腈水合酶底物通道入口調(diào)控催化活性的關(guān)鍵氨基酸位點的定位與改造

酰胺類產(chǎn)品具有較高的工業(yè)價值，其中，最有代表性的產(chǎn)品是丙烯酰胺，其單體和聚合物廣泛應(yīng)用于石油、水處理、造紙、紡織等行業(yè)。酰胺類產(chǎn)品的傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)方法為化學(xué)合成，但反應(yīng)條件苛刻、轉(zhuǎn)化率低以及副產(chǎn)物產(chǎn)率高。隨著腈水合酶的發(fā)現(xiàn)和研究，條件溫和、選擇性強的生物催化法[1]正逐步替代化學(xué)合成法，已成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺、煙酰胺和5-氰基戊酰胺等酰胺類產(chǎn)品[2-4]。

腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，EC 4.2.1.84)是一種金屬酶，可以將腈類底物水合，從而轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺類產(chǎn)物。玫瑰色紅球菌J1(節(jié)桿菌屬)來源的該酶是人們首次發(fā)現(xiàn)并報道的腈水合酶[5]。目前生產(chǎn)腈水合酶的微生物有紅球菌屬(Rhodococccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和短桿菌屬(Brevibacterium)等[6-8]，且其異源表達已在大腸桿菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等模式菌株中實現(xiàn)[9-11]。自1985年起，第1代菌株N-774就已經(jīng)被用于丙烯腈到丙烯酰胺的生物轉(zhuǎn)化[12]，這也是生物技術(shù)制造商業(yè)化學(xué)品的第1個成功案例[13]。目前，三菱公司已經(jīng)可以達到超過20萬t的丙烯酰胺年產(chǎn)量[14]。

腈水合酶雖然已被用于工業(yè)生產(chǎn)，但由于腈的水合是放熱反應(yīng)，且大多數(shù)的腈水合酶在超過50 ℃時會迅速失活[15]，兩者之間的矛盾一定程度上限制了腈水合酶更廣泛的應(yīng)用。因此，獲取兼具較高酶活力和良好熱穩(wěn)定性的腈水合酶具有重要意義。

此前，本實驗室通過基因挖掘，異源表達了溫泉熱堿芽孢桿菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1)來源的新型耐熱腈水合酶，該酶在65 ℃的半衰期為3 h，具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性[16]，但野生型的催化酶活力較低。近年來，隨著生物信息學(xué)工具的快速發(fā)展，越來越多的研究者運用分子動力學(xué)模擬進行理性設(shè)計改造天然酶[17]，確定適合突變的最佳氨基酸殘基，提高酶活力以適應(yīng)工業(yè)需要。PAVLOVA等[18]應(yīng)用隨機加速分子動力學(xué)來模擬產(chǎn)物從酶活性位點的釋放過程，并確定突變的關(guān)鍵殘基，得到了酶活力提高32倍的突變體。

本研究以提升酶的催化活性為目標(biāo)，采用分子動力學(xué)模擬的方法，定位對酶結(jié)構(gòu)自由度有重要影響的氨基酸殘基，通過定點突變以期打破氫鍵，提高底物通道入口的構(gòu)象自由度。并對得到的有效突變體進行進一步的酶學(xué)性質(zhì)和分子動力學(xué)模擬分析，探究突變體的工業(yè)生產(chǎn)適用性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

克隆宿主大腸桿菌DH5α、異源表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保藏。質(zhì)粒pET-24a(+)-Cal.t NHase攜帶溫泉熱堿芽孢桿菌來源的腈水合酶，為本實驗室前期構(gòu)建并保藏。

酵母提取物、胰蛋白胨，OXOID公司；感受態(tài)細胞制備試劑盒、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、Primer STAR Max DNA聚合酶、Dpn I限制性內(nèi)切酶、Bradford蛋白定量檢測試劑盒，TaKaRa公司(北京)；丙烯腈，國藥集團(中國上海)；丙烯酰胺和脫硫生物素，Sigma公司；引物由蘇州金唯智合成，本文所用引物和序列見表1。

