一株降解氨基甲酸乙酯釀酒酵母菌的篩選及鑒定

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，存在于許多發(fā)酵食品和發(fā)酵飲料中[1]，由含氮化合物不完全代謝產(chǎn)生[2]，該物質(zhì)于2007年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)從2B類提升至2A類致癌物[3]。許多發(fā)達(dá)國家對市場上各類酒精飲品中的EC含量出臺了限量標(biāo)準(zhǔn)[4]，由于人們對酒精飲料的廣泛攝入，其中EC帶來的問題愈來愈受到人們的關(guān)注。

葡萄酒中的EC主要由尿素和瓜氨酸與乙醇反應(yīng)生成，分離篩選低產(chǎn)EC或降解EC及其前體物質(zhì)尿素的菌株[5-7]，從源頭上控制EC是一條方便快捷且行之有效的途徑。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對降低發(fā)酵產(chǎn)品中EC的研究主要聚焦在篩選具有降解EC能力的菌株上，并進(jìn)一步研究所篩選菌株產(chǎn)生的EC水解酶的相關(guān)特性。KOBASHI等[8]首次從小鼠糞便中分離出1株檸檬酸桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌可將氨甲酸乙酯分解為乙醇和氨，并將具有這種降解能力的酶命名為urethanase。MOHAPATRA等[9]從海綿體螺旋藻中分離出有EC降解能力的微球菌，并初步研究了EC水解酶的特性；趙雅敏[5]從白酒大曲中篩選出1株具有EC降解能力的紅酵母，并通過固定化細(xì)胞的方法使得該菌對黃酒酒樣中EC的去除率從5%提高到了50%；楊廣明[10]從小鼠消化系統(tǒng)中篩選出1株對EC和尿素都有相對較強(qiáng)的降解作用的菌株，鑒定為Providencia sp.，并對酶的性質(zhì)做了初步研究；姚曉瑞寧[11]從香梨和葡萄中篩選出1株可以有效降解EC的魯考弗梅奇屬酵母；丁霞等[6]從濃香型白酒酒醅中分離得到1株能夠同時(shí)降低 EC 及其前體尿素的解淀粉芽孢桿菌。

目前可產(chǎn)生EC水解酶的菌株，對降低酒精飲料中的EC含量具有較強(qiáng)的能力，但菌株本身不可直接用于葡萄酒的釀造。因此，本研究以篩選1株發(fā)酵葡萄酒性能良好且可降解EC的酵母菌為目標(biāo)，從釀酒葡萄、干化葡萄和白酒酒醅中分離數(shù)株有EC降解能力的酵母菌，并對這些菌株進(jìn)行發(fā)酵性能考察，以期為控制葡萄酒中EC含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒葡萄：寧夏銀川賀蘭縣寧夏園藝產(chǎn)業(yè)園種植的多個(gè)釀酒葡萄品種；干化葡萄：寧夏吳忠青銅峽產(chǎn)區(qū)2019年赤霞珠，經(jīng)干化處理；白酒酒醅：寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

YPD培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、WL培養(yǎng)基：均為商業(yè)培養(yǎng)基，購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，按使用說明加蒸餾水溶解后滅菌。

液體篩選培養(yǎng)基(g/L)：EC作為唯一氮源，EC 2.5，葡萄糖2.0，KH2PO4 2.0，乙酸鈉2.0，NaCl 2.0，溴甲酚紫0.001，若配置固體培養(yǎng)基則加入瓊脂20.0；pH 5.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨1.0，葡萄糖2.0，NaCl 2.0，KH2PO4 2.5，EC 2.5，溴甲酚紫0.001；pH 5.0。

葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁與蒸餾水按1∶1的體積比配制。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

氨基甲酸乙酯(EC)、氨基甲酸丙酯(nPC)，北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、K2HPO4、KH2PO4、無水乙酸鈉、NaCl、蛋白胨、瓊脂、溴甲酚紫(以上試劑均為分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠；二氯甲烷、正己烷、甲醇(以上試劑均為色譜純)，阿拉丁(上海)試劑有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器、BSD-150型生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；8860-5977B型GC-MS聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；NBS-I型氮吹儀，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；PEN3型電子鼻，德國Airsense公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選

