光催化-生物雜合系統(tǒng)設(shè)計優(yōu)化用于燃料和化學(xué)品綠色合成

近百年來，隨著工業(yè)進程的高速發(fā)展，不可再生的化石能源濫用嚴重，導(dǎo)致CO2等溫室氣體過度排放，同時引發(fā)了嚴重的能源危機和各種環(huán)境問題。為實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，2015年《巴黎協(xié)定》首次提出全球“碳中和”概念，截至目前已有超過120個國家和地區(qū)提出了自己的碳中和達成目標。其中，將CO2轉(zhuǎn)化為碳基化學(xué)品及能源物質(zhì)，以及使用清潔高效能源替代化石能源成為重中之重[1-3]。

由于自身穩(wěn)定的熱力學(xué)與動力學(xué)性能，CO2的活化并不容易[4]，目前工業(yè)常用的幾種將CO2轉(zhuǎn)化為其他碳化合物的方法，如電催化[5-9]、化學(xué)重整[10]等，反應(yīng)條件一般比較苛刻，而且依靠電能的還原反應(yīng)會導(dǎo)致額外的能量輸入，如今的電能提供依舊比較依賴于火力發(fā)電，無法完全擺脫化石燃料的污染。氫氣作為高效清潔的新型能源物質(zhì)，近年來逐漸受到青睞。然而，目前制取氫氣的三種主流方法：電解水制氫、工業(yè)副產(chǎn)氫和化石燃料制氫，過程同樣需要大量的能源消耗并造成溫室氣體排放，尚不能滿足綠色化學(xué)以及“碳中和”理念的要求。作為農(nóng)業(yè)氮素來源的合成氨技術(shù)，存在同樣問題。以Haber-Bosch法為代表的人工固氮途徑在鐵催化劑、高溫（500~600℃）、高壓（20~50 MPa）下才可實現(xiàn)N2的轉(zhuǎn)化，此后改進的一系列方法，如Marnellos等[11]發(fā)明的常壓合成氨手段，也需將電解池溫度加熱到570℃，據(jù)統(tǒng)計，平均每生產(chǎn)1 t氨，排放約2 t二氧化碳氣體[12]。因此，如何利用安全清潔、可持續(xù)再生的新能源實現(xiàn)重要化學(xué)品的合成成為了人們亟待解決的問題。

地球上的能量核心——太陽能，由于具有儲量豐富、可再生、分布廣泛、安全、清潔等獨特優(yōu)勢，被國際公認為未來最具競爭性的能源之一。1976年研究人員首次發(fā)現(xiàn)了能直接利用光能，在溫和條件下催化化學(xué)反應(yīng)的半導(dǎo)體材料，并由此開辟出光催化領(lǐng)域，實現(xiàn)利用太陽能安全清潔、綠色可持續(xù)地合成化學(xué)品。近年來，隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，光催化材料在光能轉(zhuǎn)換效率方面得到大幅度提升，已遠遠超過自然界的光合作用[13-14]。然而由于光催化材料本身的催化特性，傳統(tǒng)無機/有機光催化仍然存在著反應(yīng)特異性較差、產(chǎn)物譜較單一、產(chǎn)物多為低碳簡單化合物等問題，不能滿足現(xiàn)階段對靶向高效生產(chǎn)長鏈高值化合物的需求[15-18]。隨著自然界的進化，生物體進化出高效的生物酶分子。通過特定的二級及三級結(jié)構(gòu)，酶分子可降低催化能壘，調(diào)節(jié)催化方向，完成溫和、高效、高產(chǎn)物特異性的催化過程。與此同時，成千上萬的酶分子，通過生物體的精密調(diào)控，組成一條條精巧的代謝途徑，可精準高效地合成各種長鏈高值化合物[19-21]，這是化學(xué)催化所不可比擬的。

基于此，將光催化和生物催化耦合的光催化-生物雜合系統(tǒng)，近年來逐漸成為研究熱點。該系統(tǒng)利用光催化高效的光能轉(zhuǎn)化性能，將光能轉(zhuǎn)化為高能還原物質(zhì)/電子，為生物催化提供能量和還原力，最終實現(xiàn)綠色、高效的化學(xué)品合成。根據(jù)生物催化載體的不同，光催化-生物雜合系統(tǒng)可分為光催化-生物酶雜合系統(tǒng)和光催化-微生物雜合系統(tǒng)兩大類，本文以電子傳遞機制作為劃分依據(jù)，分別對這兩類系統(tǒng)的作用方式進行分類（圖1），詳細評述各體系中光生電子的傳導(dǎo)方式，以及存在的優(yōu)缺點和關(guān)鍵問題，最后對該領(lǐng)域提出了展望。

光催化-生物酶雜合系統(tǒng)是將光催化和單酶/多酶催化系統(tǒng)耦合，利用太陽能為酶催化提供能量和還原力的系統(tǒng)。和光催化-微生物雜合系統(tǒng)相比，此系統(tǒng)理論上可將轉(zhuǎn)化后的能量和還原力完全用于目標產(chǎn)品的合成，避免了維持微生物生存所需的能量損耗，光能轉(zhuǎn)化效率更高。但由于缺乏微生物精巧的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，酶催化系統(tǒng)在合成復(fù)雜的多碳長鏈化合物方面有所欠缺，更適用于簡單化合物的合成。近年來，光催化-生物酶雜合系統(tǒng)在制氫、合成氨和CO2合成低碳化學(xué)品等領(lǐng)域展現(xiàn)出了矚目的優(yōu)勢[22-27]。

根據(jù)活性位點是否被完全包裹在酶內(nèi)部，光催化向酶分子供給能量和還原力的途徑分為兩種：當活性中心裸露在酶分子外部時，光生電子可以直接被其接收繼而參與氧化還原反應(yīng)；與此相對的，若活性中心完全被酶分子包裹，無法實現(xiàn)直接注入的電子就需依賴輔因子作為介體激活氧化還原作用，這兩種情況中后者更為常見?；诖?，光催化-生物酶雜合系統(tǒng)可以分為輔因子介導(dǎo)的間接體系、直接電子傳遞體系以及耦合二者的混合型體系。

