甘草次酸衍生物TY501對小鼠免疫系統(tǒng)的影響-醫(yī)學(xué)論文

通過小鼠灌胃給藥，研究TY501對小鼠體重和中樞免疫器官胸腺、脾臟的影響，采用ADVIA2120血液分析儀測定小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量及比例，采用BDFACSAriaTMⅡ流式細胞儀測定藥物對小鼠外周血中淋巴細胞亞型的影響，探究并比較TY501與潑尼松龍對免疫系統(tǒng)影響的差異。

　　1儀器與試藥

　　1.1試驗藥物

　　TY501：白色粉末，含量為97.8%，批號為20100512，天津藥物研究院化學(xué)制藥研究部提供。試驗前用精制玉米油配制成適當(dāng)濃度，供動物灌胃給藥。
　　潑尼松龍：白色結(jié)晶粉末，含量98.2%，批號為PL100107，天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成適當(dāng)濃度，供動物灌胃給藥。

　　1.2動物

　　ICR小鼠，雌雄各半，實驗開始時小鼠體重均為18～22g。北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2006-0009。飼料為鼠專用全價營養(yǎng)塊料（天津市華榮實驗動物科技有限公司生產(chǎn)）。動物均飼養(yǎng)在有中央空調(diào)的觀察室，飲用動物飲用水。

　　1.3主要試劑及儀器

　　精制玉米油（華北制藥康欣有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5L/桶，批號：081203），羧甲基纖維素鈉300～800M[國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，規(guī)格化學(xué)純（CP）500g，批號：20081015]，染色檢測試劑（PerCPHamsterAnti-MouseCD3e；FITCRatAnti-MouseCD4；PERatAnti-MouseCD8a；PerCPHamsterIgG1，kIsotype；FITCRatIgG2，kIsotypeControl；PERatIgG2a，kIsotypeControl；PEMouseAnti-MouseNK1.1；FITCRatAnti-MouseCD19；PEMouseIgG2a，kIsotypeControl。所有染色試劑均為BDPharmingen公司提供流式專用試劑），流式細胞儀專用鞘液（BDFACSFlow鞘液，規(guī)格：20L，批號：1015300043）。

　　電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司，PL203]，電子天平[（美國雙杰兄弟（集團）有限公司常熟雙杰測試儀器廠，T2000）]，血液分析儀（SiemensHealthcareDiagnosticsInc，ADVIA2120），流式細胞儀（bdbiosciences.com，BDFACSAriaTMⅡ）

　　2方法與結(jié)果

　　2.1實驗方法

　　實驗設(shè)5組，每組10只動物，雌雄各半。分別為正常對照組、潑尼松龍組（15.0mg/kg）、TY501低劑量組（6.7mg/kg）、T501中劑量組（20.0mg/kg）、TY501高劑量組（60.0mg/kg）。正常對照組給予動物飲用水；潑尼松龍組灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的濃度為0.75mg/ml的混懸液；TY501低、中、高劑量組分別灌胃給予精制玉米油配制的濃度為0.33、1.00、3.00mg/mL的混懸液。各組分別連續(xù)灌服相應(yīng)的藥物23d，給藥體積均為20mL/kg。于給藥后第0、7、14、21天分別稱量動物體重；末次給藥24h后，用毛細管從眼眶靜脈叢采血，0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用ADVIA2120血液分析儀測定小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)量及比例，采用流式細胞儀測定外周血中淋巴細胞亞型CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NK1.1的比例；通過白細胞分類中淋巴細胞數(shù)量和淋巴細胞亞型的比例計算外周血中各淋巴細胞亞型的數(shù)量；稱量動物體重，剖殺并稱取脾臟、胸腺，計算臟器指數(shù)。

　　2.2統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

　2.3結(jié)果

　　2.3.1對小鼠體重、胸腺、脾臟的影響結(jié)果顯示，與正常對照組比較，給藥第7天至實驗結(jié)束時，潑尼松龍組動物體重明顯降低（P＜0.01或P＜0.001）；TY501各劑量對動物體重未見明顯的變化。與正常對照組比較，潑尼松龍組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)明顯降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對小鼠中樞免疫器官具有明顯的抑制作用；TY501各劑量組小鼠脾臟、胸腺濕重及相應(yīng)系數(shù)未見明顯的變化，提示TY501各劑量組未對小鼠中樞免疫器官起到明顯的抑制作用。見表1、2。