表1 本文所用引物及其序列
Table 1 Primers used in this study

注：引物序列中，下劃線字母代表突變位點

100 mmol/L KPB緩沖液：K2HPO4 13.95 g、KH2PO4 10.92 g，用KH2PO4調(diào)節(jié)pH為7.4，定容至1 L。蛋白純化用binding buffer：K2HPO4 2.84 g、NaCl 16.36 g、KCl 0.37 g，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4后定容到1 L。washing buffer：在上述binding buffer中加入2.5 mmol/L脫硫生物素。

1.2 實驗方法

1.2.1 計算機理性設(shè)計方法

分子動力學(xué)模擬使用NAMD軟件。Cal.t NHase結(jié)構(gòu)的PDB文件參考本實驗室先前的同源建模結(jié)果[19]。模擬過程采用VPT系統(tǒng)，選擇1 000步共軛梯度法使能量最小化后，再進行100 ns的全約束并放開平衡，步長為2 ps，計算出β亞基上各個氨基酸的漲落狀況。對得到的軌跡文件使用VMD軟件進行可視化分析，比較在不同溫度下(300和360 K)Cal.t NHase的β亞基的均方根波動值(root mean square fluctuation，RMSF)。底物通道計算利用CAVER analyst 2.0軟件，底物通道探針半徑設(shè)置為0.9 ?，底物通道入口計算利用CAVER內(nèi)嵌的Residue Graph和Contour模塊。氫鍵的計算由NAMD軟件中的hydrogen bond模塊完成。蛋白結(jié)構(gòu)繪圖軟件為PyMOL。RMSF曲線由Origin 2018繪制獲得。

1.2.2 突變體構(gòu)建及表達

以質(zhì)粒pET-24a(+)-Cal.t NHase為模板，進行全質(zhì)粒PCR(引物見表1)，用Dpn I限制性內(nèi)切酶消化以去除模板質(zhì)粒，之后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，運用Sanger測序法確認突變位點核苷酸序列。

將構(gòu)建好的突變體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上涂布，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種到5 mL含有50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基的試管中，搖床條件設(shè)定為37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)8～10 h。試管種子液轉(zhuǎn)接到含有50 mg/L卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，種子液接種量為1%，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)至菌體濃度OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，并將溫度設(shè)置為30 ℃，培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 酶的分離純化及濃度檢測

誘導(dǎo)表達后的菌液用超高速離心機以10 000 r/min離心5 min，收集菌體，用binding buffer重懸菌體，按比例濃縮5倍，混勻后放置于冰盒中進行超聲波破碎。隨后，4 ℃，12 000 r/min 超高速離心30 min，取上清液棄沉淀，后用0.22 μm濾膜過濾，獲得粗酶液，使用AKTA蛋白純化儀通過strep親和層析進行后續(xù)純化。首先，先后用5倍體積的去離子水和binding buffer緩沖液以1 mL/min流速清洗并平衡柱子；參數(shù)穩(wěn)定后上樣，樣品全部進入管道后換用binding buffer沖洗管道，直至紫外吸收值降低為0，再換用washing buffer洗脫，收集紫外吸收值>200 mAU的蛋白。用SDS-PAGE方法分析鑒定純化后的蛋白表達情況，用Bradford法測定蛋白濃度，并將蛋白統(tǒng)一稀釋到0.05 mg/mL以便后續(xù)測定酶活力。

1.2.4 酶活力檢測

取10 μL純化后的0.05 mg/mL的蛋白先于25 ℃金屬浴下保溫5 min，加入490 μL 200 mmol/L的丙烯腈底物，25 ℃下反應(yīng)10 min，最后加入500 μL乙腈終止反應(yīng)，反應(yīng)終體積為1 mL。反應(yīng)后樣品經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后，用高效液相色譜測定產(chǎn)物生成量，檢測器為紫外檢測(檢測波長為210 nm)，色譜柱為C18柱(柱溫為40 ℃)，流動相為乙腈和水混合溶液(乙腈與水的體積比為1∶2)，流速為0.6 mL/min，進樣量為10 μL，進樣時間為10 min。定義酶活力單位(U)：25 ℃下每分鐘催化丙烯腈生成1 μmol丙烯酰胺所需的酶量；定義比酶活(U/mg)：1 mg純酶具有的酶活力單位數(shù)。

1.2.5 熱穩(wěn)定性研究

設(shè)置金屬浴溫度為65 ℃，分別保溫0、2、3、5 h后取樣，測定剩余酶活力，以處理0 h的樣品(未經(jīng)熱處理的酶)為對照，定義其酶活力為100%，依次計算其余樣品相對酶活力，分析65 ℃下的純酶熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的選擇