大多數(shù)氧化還原酶的活性位點被掩埋在酶分子內(nèi)部，光催化劑產(chǎn)生的光生電子無法直接抵達被包裹住的活性中心，因此需要利用輔因子[如NAD(P)H]作為穿梭介體為氧化還原過程提供能量和還原力。然而光催化劑直接還原再生輔因子往往會部分生成無生物活性的二聚體[NAD(P)2]和1, 6-NAD(P)H，導(dǎo)致反應(yīng)效率很低。這主要由于光催化劑和NAD+之間的能帶結(jié)構(gòu)一般不相匹配[28]。因此基于輔因子介導(dǎo)的間接反應(yīng)體系普遍加入助催化劑降低反應(yīng)所需活化能，以實現(xiàn)具有生物活性的1, 4-NAD(P)H的高選擇性再生。在各種助催化劑中，最常用的為銠復(fù)合物｛[Cp*Rh(bpy)H2O]2+｝，NAD(P)+的C3原子上的酰胺可與Rh金屬中心實現(xiàn)配位作用從而進行NAD(P)H的高效還原[29]。

Baeg等[30]將靛紅-卟啉(IP)發(fā)色團與石墨烯(CCG)共價連接而成的光催化劑CCG-IP與酶的級聯(lián)反應(yīng)耦合，構(gòu)建出了被譽為“人工葉片”的CO2固定產(chǎn)甲醇的裝置，光生電子經(jīng)銠復(fù)合物的介導(dǎo)可實現(xiàn)NADH的高效再生，而NADH則被用于甲酸脫氫酶、甲醛脫氫酶以及醇脫氫酶構(gòu)成的三酶級聯(lián)反應(yīng)，最終光照30 min，體系可獲得11.21 μmol/L的甲醇[圖2(a)]。但這種光催化劑、銠復(fù)合物、NAD+與酶之間游離的體系會使電子傳遞效率下降，導(dǎo)致體系中的活性氧增多、反應(yīng)產(chǎn)率降低等問題，利用局域效應(yīng)等手段增強有序的電子傳遞成為了改善體系的有效手段。Song等[31]通過將銠復(fù)合物綴合到噻吩修飾的C3N4光催化劑上，構(gòu)建了高度集成的光催化-生物酶雜合系統(tǒng)，光催化劑與銠復(fù)合物的緊密共軛增強光生電子的轉(zhuǎn)移效率，NADH再生速率可達9.33 μmol/(L·min)，比起其他同類的游離體系增強了2.33倍。另外模仿類囊體膜而將甲酸脫氫酶包封入金屬-有機骨架結(jié)構(gòu)（MOFs）中，這種隔室化方法不僅避免了光反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧造成的生物酶失活，而且采用的MAF-7這種MOFs具備的親水性和pH緩沖能力也為生物催化提供了良好的微環(huán)境，從而體系反應(yīng)9 h，甲酸的產(chǎn)量為16.75 mmol/L，是均相反應(yīng)產(chǎn)物的3.24倍[圖2(b)]。Ji等[32]模擬植物葉綠體，構(gòu)建了卟啉/ SiO2 / Cp * Rh（bpy）Cl雜化納米粒子（TCPP / SiO2 / Rh HNPs）。具體來說，將光敏劑TCPP、NAD+與甲酸脫氫酶均束縛于以SiO2為骨架的納米粒子內(nèi)部，而親水性的銠復(fù)合物則分布在納米粒子外側(cè)，如此構(gòu)建出的高度集成的單位活性結(jié)構(gòu)有效提高了電子傳遞效率，將NADH的再生率從11%提高到75%，將甲酸產(chǎn)量從15 μmol增加到100 μmol。另外，集成的雜化粒子結(jié)構(gòu)可實現(xiàn)銠復(fù)合物、酶和NAD+的低成本簡便回收，并在重復(fù)利用10個循環(huán)后仍能保留80％的催化活性，極大降低了應(yīng)用成本[圖2(c)]。

雖然很多酶的活性中心都被包埋在內(nèi)部，但是仍然還有部分含血紅素[33]或含黃素[34]的酶，其活性中心暴露在表面，在一定條件下可以直接接收光生電子進行酶催化反應(yīng)；另外，光生電子也可以通過注入酶遠端的鐵硫簇，繼而經(jīng)由酶內(nèi)部鐵硫簇等組成的電子傳遞鏈，最終轉(zhuǎn)移到催化活性位點。目前很多氫化酶[35-36]、甲酸脫氫酶[37]和固氮酶[23]等重要生物酶，都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以進行這樣的直接電子傳遞作用。這種直接電子傳遞的作用體系雖然適用的酶較少、應(yīng)用方面較窄，但避免使用昂貴的銠復(fù)合物可以減少轉(zhuǎn)化為NAD(P)H導(dǎo)致的能量損失，簡化了反應(yīng)體系的同時也可以降低反應(yīng)成本。