　　2.3.2對小鼠外周血白細胞數(shù)及淋巴細胞、嗜中性粒細胞數(shù)的影響與正常對照組比較，潑尼松龍組白細胞總數(shù)未見明顯變化，淋巴細胞數(shù)明顯降低（P＜0.01），僅比正常對照組的50%略高，這與表2得到的脾臟、胸腺重量及系數(shù)降低相一致；嗜中性粒細胞數(shù)明顯升高（P＜0.001），可能原因為動物由于免疫力下降存在隱性感染所致。TY501低、中劑量組對小鼠白細胞總數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜中性粒細胞數(shù)均未見明顯變化，未出現(xiàn)與潑尼松龍組相類似的使小鼠淋巴細胞數(shù)顯著下降的影響；TY501高劑量組白細胞數(shù)及嗜中性粒細胞數(shù)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），可能是TY501毒性反應(yīng)的結(jié)果。結(jié)果見表3。

　　2.3.3對小鼠外周血淋巴細胞亞型的影響與正常對照組比較，潑尼松龍組給藥后CD3+Ｔ總淋巴細胞和CD3+CD8+Ｔ淋巴細胞比例明顯升高（P＜0.01或P＜0.001），CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.001），但結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算Ｔ淋巴細胞及其各亞型的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，外周血中Ｔ總淋巴細胞絕對數(shù)量不僅沒有升高，反而降低，各亞型Ｔ淋巴細胞中又以CD3+CD4+數(shù)量減少為主，CD3+CD8+數(shù)量沒有明顯變化，CD3-CD19+淋巴細胞比例與數(shù)量均顯著降低（P＜0.001）（表5），說明潑尼松龍對小鼠細胞免疫和體液免疫均有明顯的抑制作用。與正常對照組比較，TY501中、高劑量組給藥后CD3-CD19+亞型淋巴細胞比例顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算發(fā)現(xiàn)各組B淋巴細胞、NK細胞數(shù)量增多，說明TY501有增強體液免疫和非特異性免疫功能的趨勢；由于CD3-CD19+亞型淋巴細胞比例顯著升高致使CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+Ｔ淋巴細胞比例均有所降低（P＜0.05或P＜0.01），CD4+/CD8+比值基本未有變化，結(jié)合給藥后淋巴細胞絕對數(shù)量計算Ｔ淋巴細胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，TY501各劑量組給藥后Ｔ淋巴細胞數(shù)均沒有降低，反而有所升高，但僅TY501低劑量組和TY501高劑量組的NK1.1值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表4、5。

　　3討論

　　本研究結(jié)果表明，潑尼松龍持續(xù)灌胃給藥21d，對動物中樞免疫器官的發(fā)育生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用，胸腺、脾萎縮，重量及指數(shù)顯著降低，外周血中淋巴細胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比例顯著降低（P＜0.001）；CD3+CD8+亞型T細胞按其生物學(xué)功能又可分為抑制性細胞Ts或細胞毒性T細胞（CTL），其中Ts細胞可通過自身及分泌抑制因子在免疫反應(yīng)中起負向調(diào)節(jié)作用，抑制B細胞和CD3+CD4+細胞的功能，從而抑制抗體形成及細胞免疫反應(yīng)[7]。結(jié)合血液學(xué)測定儀和流式細胞儀測得的各亞型淋巴細胞的比例及計算各亞型淋巴細胞的數(shù)量結(jié)果顯示，CD3+CD4+亞型淋巴細胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05），B淋巴細胞數(shù)量顯著降低（P＜0.001），說明潑尼松龍對動物機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，尤其對體液免疫功能抑制作用更為顯著，這與有關(guān)文獻的報道相一致[8]。糖皮質(zhì)激素是強效的抗炎藥物，臨床上廣泛應(yīng)用，但由于其免疫抑制作用限制了它的臨床應(yīng)用。開發(fā)新型糖皮質(zhì)激素類藥物，在保留其抗炎活性的同時減少副作用尤為迫切，是近幾年來國內(nèi)外藥物學(xué)家一直致力于研究的熱點領(lǐng)域[9]。

　　TY501持續(xù)灌胃給藥21d，對小鼠中樞免疫器官、外周血中淋巴細胞數(shù)量及比例、淋巴細胞亞型等均未產(chǎn)生抑制作用。甘草酸和甘草次酸是甘草中含量最高的苷類化合物，也是甘草的主要甜味成分[10]。TY501為甘草次酸衍生物，具有甾體類似結(jié)構(gòu)，動物實驗表明劑量為6.0mg/kg時TY501對冰醋酸致炎性滲出、角叉菜膠性足腫等小鼠急性炎癥具有最佳抗炎作用；在0.33mg/kg時多次給藥對慢性炎癥模型大鼠棉球肉芽腫即有顯著的抑制作用，其抗炎作用與潑尼松龍相當(dāng)（本課題組藥效學(xué)實驗尚未發(fā)表資料）。與甾體類藥物（潑尼松龍）相比，TY501在保留了相當(dāng)強的抗炎活性的同時，對小鼠免疫系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，使其有望進一步被開發(fā)成為有鮮明特色的抗炎藥物。