近年的研究發(fā)現(xiàn)，腈水合酶的底物通道主要由β亞基中的氨基酸殘基構(gòu)成，且底物通道對于該酶的催化性能具有決定性作用[20]。此外，研究理論指出，酶分子中的柔性loop區(qū)域可能對于酶的催化活性具有一定的影響[21]。根據(jù)上述報道，對位于腈水合酶底物通道入口處的loop結(jié)構(gòu)進行研究(圖1-a)。

a-底物通道結(jié)構(gòu)及通道入口附近關(guān)鍵區(qū)域 (紅色標(biāo)出為R1區(qū)域，橙色標(biāo)出為R2區(qū)域)； b-底物通道入口關(guān)鍵氨基酸βAsn47和βAsn181之間的氫鍵
圖1 Cal.t NHase結(jié)構(gòu)及底物通道模擬分析
Fig.1 Structure modelling and key residues adjacent to substrate access tunnel of Cal.t NHase

RMSF是指一段時間內(nèi)，原子相對于參考構(gòu)象的結(jié)構(gòu)變化，反映了原子的自由度[22]。當(dāng)原子位于蛋白質(zhì)上時，RMSF值可以反映蛋白質(zhì)中各個氨基酸的柔性強度：RMSF值越大，柔性越大[23-24]。通過100 ns分子動力學(xué)模擬，對野生型Cal.t NHase上β亞基中各個氨基酸在溫度300和360 K下的RMSF值進行計算。圖2顯示，其中，β亞基上的區(qū)域R1(βGly42-βLeu48)、R2(βAsn181-βSer188) 在360 K時較300 K時發(fā)生明顯的柔性波動，為β亞基上的柔性區(qū)域。根據(jù)圖1，Cal.t NHase底物通道入口loop區(qū)域由β亞基上的Gly42-Leu48七個氨基酸殘基構(gòu)成，與區(qū)域R1位置吻合。

圖2 野生型β亞基在300和360 K下的RMSF
Fig.2 RMSF of wild type β subunit at 300 and 360 K

著重尋找柔性區(qū)域R1和R2上的特殊作用力，發(fā)現(xiàn)位于β亞基47位的天冬酰胺殘基和181位的天冬酰胺殘基在分子動力學(xué)模擬過程中會形成氫鍵(圖1-b)，且持續(xù)時間較長，推測這對氫鍵限制了區(qū)域R1的柔性。因此，本文擬將通過定點突變打斷氫鍵，增加區(qū)域R1自由度，提高底物通道入口的構(gòu)象可變性，從而提高腈水合酶酶活力。

2.2 Cal.t NHase的代表性氨基酸突變

為減小突變體庫構(gòu)建工作量，同時盡量提高小型突變體庫中各氨基酸類型的全面性，選擇7種具有代表性的氨基酸殘基(極性、非極性、帶電、不帶電)進行突變，將β47位和β181位上的天冬酰胺分別突變?yōu)橐韵掳被?A、E、F、H、K、L、Q)，構(gòu)建共14個突變體。在OD600=0.5菌體濃度下，測定的各突變體相對酶活力如圖3所示。

圖3 Cal.t NHase突變體相對酶活力
Fig.3 Relative activity of Cal.t NHase mutants

選取其中突變?yōu)楸彼岬?個突變體(βN47A、βN181A)和粗酶活力顯著提高的4個突變體(βN47F、βN47L、βN181F、βN181K)進一步純化(純化后SDS-PAGE如圖4所示)。

圖4 Cal.t NHase SDS-PAGE圖
Fig.4 SDS-PAGE of Cal.t NHase

測定的純酶酶活力如圖5所示。其中，得到的最優(yōu)突變體為βN47F，比酶活力為592.92 U/mg，相對野生型的比酶活力為165.30 U/mg，提高了2.57倍。