為了使光生電子有效地注入酶的活性中心，需要將氧化還原電勢匹配、無生物毒性的光催化劑，限制在酶的活性中心或遠端接收電子的鐵硫簇附近，一般在20 ?(1 ?=0.1 nm)內(nèi)的電子可以實現(xiàn)有效傳遞[35]，如此量子點與酶之間需要存在一種相互作用來縮近并穩(wěn)定二者之間的距離，否則激發(fā)的光生電子會有極大的概率與空穴復(fù)合發(fā)生猝滅，或者無法傳遞到酶分子中而導(dǎo)致反應(yīng)終止。目前的光催化劑-酶直接偶聯(lián)的方法包括靜電、疏水相互作用、共價修飾或特異性蛋白質(zhì)-氨基酸結(jié)合等[38]。這幾種方法互有利弊，具體來說，光催化劑與酶之間的靜電吸附[24, 39]作用廣泛存在，在不對酶進行復(fù)雜工程改造的情況下，通過簡單的靜電結(jié)合作用，也可能實現(xiàn)高效的光生電子的向酶反應(yīng)中心的注入。但由于并未專門針對酶中的氧化還原位點的臨近區(qū)進行設(shè)計，反應(yīng)效果具有隨機性，若結(jié)合位點與電子接收位點距離過遠，會導(dǎo)致電子傳遞損失甚至無傳遞作用，此外，除了會受周圍離子環(huán)境的干擾[40]，長時間的反應(yīng)中，靜電吸附作用會變得不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致反應(yīng)中斷。類似地，雖然碳材料以及多環(huán)芳香化合物等，可通過π-π相互作用與酶分子中的疏水區(qū)偶聯(lián)結(jié)合，但電子傳遞效果同樣存在不確定性。共價修飾具有最強的結(jié)合作用力，例如由于二苯并環(huán)辛炔（DBCO）與疊氮化物反應(yīng)可生成穩(wěn)定的三唑，在分別利用DBCO與疊氮化物進行修飾后，酶與光催化劑即可實現(xiàn)高選擇性的結(jié)合[24]。此外，利用偶聯(lián)劑（EDC/NHS）也能實現(xiàn)光催化劑與酶分子的共價連接，雖然這類方法具有可操作性強、應(yīng)用范圍廣、作用穩(wěn)定等優(yōu)點，但由于進行了有機分子的修飾，可能導(dǎo)致酶活性降低甚至失活。通過合理的蛋白質(zhì)設(shè)計改造，可在不影響酶活性的前提下，實現(xiàn)光催化劑與酶的位點特異性結(jié)合，最大限度地保證電子傳遞效率。一般來說，過渡金屬可通過配位作用，與酶分子上修飾的His-tag結(jié)合[41]，雖然作用效果較穩(wěn)定，且在蛋白質(zhì)分子的3'或5'添加組氨酸并不會對酶的活性造成損傷，但同時意味著蛋白質(zhì)的電子接收位點附近，至少需存在一個肽鏈的端點才能實現(xiàn)有效電子傳遞，應(yīng)用存在局限性。此外，可通過將電子接收位點附近的氨基酸誘變?yōu)榘腚装彼?，以巰基結(jié)合作用實現(xiàn)酶與金納米團簇（AuNCs）、銀納米團簇（AgNCs）等金屬催化劑的特異性結(jié)合[35]。雖然這類特異性結(jié)合設(shè)計可達到最理想的電子傳遞效率，但需要大量的前期準備工作，包括酶三維結(jié)構(gòu)信息的采集與分析，以及合成生物學(xué)改造等。

Reisner等[42]引入半人工光電極[43]的概念，構(gòu)建了光電驅(qū)動二氧化碳固定的體系，具體來說，是將生物提取的光合系統(tǒng)Ⅱ與固定了光敏染料的半導(dǎo)體結(jié)合，并作為光陽極，接受光照并產(chǎn)生光生電子，電子經(jīng)由外電路傳到由二氧化鈦與甲酸脫氫酶（FDH）構(gòu)成的陰極，通過FDH表面的FeS簇傳導(dǎo)到FDH氧化還原催化中心，實現(xiàn)二氧化碳到甲酸轉(zhuǎn)化。此體系繞過了自然界中的Z-Scheme和卡爾文循環(huán)的限制，如：光采集效率低及1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCO）周轉(zhuǎn)率低（1~10 s-1）等，提高了光激發(fā)電子的傳遞效率。雖然表面上看起來是利用電極催化，但其反應(yīng)的能量來源僅為太陽能，這種光伏電催化（PV-EC）體系有別于傳統(tǒng)的電催化，避免了火力發(fā)電過程中的污染問題，本質(zhì)同單純的光催化系統(tǒng)（PC）一樣，都是理想的反應(yīng)體系。在將體系進行了進一步改進后，他們實現(xiàn)了甲酸脫氫酶（FDH）與金屬氧化物（TiO2）偶聯(lián)完成的CO2的催化還原[圖3(a)][37]，石英晶體微天平（QCM）和衰減全反射紅外光譜（ATR-IR）證實了FDH與TiO2表面的高親和力，使得不存在氧化還原介質(zhì)的情況下，也能實現(xiàn)光驅(qū)動CO2向甲酸鹽的轉(zhuǎn)化，周轉(zhuǎn)頻率（TOF）約為11 s-1。

King等[44]研究了CdTe納米晶（NC-CdTe）和Clostridium acetobutylicum的[FeFe]-氫化酶I（H2ase）之間存在的靜電結(jié)合以及電荷轉(zhuǎn)移機制。經(jīng)驗證光生電子直接從核心納米晶而不是表面陷阱態(tài)，轉(zhuǎn)移到與NC-CdTe對接的H2ase遠端[Fe4S4]團簇，再順勢傳遞到活性中心實現(xiàn)質(zhì)子到H2的轉(zhuǎn)化，在單色光下光子對H2的最高轉(zhuǎn)化效率達到9%。Reisner等[45]通過在CDs表面修飾氨基得到的帶正電荷的CD-NMe2，可與[NiFeSe]-H2ase表面，帶負電的[Fe4S4]臨近區(qū)實現(xiàn)靜電結(jié)合，完成光激發(fā)電子向活性中心的傳遞，繼而實現(xiàn)高效和穩(wěn)定的底物轉(zhuǎn)化與H2合成，而羧基修飾的、帶負電荷的CDs（CD-CO2H），由于不具備結(jié)合作用，反應(yīng)活性較低。Holá等[40]通過研究天冬氨酸基碳點和[FeFe]氫化酶自組裝而成的AspCD/CrHydA1系統(tǒng)，揭示了犧牲電子供體形成的帶電環(huán)境，對周圍靜電結(jié)合組件間相互作用的顯著影響，具體來說，帶負電荷的EDTA可與CrHydA1的表面正電口袋相互作用，從而妨礙CD（+）顆粒與酶之間的靜電作用。而在TEOA形成的良好的靜電環(huán)境中，系統(tǒng)在420 nm光照下，反應(yīng)的外部量子效率可達到1.7%。Armstrong等[35]通過將[NiFe]氫化酶中距遠端[4Fe-4S]和內(nèi)側(cè)[3Fe-4S]10 ?內(nèi)的表面酪氨酸或蘇氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，實現(xiàn)了銀納米簇(AgNCs)的位點選擇性附著，繼而完成光生電子供應(yīng)氫化酶來驅(qū)動H2產(chǎn)生的過程。另外將形成的雜合體系負載在二氧化鈦和石墨氮化碳(g-C3N4)構(gòu)建的支架上形成的異質(zhì)結(jié)構(gòu)，能有效提高AgNCs的光生電子-空穴的分離效率，每分子氫化酶每秒能產(chǎn)生40個H2分子。Harris等[24]分別在CdS納米棒與MoFe固氮酶上修飾巰基-聚乙二醇-疊氮化物和二苯并環(huán)辛炔-馬來酰亞胺，繼而實現(xiàn)二者的共價結(jié)合，大大提高了H2產(chǎn)量[圖3(b)]。

