確定表達(dá)最好的轉(zhuǎn)化子MA-H3-PglaA-SglaA。經(jīng)重組表達(dá)與分離純化后，該重組酶的比酶活力為31.44 U/mg，純化倍數(shù)為65.5倍，酶純化的回收率為7.84%。在以pNPA為底物時(shí)，酶的最適溫度為45 ℃，最適pH為7.5。ANL-H3對pNPA(C2)的水解活力最高，傾向于中短鏈脂肪酸的底物。在高濃度的金屬離子條件下，Mn2+、Cu2+使ANL-H3基本失活，K+、Mg2+等金屬離子對ANL-H3有較明顯的激活作用。ANL-H3對甲醇和DMSO有較好的有機(jī)溶劑耐受性。ANL-H3的米氏常數(shù)Km為1.893 mmol/L，Vmax為1.610 mmol/(L·min)，kcat為90.45 min-1，催化效率kcat/Km為47.78 L/(min·mmol)。