1.3.1.1 初篩

將多個(gè)品種的釀酒葡萄鮮果、干化葡萄破碎后，常溫下自然發(fā)酵24 h；稱取酒醅10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，振蕩培養(yǎng)12 h，得到菌懸液。將菌懸液接種于液體篩選培養(yǎng)基中[10]，28 ℃培養(yǎng)24 h，對其進(jìn)行梯度稀釋，在WL培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，后經(jīng)過劃線分離純化得到純種的單菌落，對形態(tài)符合酵母菌形態(tài)的菌株進(jìn)行保存。再對每株菌進(jìn)行驗(yàn)證，將菌株再次接入液體篩選培養(yǎng)基，觀察是否發(fā)生變色反應(yīng)，若變色則證明其可以降解EC，在對其進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.1.2 復(fù)篩

將初篩得到的具有EC降解能力的菌株，接種至復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)10 d后，對復(fù)篩培養(yǎng)基中EC的含量進(jìn)行測定，從中選取EC降解能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行發(fā)酵性能比較。

1.3.1.3 發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)

(1)菌株的發(fā)酵能力試驗(yàn)。采用杜氏小管法，將菌株接種于內(nèi)置杜氏小管的試管中，28 ℃培養(yǎng)36 h，觀察杜氏小管氣泡體積，比較各菌株發(fā)酵能力的強(qiáng)弱。

(2)菌株的耐受性試驗(yàn)。將各菌株接種于體積分?jǐn)?shù)分別為3%、6%、9%、12%、15%的無水乙醇和SO2含量分別為60、180、300 mg/L的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)36 h，比較各菌株的耐受性。結(jié)合發(fā)酵性能和耐受性試驗(yàn)結(jié)果，從中選取較優(yōu)菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

(3)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。取經(jīng)過篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將赤霞珠葡萄除梗破碎后，裝入500 mL 三角瓶中，裝液量為70%，加入50 mg/L SO2和 20 mg/L果膠酶，65 ℃水浴20 min，用水迅速冷卻至室溫后接種酵母菌(細(xì)胞濃度為107 CFU/mL)，發(fā)酵溫度控制在28 ℃，發(fā)酵12 d 后，添加90 mg/L SO2，裝滿罐于4 ℃貯存，澄清數(shù)天后對各處理葡萄酒的理化指標(biāo)、EC、揮發(fā)性成分進(jìn)行測定，同時(shí)進(jìn)行電子鼻分析，以商業(yè)酵母XR作為對照。

1.3.2 菌株鑒定

18S rDNA分子鑒定：將上述菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)12 h，離心棄上清液，收集菌體。使用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母基因組，擴(kuò)增后送上海生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果采用 NCBI Blast中進(jìn)行同源序列比對，使用 MEGA X軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining) 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次置信度分析。

1.4 測定方法

1.4.1 EC的測定

復(fù)篩培養(yǎng)基樣品中EC的測定：樣品處理與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制參照文獻(xiàn)[12]的方法，GC-MS分析條件參照國標(biāo)GB 5009.223—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》，略有修改。葡萄酒中EC的測定：參照國標(biāo)GB 5009.223—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》，略有修改。

1.4.2 葡萄酒理化指標(biāo)的測定

總酸、酒精度和揮發(fā)酸含量參照國標(biāo) GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定，pH值使用pH計(jì)測定，總糖含量的測定使用苯酚硫酸法[13]。

色度、色調(diào)參照文獻(xiàn)[14]的方法測定。

1.4.3 葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

樣品的前處理與GC-MS分析條件參照文獻(xiàn)[15]的方法，定性、定量參照文獻(xiàn)[16]的方法，略有修改。

1.4.4 電子鼻分析

參照文獻(xiàn)[17]的方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解EC酵母菌的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

本研究利用EC水解酶能夠降解EC反應(yīng)產(chǎn)生氨與乙醇，從而使菌株可以在以EC為唯一氮源的培養(yǎng)基中存活，同時(shí)使溴甲酚紫由黃變紫的原理，篩選得到了18株酵母菌作為初篩目的菌株，菌株編號見表1。

表1 菌株初篩結(jié)果
Table 1 Preliminary screening results of strains

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

通過對初篩菌株接入的復(fù)篩培養(yǎng)基中EC濃度進(jìn)行比較(圖1)，有7株對EC有較高降解能力的酵母菌，對EC的降解量達(dá)到181.97～261.5 mg/L，分別為NXU5、NXU7、NXU8、NXU11-2、NXU12-2、NXU14、NXU17-1，對這7株菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 復(fù)篩培養(yǎng)基中EC含量
Fig.1 EC content in secondary screening medium 注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.3 發(fā)酵性能比較