Nagpal等[41]研究了AuNCs與His-tag修飾的固氮酶之間的電子傳遞作用，His-tag位于MoFe固氮酶α亞基的C端，與P簇/FeMo活性中心之間的距離很近，所以結(jié)合的AuNCs激發(fā)產(chǎn)生的光生電子可直接注入到P團簇，并轉(zhuǎn)移到FeMo中心，用于N2固定[圖3(c)]。另外還研究了幾種由于含不同金原子數(shù)，導(dǎo)致能帶結(jié)構(gòu)差異的AuNCs的反應(yīng)活性，結(jié)果表明Au22NCs最適合與固氮酶偶聯(lián)產(chǎn)NH3，而Au15和Au18等由于極低的VB位置并不利于生化反應(yīng)。

除無機半導(dǎo)體外，有機配體、發(fā)色團以及共軛聚合物等也可應(yīng)用于雜合生物酶體系[46]。生物酶的直接光激活可以消除其對輔因子與介質(zhì)的需要，某種程度上實現(xiàn)了體系的簡化，但同時也容易造成電子轉(zhuǎn)移效率低和活性氧（ROS）產(chǎn)生等不利影響，關(guān)鍵就在于材料與酶之間的定向結(jié)合能否實現(xiàn)光生電子的有效轉(zhuǎn)移，要精確地控制這種相互作用并非易事，而且酶的活性、三級結(jié)構(gòu)也可能在進行化學(xué)修飾或與材料結(jié)合后發(fā)生改變。值得一提的是，在研究過程中CDs由于具有廉價、低毒和可調(diào)節(jié)的表面化學(xué)修飾等優(yōu)良性質(zhì)，為人們廣泛關(guān)注[47]。總地來說，將光催化和酶催化結(jié)合不僅可促進太陽能轉(zhuǎn)化為燃料和增值化學(xué)品，也有望滿足日益增長的綠色和可持續(xù)化學(xué)需求。

銠基復(fù)合物等電子介體價格昂貴，且與生物催化劑相比周轉(zhuǎn)頻率(TOFs)低得多[48-50]，此外，為達到必要的NAD(P)H生產(chǎn)速率所需的相對較高濃度的銠配合物會導(dǎo)致生物質(zhì)失活[51-52]。在自然界中，存在心肌黃酶（DH）、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶（FNR）[39, 53-54]等一類含F(xiàn)AD/FMN活性中心的酶，可以實現(xiàn)NAD(P)H的合成，催化效率是銠基復(fù)合物的幾倍[55-58]。同時，此類酶的活性位點有些直接暴露在表面，可直接結(jié)合光催化劑獲得光生電子，高效率再生NAD(P)H。這種耦合了直接電子傳遞與輔因子介導(dǎo)兩種作用而成的混合型光催化-生物酶雜合系統(tǒng)，同樣繼承了兩方的優(yōu)勢，不僅應(yīng)用面廣泛、適用于活性中心暴露或不暴露兩種類型的氧化還原酶，而且避免了銠復(fù)合物對生物酶的毒害作用、降低成本的同時提升了TOFs。截至目前，人們已從例如Termotoga maritima[59]、Geobacillus stearothermophilus[60]、Bacillus subtilis[61]和Clostridium kluyveri[56]等微生物中，獲得了不同種類的心肌黃酶。King等[39]報道了利用硒化鎘量子點（CdSe），和Fd（鐵氧還蛋白）依賴的FNR構(gòu)建的雜合系統(tǒng)（圖4），表面覆蓋硫基丙酸（MPA）的量子點在Fd結(jié)合位點上表現(xiàn)出特異性吸附。光照下NADP+還原為NADPH，平均TOF為1440 h-1，在NADPH作用下乙醛經(jīng)醇脫氫酶催化實現(xiàn)到乙醇的轉(zhuǎn)化，NADPH和乙醇的量子產(chǎn)量均為5%~6%。