圖5 Cal.t NHase突變體比酶活力
Fig.5 Specific activity of Cal.t NHase mutants

2.3 βN47F突變體的熱穩(wěn)定性

Cal.t NHase野生型及βN47F突變體的熱穩(wěn)定性如圖6所示，野生型65 ℃下的半衰期為3 h，突變體βN47F 65 ℃處理3 h后仍殘余56%酶活力。而嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila JCM 3095)來源的腈水合酶(Pt NHase)65 ℃處理僅30 min，即殘余酶活力不到10%[16]。突變體與野生型相比熱穩(wěn)定性有一定的提高，尤其與其他來源的腈水合酶相比，具有較明顯的優(yōu)勢，證明βN47F在提高酶活力的同時保持了良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 Cal.t NHase βN47F熱穩(wěn)定性
Fig.6 Thermal stability of Cal.t NHase βN47F

2.4 突變體催化性能提高機制解析

通過蛋白質(zhì)理性設(shè)計，獲取了酶活力大幅提高的優(yōu)勢突變體βN47F。為了解析該突變體催化性能提高的機制，該研究首先通過trRosetta在線建模工具[25]，以來源于Bacillus sp.RAPc8 (PDB ID:2DPP) 和Bacillus smithii SC-J05-1 (PDB ID:1V29) 的腈水合酶晶體結(jié)構(gòu)為模板，構(gòu)建了βN47F的三維模擬結(jié)構(gòu)。由于β亞基上47位的天冬酰胺已突變?yōu)榉菢O性殘基苯丙氨酸，相應(yīng)位點的殘基側(cè)鏈無法與β亞基上181位的天冬酰胺形成氫鍵，推測該突變破壞了原有的氫鍵相互作用，從而解除了Cal.t NHase底物通道入口loop區(qū)域的運動限制。在此基礎(chǔ)上，通過對優(yōu)勢突變體βN47F進行100 ns的分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)(圖7)，突變體底物通道入口loop區(qū)域的RMSF值較野生型Cal.t NHase有明顯提高，即底物通道入口區(qū)域的柔性得到了提高。

圖7 300 K下野生型和突變體βN47F的RMSF值
Fig.7 RMSF values of wild-type and mutant βN47F at 300 K

利用PyMOL軟件對所構(gòu)建優(yōu)勢突變體βN47F進行分析(圖8)，發(fā)現(xiàn)突變體47位苯丙氨酸的側(cè)鏈并未與其他任何氨基酸發(fā)生氫鍵等相互作用，表明野生型β亞基47位天冬酰胺側(cè)鏈與181位天冬酰胺側(cè)鏈的氫鍵已被成功打破。

a-突變體βN47F的模擬結(jié)構(gòu)； b-βPhe47與周圍氨基酸殘基的相互作用
圖8 突變體βN47F模型圖
Fig.8 Model diagram of mutant βN47F

利用CAVER軟件對野生型Cal.t NHase及其突變體βN47F進行底物通道入口構(gòu)象的分析(圖9)，發(fā)現(xiàn)突變后突變體βN47F的底物通道入口幾何構(gòu)象較野生型Cal.t NHase更寬大，表明突變后底物通道入口區(qū)域柔性的增強提升了該區(qū)域的構(gòu)象可變性，拓寬了底物通道入口，更利于底物與腈水合酶的結(jié)合過程。

a-野生型底物通道入口構(gòu)象；b-突變體βN47F底物通道入口構(gòu)象
圖9 野生型和突變體βN47F底物通道入口構(gòu)象
Fig.9 Conformation of the substrate channel entrance of wild-type and mutant βN47F

3 結(jié)論

本文采用分子動力學(xué)模擬的方法，選取了位于腈水合酶底物通道入口附近的2個位點βN47、βN181進行突變，得到了酶活力顯著提高的突變體βN47F。突變體比酶活力提高到592.92 U/mg，與野生型相比，提高了2.57倍。在提高酶活力的同時，突變體在65 ℃下的半衰期為3 h，保持了Cal.t NHase熱穩(wěn)定性良好的優(yōu)勢。對βN47F突變體催化性能提高機制進行解析，其三維結(jié)構(gòu)顯示β亞基47位上的天冬酰胺和β亞基181位的天冬酰胺之間形成的氫鍵相互作用力遭到破壞；分子動力學(xué)模擬和Caver軟件分析顯示突變體底物通道入口的柔性和構(gòu)象可變性都得到了提高。兼具較高酶活和良好熱穩(wěn)定性的突變體的成功構(gòu)建，增強了研究者對于理性設(shè)計方法改造蛋白提高酶活力的信心，進一步推動后續(xù)Cal.t NHase的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。