2.1.3.1 發(fā)酵能力比較

對復(fù)篩結(jié)果中的7株菌種的產(chǎn)氣結(jié)果進(jìn)行比較(表2)，7株菌中有4株菌產(chǎn)氣充滿杜氏小管，分別為：NXU5、NXU7、NXU11-2、NXU12-2，說明這4株酵母菌起酵能力強(qiáng)。

表2 篩選菌株的杜氏小管產(chǎn)氣情況
Table 2 Screening strains of gas production in Dulbecco’s tubules

注：“+”：產(chǎn)氣量為杜氏小管體積的1/4；“++”：產(chǎn)氣量為杜氏小管體積的1/2；“+++”：產(chǎn)氣量為杜氏小管體積的3/4，“++++”：產(chǎn)氣量為杜氏小管滿體積

2.1.3.2 耐受性比較

將通過發(fā)酵能力篩選的4株菌進(jìn)行乙醇耐受性試驗(yàn)，結(jié)果如圖2-a所示。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%～15%時(shí)，隨著酒精濃度的升高，菌濃度整體呈現(xiàn)下降的趨勢；酒精體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，菌株NXU11-2、NXU12-2菌濃度要明顯高于其他菌株。如圖2-b所示，在SO2質(zhì)量濃度為60～300 mg/L時(shí)，隨著SO2濃度的升高，菌濃度整體呈現(xiàn)下降的趨勢；在SO2質(zhì)量濃度到達(dá)300 mg/L時(shí)，所有菌株仍可以生長。結(jié)合耐乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇菌株NXU11-2、NXU12-2進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

a-耐乙醇實(shí)驗(yàn); b-耐SO2實(shí)驗(yàn)
圖2 乙醇耐受性和SO2耐受性實(shí)驗(yàn)
Fig.2 Tolerance to alcohol and SO2

2.1.3.3 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

(1)理化指標(biāo)與EC含量。對復(fù)篩所得到的NXU11-2與NXU12-2菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，通過葡萄酒中EC含量的測定得出，菌株NXU12-2的含量最低為18.96 μg/L，僅為商業(yè)酵母XR含量的53.13%。葡萄酒的揮發(fā)酸均在國標(biāo)范圍之內(nèi)；總糖方面XR的含量最低，NXU12-2含量相對較高；總酸方面，NXU12-2含量最高；酒精度NXU12-2處于最低水平。近年來隨著全球氣候變暖，成熟釀酒葡萄含糖量升高，導(dǎo)致葡萄酒中乙醇含量升高[18]，酒精度較低有利于生產(chǎn)低酒精度的葡萄酒，以迎合當(dāng)前的消費(fèi)者[19]。色澤是評價(jià)紅葡萄酒品質(zhì)的重要依據(jù)[20]，不同菌株發(fā)酵葡萄酒的色度和色調(diào)值如圖3所示，NXU12-2與XR的色度值相差最小，NXU12-2與XR的色調(diào)值無顯著差異。

表3 葡萄酒理化指標(biāo)
Table 3 Physicochemical indexes of wine samples

注：同一列字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖3 葡萄酒色度與色調(diào)分析
Fig.3 The chromaticity and tonal analysis of wine samples

(2)葡萄酒香氣成分分析。葡萄酒的香氣很大程度上決定了葡萄酒的質(zhì)量。通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定了葡萄酒中香氣成分含量，結(jié)果見增強(qiáng)出版附件。實(shí)驗(yàn)共檢測到44種香氣物質(zhì)，包括12種酯類、12種醇類、5種脂肪酸類、2種萜烯類、1種降異戊二烯衍生物、4種醛類、1種硫醇、1種內(nèi)酯、2種酮類、2種烷烴類以及2種其他類。

酯類物質(zhì)是葡萄酒香氣的重要組成部分，各菌株發(fā)酵酒中酯類物質(zhì)的含量為2 212.47～3 615.05 μg/L，NXU12-2酒樣低于XR與NXU11-2。其中，共有3種酯類物質(zhì)的OAV>1，分別為乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯。酒樣NXU12-2與XR相比，己酸乙酯和辛酸乙酯含量較低，乙酸異戊酯含量無顯著區(qū)別。酒樣NXU11-2與XR相比，3種物質(zhì)含量均無顯著區(qū)別。