由于光催化反應(yīng)會產(chǎn)生大量的ROS，易導(dǎo)致酶失活，極大地限制了光催化-生物酶雜合系統(tǒng)的發(fā)展，所以如何在光反應(yīng)中維持生物酶的活性成為了人們亟待解決的問題。加入適當?shù)碾娮訝奚w，以防止空穴氧化生成ROS是最基本的手段，此外，促進高效的靶向電子傳遞作用，也是避免ROS大量生成的途徑之一。加入共/助催化劑（如CDs或銠復(fù)合物等），可以促進對空穴或光生電子的捕獲[62]，從根源上減少ROS生成。另外，采用固定化酶手段，將游離酶包裹在MAF-7、ZIF-8等MOFs材料中[31]，將其與ROS隔絕，可在一定程度上保護生物酶活性。Jiang等[63]制備了內(nèi)部附有TiO2膜的SiO2涂層，并將醇脫氫酶（ADH）和光催化劑CdS分別固定在其外表面和內(nèi)表面，利用NAD+/NADH在TiO2膜間的穿梭作用，實現(xiàn)了光催化與酶催化的隔室化反應(yīng)，SiO2涂層可使ADH免受光照傷害，并通過物理限制防止光催化產(chǎn)生的ROS影響ADH的活性。最后，通過額外加入過氧化氫酶（CAT）[64]、超氧化物歧化酶（SOD）等ROS酶，實現(xiàn)ROS的降解，一些具有類SOD、CAT活性的物質(zhì)如錳卟啉結(jié)構(gòu)、鉑納米粒子等[65]，也可被用于消除ROS，維持生物酶活性。

除了ROS，為盡可能維持生物酶在體外反應(yīng)的活性，需要對緩沖液的類型[66]、光強、反應(yīng)溫度、壓力等條件進行優(yōu)化，并且還要考慮產(chǎn)物濃度對酶活性的影響。例如利用FDH固定CO2合成甲酸時，過高的甲酸含量可能會導(dǎo)致pH降低，影響酶活性。此外，體系中產(chǎn)物濃度的提高也會阻礙正反應(yīng)的進行。因此，實現(xiàn)體系中產(chǎn)物的及時轉(zhuǎn)移，即反應(yīng)分離一體化，也是維持酶反應(yīng)活性的策略之一。膜分離技術(shù)由于具有反應(yīng)條件溫和、無須引入其他物質(zhì)等優(yōu)勢，不會對生物酶活性造成損傷，可用于酶發(fā)酵體系中產(chǎn)物的原位分離，裝置可分為內(nèi)置式與外置式兩種，雖然可以在一定程度上解除產(chǎn)物濃度過高對酶活性造成的抑制，但是膜的高成本，與膜堵塞、污染等問題也會增加反應(yīng)成本。除了提高酶活性，固定化技術(shù)也可用于酶的回收利用與連續(xù)發(fā)酵。通過包埋、吸附、共價結(jié)合、交聯(lián)和親和等作用[67]，可將酶約束在反應(yīng)器中并限制其自由流動，繼而實現(xiàn)產(chǎn)物與酶的連續(xù)分離，保證酶在連續(xù)發(fā)酵過程中的活性不受產(chǎn)物濃度影響。

光催化-微生物雜合系統(tǒng)是用微生物作為生物催化載體，利用太陽能為微生物代謝提供能量和還原力的系統(tǒng)。由于微生物具有精巧的代謝途徑，就為合成各種高碳化合物提供了可能性，同時由于微生物具有一定的膜保護及自我調(diào)控能力，在體系抗逆性與穩(wěn)定性方面相對酶體系更具有優(yōu)勢。與此同時，微生物為維持必要的生長代謝，需要消耗部分能量和還原力，導(dǎo)致光-產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率降低。但在高值化學(xué)品的綠色合成方面，光催化-微生物雜合系統(tǒng)仍具有極大發(fā)展優(yōu)勢及潛力[68]。在合成生物可降解塑料PHB、長鏈脂肪酸等復(fù)雜化合物時，由于反應(yīng)步驟煩瑣，導(dǎo)致所需的酶種類過多，而目前多酶級聯(lián)體系的構(gòu)建依舊面臨很大挑戰(zhàn)，不僅存在酶的純化工藝復(fù)雜、體外反應(yīng)的穩(wěn)定性較差等問題，產(chǎn)率也會隨步驟增多而顯著下降。但微生物由于內(nèi)部已經(jīng)進化出天然的代謝網(wǎng)絡(luò)以及應(yīng)激機制，一般情況下，選擇合適的底盤菌就能得到完整的產(chǎn)物合成通路，且無須外部添加輔因子、ATP等生物反應(yīng)的必需分子，而是由“細胞工廠”進行自發(fā)地合成及調(diào)配。

基于催化劑與微生物耦合方式的不同此系統(tǒng)可分為兩大類，即胞外光催化劑的供能體系以及注入到胞質(zhì)內(nèi)的光催化劑供能體系，而前者根據(jù)電子傳遞機理的不同又可分為直接電子傳遞與化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)兩種。

基于直接電子傳遞的微生物雜合系統(tǒng)實現(xiàn)的基礎(chǔ)在于微生物表面存在能直接接收電子的物質(zhì)[71-74]，或是利用膜上氫化酶直接完成H2的生成，或是通過如鐵氧還蛋白、黃素蛋白、細胞色素、OMCB等導(dǎo)電蛋白[75-77]或?qū)щ姳廾葘崿F(xiàn)電子向胞內(nèi)的引入。例如膜上含有導(dǎo)電蛋白的微生物包括希瓦氏菌（Shewanella）[78]、地桿菌（Geobacter）[79]等，可以實現(xiàn)電子跳躍；而鼠孢菌（Sporomusa）[80]、穆爾氏菌（Moorella）[15]、梭菌屬（Clostridium）[81]等，可通過膜上氫化酶接收電子直接實現(xiàn)氫氣生成，而合成的氫氣也可通過介導(dǎo)途徑為胞內(nèi)提供還原力[82]；另外本身含有光合系統(tǒng)（PS）的微生物如紅假單胞菌（Rhodopseudomonas）[63]則可通過PS及電子傳遞鏈（PET）的作用接收外源電子，促進光合作用[83-85]。

Sakimoto等[15]通過在非光合細菌Moorella thermoacetica表面自沉淀CdS納米顆粒，使非光合微生物具有光敏性。在這個系統(tǒng)中，Moorella thermoacerica通過代謝半胱氨酸產(chǎn)生S2-，其與外加的Cd2+反應(yīng)，實現(xiàn)了沉淀于微生物膜表面的CdS納米粒子的合成。在M. thermoacetica-CdS雜合系統(tǒng)中，光生電子可以直接傳遞到M. thermoacetica的胞內(nèi)并提供還原當量，利用Wood-Ljungdahl途徑來還原CO2生產(chǎn)乙酸，并隨著微生物的繁殖，膜外CdS納米粒子也可進行再沉淀作用，表明體系具有動態(tài)組裝及自我修復(fù)能力。他們后來又通過瞬態(tài)吸收(TA)光譜和時間分辨紅外(TRIR)光譜，針對此雜合系統(tǒng)的電子傳遞過程進行了系統(tǒng)性研究[圖5(a)][84]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜合體系的電子轉(zhuǎn)移可能存在兩種相互競爭的途徑：直接注入到膜上可接收電子的受體蛋白如Fd、Fp等，實現(xiàn)ATP的合成并直接還原CH2-THF；而隨著反應(yīng)進程，氫化酶的表達量會增加，動力學(xué)顯示電子更傾向于與膜上氫化酶或其他分子受體作用生成H2，再通過HydABC復(fù)合物的作用進入Wood-Ljungdahl途徑。Qiao等[86]針對此雜合系統(tǒng)的全局蛋白組和代謝物進行了詳細研究，實驗結(jié)果與之前提出的反應(yīng)機理相符合，明確了光催化劑對微生物造成的代謝改變，Wood-Ljungdahl途徑被激活。與之類似的還有Jin等[81]的研究結(jié)果，證明了Clostridium autoethanogenum與CdS納米顆粒形成的雜合系統(tǒng)，也可能同時存在電子向Rnf雜合體（與NADH再生相關(guān)）以及氫化酶注入（后轉(zhuǎn)到氫氣介導(dǎo)作用）這兩種直接電子轉(zhuǎn)移的機制。

Wang等[19]依照同樣的自沉淀原理構(gòu)建了CdS-Rhodopseudomonas palustris雜合系統(tǒng)，以實現(xiàn)光催化還原CO2合成生物可降解塑料——聚β-羥基丁酸酯（PHB）。其中光合系統(tǒng)（PS）可直接接收光能，產(chǎn)生的光生電子在電子傳遞鏈（PET）以及ATP合成酶的作用下，為體系提供NADPH以及ATP。而CdS產(chǎn)生的光生電子則可通過PET實現(xiàn)向細胞內(nèi)的直接注入，進一步促進還原力再生，更有效地為細菌細胞內(nèi)的CBB循環(huán)供能，合成的3-磷酸甘油醛通過代謝轉(zhuǎn)化最終生成PHB，產(chǎn)量較R. palustris提高了47%。另外此體系也可同時實現(xiàn)N2的固定[圖5(b)]，根據(jù)光合效率（PE）的計算，CdS包覆的R. palustris PE為6.73%，比天然細胞（2.35%）高186%，優(yōu)于許多光異養(yǎng)細菌[85]，固氮酶與卡爾文循環(huán)同時工作時，體系固定N2和CO2的比例分別為71.9%和28.1%，表面包覆CdS的光誘導(dǎo)電子賦予生物雜交細胞更大的生存能力。

Fu等[87]構(gòu)建了一種采用n型半導(dǎo)體TiO2納米線陣列作為光陽極，與生物陰極聯(lián)合的雙室反應(yīng)體系，利用太陽能作為唯一的能量輸入，光生電子經(jīng)由外電路直接傳遞給厭氧活性污泥中的微生物，最終實現(xiàn)CO2轉(zhuǎn)化為CH4。利用循環(huán)伏安法檢測陰極室過濾后的無細胞上清液，發(fā)現(xiàn)沒有氧化還原峰且電流可以忽略不計，排除了體系中存在可溶性電子介體的可能性，驗證了電子是從電極直接轉(zhuǎn)移到微生物的作用方式，由此導(dǎo)致了96%的極高法拉第效率。

合成生物學(xué)改造難度小、產(chǎn)物譜豐富的生產(chǎn)用工程菌株往往無法實現(xiàn)電子的直接跨膜傳遞，為了能夠和更廣泛的工程菌株進行適配，可以通過化學(xué)物質(zhì)作為載體介導(dǎo)電子傳遞[88]，突破電子傳遞模式只能用于親電微生物的限制，實現(xiàn)更多高價值化合物的合成。常見的介導(dǎo)物質(zhì)有甲基紫精、氫氣與甲酸等。

甲基紫精（MV）是最早用作光催化-微生物雜合系統(tǒng)的電子介體，其氧化形式（MV2+）可以通過光催化作用還原為甲基紫精陽離子(MV?+)，進而介導(dǎo)電子傳遞[89]。Honda等[90-91]利用TiO2作光催化劑、甲基紫精（MV）為電子介體，實現(xiàn)了無貴金屬的全細胞催化產(chǎn)氫作用，并通過改善反應(yīng)條件優(yōu)化了甲基紫精的再生效率，繼而提高了光催化產(chǎn)氫率[圖6(a)]。但體系需嚴格厭氧，否則電子無法傳遞給氫化酶進行氫氣生成。而Zhao等[92]通過仿生硅礦包裹構(gòu)建了核殼結(jié)構(gòu)的大腸桿菌聚集體，在空氣條件下，SiO2殼中位于外層的、暴露在有氧條件下的菌體，將進行有氧發(fā)酵并逐漸消耗氧氣，而內(nèi)部的菌體則自然避免了氧氣的干擾，能夠?qū)崿F(xiàn)在空氣條件下的全細胞光催化產(chǎn)氫。利用膜結(jié)合的重金屬螯合蛋白PbrR與鎘離子結(jié)合，實現(xiàn)的CdS納米粒子的原位合成與表面展示，通過加強臨近效應(yīng)縮短了甲基紫精從CdS處接收電子，到將電子傳導(dǎo)入胞內(nèi)[NiFe]氫化酶的距離，提高了電子傳遞效率以及產(chǎn)氫性能。值得注意的是，如CdS等含有硫族元素的光催化劑，由于易被光生空穴氧化，所以存在嚴重的光腐蝕問題。醇、胺、抗壞血酸和EDTA等物質(zhì)通常被作為犧牲還原劑，來清除光生空穴從而保持光催化劑的穩(wěn)定性，而Zhao等[92]就是通過添加100 mmol/L的抗壞血酸，維持了系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)。