高級醇是酵母代謝產(chǎn)生的次級產(chǎn)物，當(dāng)葡萄酒中的高級醇含量低于300 mg/L 時(shí)，對葡萄酒香氣具有積極貢獻(xiàn)，可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性[21]。酸類物質(zhì)能夠提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性，是葡萄酒中重要的一類香氣物質(zhì)[22]。各菌株發(fā)酵酒中，高級醇和脂肪酸的含量NXU12-2均為最高，總含量分別為18 548.20～35 446.90和187.22～345.13 μg/L。酒樣中的醇類物質(zhì)異戊醇、苯乙醇、異丁醇和1-壬醇含量較高；酸類物質(zhì)異丁酸、辛酸等含量較高，酒樣NXU12-2與XR相比，異戊醇含量無顯著區(qū)別，1-壬醇含量較低，增加了苯乙醇(OAV>1)、異丁醇和異丁酸、辛酸、9-癸烯酸，增加了葡萄酒中的花香味、甜味和奶酪味，減少了生青味。

除此之外，芳樟醇、大馬士酮、壬醛、異佛爾酮和2,4-二叔丁基苯酚的OAV也超過了1。芳樟醇為酒體帶來花香，XR的含量最高；大馬士酮為酒體帶來花香、甜味、蜂蜜味， NXU12-2含量最高，對酒體香氣的復(fù)雜性有一定的貢獻(xiàn)。

(3)葡萄酒香氣成分的主成分分析。為了直觀地展示各實(shí)驗(yàn)組之間的差異，對于OAV>0.1的21種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。由圖4可知，前2個(gè)主成分的總貢獻(xiàn)率為79.2%，其中主成分1的方差貢獻(xiàn)率46.9%，主成分2的方差貢獻(xiàn)率為32.3%。其中，NXU12-2位于第一象限，與大馬士酮、苯乙醇、辛酸、甲硫醇的相關(guān)性較強(qiáng)，賦予酒體復(fù)雜濃郁的花香、甜味和奶酪味；對照組XR位于第二象限，與芳樟醇、異佛爾酮、1-壬醇、丁酸乙酯、9-癸烯酸聯(lián)系緊密，為酒體帶來花香、脂肪味和生青味；NXU11-2位于第三象限，與乙醛和乙酸乙酯有較大關(guān)聯(lián)，為酒體帶來果香、醇味和甜味等。通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)NXU11-2、NXU12-2和XR的香氣特征都較好，可用于高質(zhì)量葡萄酒的釀造。

圖4 葡萄酒香氣物質(zhì)(OAV>0.1)的主成分分析圖
Fig.4 Principal component analysis plot of aroma substances in wine (OAV>0.1)

(4)電子鼻雷達(dá)圖分析。圖5為葡萄酒電子鼻雷達(dá)圖分析結(jié)果，從中可以看出 W1C、W5S、W1S、W1W、W2S、W2 W 六個(gè)傳感器對酒樣的響應(yīng)較高，其余4個(gè)傳感器響應(yīng)較低。XR在 W5S、W1S兩個(gè)傳感器響應(yīng)最高，說明其中氮氧化合物、甲烷等短鏈烷烴類芳香化合物含量較高；NXU12-2在W2S傳感器響應(yīng)最高，說明其中醇醚醛酮類芳香化合物含量較高，各酒樣間差異不明顯。

綜合初篩、復(fù)篩和發(fā)酵能力的比較，最終選擇菌株NXU12-2作為發(fā)酵性能良好的目的菌株。

2.2 降解EC酵母菌的鑒定

將該菌株18S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，此菌株18S rDNA序列與釀酒酵母18S rDNA的相似度為99%。根據(jù)菌株的18S rDNA序列，利用 Mega 5.0 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用 Neighbor-Joining 法對菌株進(jìn)行分析。由圖6可知，它與釀酒酵母在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育支上，因此可確定該菌株為釀酒酵母，并命名為NXU12-2。

圖5 葡萄酒電子鼻雷達(dá)圖
Fig.5 Electronic nose radar chart of wine

圖6 NXU12-2 18 s rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析
Fig.6 Phylogenetic tree of 18S rDNA gene of NXU12-2

3 結(jié)論

本研究從釀酒葡萄、干化葡萄和白酒酒醅中篩選得到可降解氨基甲酸乙酯的酵母菌18株，選擇7株降解能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行發(fā)酵性能實(shí)驗(yàn)和耐受性實(shí)驗(yàn)，得到2株酵母菌NXU11-2與NXU12-2。對這2株菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，使用NXU12-2釀造的葡萄酒EC含量最低，葡萄酒的酒精度、總酸等指標(biāo)較優(yōu)，香氣特征較好，經(jīng)鑒定為釀酒酵母。研究表明，使用釀酒酵母NXU12-2釀造的葡萄酒品質(zhì)較優(yōu)，同時(shí)降低了酒中EC的含量，對葡萄酒中EC的控制具有重要意義。