甲基紫精雖然有一定的應(yīng)用前景，但是它們對微生物的毒害性較大。而氫氣作為清潔無害物質(zhì)也同樣可以成為電子載體，在膜結(jié)合氫化酶的作用下可分解為菌體提供ATP，與此同時可溶性氫化酶也可以利用氫氣產(chǎn)生胞內(nèi)還原力NADH。Zhang等[64]在以TEOA為電子供體的情況下，采用光催化劑g-C3N4收集光能產(chǎn)生氫氣，而氫氣作為電子載體，分別在膜結(jié)合的氫化酶（MBH）與可溶性氫化酶（SH）的作用下，為Ralstonia eutropha H16提供ATP與NAD(P)H，最終將PHB產(chǎn)量提升至1.4倍。經(jīng)過后續(xù)研究，將電子供體從對微生物有毒性的TEOA優(yōu)化為水，提高生物相容性的同時也使體系更趨近于自然光合作用[93]。同時g-C3N4-過氧化氫酶-R. eutropha這一改進體系，通過過氧化氫酶，將材料表面由水分子捕獲價帶空穴而積累的H2O2分解為H2O與O2，后者與H2均為微生物氣體發(fā)酵提供基礎(chǔ)，同時避免了光催化生成的H2O2對微生物造成的損害[圖6(b)]。此光催化系統(tǒng)具有優(yōu)異的光能到化學(xué)能轉(zhuǎn)化效率，氫氣產(chǎn)量可達55.72 mmol/h，經(jīng)48 h光發(fā)酵PHB的產(chǎn)量達到41.02 mg/L。這種純粹的氫氣介導(dǎo)機制中，體系中的氫氣是通過光催化材料實現(xiàn)的生產(chǎn)，而非光生電子向微生物膜上氫化酶注入而得的，與前所述的體系相比這是一個根本性的不同點。

甲酸也是一種常見的電子載體[94]，其一定程度上解決了H2由于過低的水溶解度導(dǎo)致的傳質(zhì)效率和電子傳遞速率過低的限制，甲酸在膜結(jié)合的甲酸脫氫酶與可溶性甲酸脫氫酶的作用下，可分別為菌體提供ATP與NAD(P)H，同時分解而成的CO2可直接參與CBB固碳循環(huán)。Song等[95]通過甲酸脫氫酶（Cs-FDH）實現(xiàn)CO2到甲酸的胞外轉(zhuǎn)化，而甲酸此時作為碳載體與電子載體進入細胞，可為細胞提供還原力與碳來源。最后通過異源表達1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）提高固碳效率，能使CO2更有效地實現(xiàn)到PHB的生物合成，120 h內(nèi)產(chǎn)量達到了485 mg/L。

雖然間接介導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移模式一定程度上減少了直接電子傳遞模式對微生物提出的必要限制因素，但從電子轉(zhuǎn)移效率來看，前者在物質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中不可避免地會導(dǎo)致額外的能量損失。

合成代謝過程基本在細胞質(zhì)中進行，胞外的電子與氧化還原穿梭分子通過膜向細胞質(zhì)的傳遞過程不僅會消耗額外的能量，同時也受到膜擴散的限制[98]。為解決這一問題，Yang等[96]提出了一個新的光催化-生物雜合系統(tǒng)組裝策略，將光催化材料導(dǎo)入到菌體內(nèi)部，在胞內(nèi)直接實現(xiàn)還原力與能量的供給。他們將生物相容性及穩(wěn)定性良好的金納米團簇（AuNCs）導(dǎo)入到M. thermoacetica內(nèi)部，AuNCs直接在胞內(nèi)吸收光能，產(chǎn)生的光生電子可以直接轉(zhuǎn)移到酶及其他介質(zhì)上實現(xiàn)還原力的再生[圖7(a)]。用結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）及能量色散X射線光譜（EDS）闡明了細胞攝取AuNCs的可行性及材料在胞內(nèi)的穩(wěn)定性。此外AuNCs同時具有猝滅活性氧的作用，降低了材料對菌體的傷害，提高了生物相容性，AuNCs也不存在之前CdS體系中材料的光氧化問題，因此不僅提高了能量效率，提高了乙酸產(chǎn)量，也大大改善了光反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，使反應(yīng)活性可以維持至少4 d。

注入到細胞質(zhì)內(nèi)的光催化劑會與酶進行隨機結(jié)合，造成能量損失，而Ding等[97]實現(xiàn)了光催化納米量子點與生物酶的胞內(nèi)定向結(jié)合[圖7(b)]，這種直接電子傳遞機制提高了光生電子的利用效率，進一步實現(xiàn)了人工光合系統(tǒng)的優(yōu)化。通過His-tag修飾，A. vinelandii胞內(nèi)固氮酶和R. eutropha膜上氫化酶分別可實現(xiàn)與CdS@ZnS QDs的特異性結(jié)合，大大提高了NH3與H2產(chǎn)量，在1.6 mW/cm2的LED燈照射下，借助膜上氫化酶及呼吸鏈反應(yīng)產(chǎn)生的ATP，可使PHB產(chǎn)量提高到野生型的150%，自然光下擴大的傳統(tǒng)生物反應(yīng)器的高產(chǎn)量表明了用太陽能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的可能性。Yong等[98]通過將CuInS2/ZnS量子點轉(zhuǎn)移到表達周質(zhì)氫酶的Shewanella oneidensis中，構(gòu)建了一個獨特的周質(zhì)光敏生物雜交系統(tǒng)[圖7(c)]。QDs光敏劑的光激發(fā)和電子轉(zhuǎn)移過程同時發(fā)生在Shewanella oneidensis的周質(zhì)中，縮短了電子輸運的距離，避免了跨膜過程中產(chǎn)生的額外能量損失，此外狹窄的周質(zhì)空間使局部氫化酶濃度提高，增加了酶和光敏劑之間相互作用的概率，光生電子通過氫化酶中的Fe-S簇迅速轉(zhuǎn)移到活性中心，實現(xiàn)質(zhì)子還原和H2的產(chǎn)生，產(chǎn)量是裸量子點的8.6倍。

將光催化納米粒子注入胞內(nèi)繼而實現(xiàn)還原能供給的體系還處于起步階段，電子傳遞機理尚不明確。與此同時，定向結(jié)合的模式雖然減弱了光生電子隨機傳導(dǎo)對微生物造成的危害，但仍無法避免空穴利用如谷胱甘肽、半胱氨酸等常見胞內(nèi)還原物質(zhì)，造成代謝布局紊亂的潛在可能性，將對材料的生物相容性提出更高要求。

基于酶與微生物的這兩類雜合體系互有利弊[99]：前者反應(yīng)簡便快速，但生物酶不僅提取分離步驟煩瑣，在體外也極易喪失活性，導(dǎo)致體系穩(wěn)定性低，且簡單的單酶反應(yīng)無法實現(xiàn)低成本底物到高價值化合物的轉(zhuǎn)化，而多酶級聯(lián)體系的構(gòu)建困難大，且轉(zhuǎn)化率逐級降低；與此相對的，光催化-微生物雜合系統(tǒng)由于微生物可進行自體繁殖，加上各種膜結(jié)構(gòu)以及應(yīng)激機制的保護，其穩(wěn)定性相較酶系統(tǒng)有極大程度的提高，且通過微生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，可實現(xiàn)多種復(fù)雜化合物的定向合成，但是體系存在一定的構(gòu)建及調(diào)控難度[100]。

雖然光催化-生物雜合系統(tǒng)的構(gòu)建還存在一些問題，但經(jīng)過不斷研究也已經(jīng)初步探索出了一些可行的解決手段。材料方面，除了進行改性修飾改善電子-空穴復(fù)合率、通過整合互補技術(shù)提高太陽能利用率[101]外，重要的是要兼顧其生物相容性、光照下生物毒性、體系適配性等問題。通過外層包裹谷胱甘肽（GSH）或半胱氨酸（Cys）等配體，可顯著降低材料的生物毒性[102]。由于材料與蛋白結(jié)合可能影響蛋白三級結(jié)構(gòu)致使其失活，與膜的結(jié)合涉及到吸附、膜變形甚至顆粒的內(nèi)吞封裝，大顆粒可能會導(dǎo)致膜穿孔造成細胞死亡[103]，在這一點上尺寸較小的量子點具有優(yōu)勢，而球形顆粒則被證明是微生物接受度最高的形態(tài)[104]。材料的能帶結(jié)構(gòu)也是影響其生物相容性的重要因素之一，過高或過低的能帶位置會破壞生物體原本的代謝布局并產(chǎn)生大量ROS以至體系失活[38]，由此選用光電性能與電子轉(zhuǎn)移蛋白及各類輔因子相匹配的光催化劑，以及適當?shù)碾娮庸w尤為重要。另外，由于紫外線或更高能量的輻射光會導(dǎo)致酶失活、DNA損傷和細胞死亡，材料的吸收范圍最好調(diào)整為可見光，CdS作為相對成熟的模式材料有一個缺陷就在于它依賴紫外區(qū)，而InP作為一種吸收可見光的光催化材料或許未來能有廣闊的發(fā)展[105]。

合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展也為雜合系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用提供了有力手段，通過蛋白質(zhì)工程可以實現(xiàn)酶的定向改造，通過氨基酸突變以及其他修飾改造可實現(xiàn)材料與酶分子的定向結(jié)合[24]，為促進電子向酶活性中心的注入，或?qū)崿F(xiàn)酶固定化從而維持活性創(chuàng)造條件。另外，通過基因工程改造，可實現(xiàn)光催化劑與微生物之間自發(fā)的生物相容性組裝，或光催化劑的原位生物合成[106-109]。如QDs可在細胞內(nèi)與經(jīng)His-tag修飾的固氮酶或氫化酶實現(xiàn)特異性結(jié)合，繼而激活光催化-微生物雜合系統(tǒng)，完成固氮或固碳作用[97]。而Zhong等通過基因編輯，將大腸桿菌生物膜中的CsgA蛋白與His-tag融合表達，得到的菌株能與無機納米材料實現(xiàn)動態(tài)自組裝[110]，而后通過表達具有礦化能力的短肽，設(shè)計合成的TcReceiver/CsgAA7生物膜，還可實現(xiàn)CdS NPs在細胞外，高特異性、高生物相容性的原位合成，得到的穩(wěn)定的生物膜具有光電響應(yīng)，可被用于全細胞光催化反應(yīng)[111]。此外，利用表面展示技術(shù)實現(xiàn)PbrR在細胞膜上的表達[109]，可提高細胞對重金屬離子的親和力，繼而促進納米粒子的生物合成，實現(xiàn)光催化-生物雜合系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用。

最后，有關(guān)電子傳遞效率方面，如何實現(xiàn)材料與生物質(zhì)之間的良好相互作用，以最大限度地提高電子轉(zhuǎn)移效率也是至關(guān)重要的命題，雖然目前的很多研究旨在闡明雜合系統(tǒng)的機制，但仍然還有很多不確定性，全面且明確地掌握雜合系統(tǒng)作用原理是實現(xiàn)清潔高效生產(chǎn)燃料及增值化學(xué)品的重要基礎(chǔ)，基于本質(zhì)出發(fā)才能更好地實現(xiàn)對光催化劑、生物質(zhì)的優(yōu)勢改造，促進物質(zhì)和能量在無機-生物界面的傳導(dǎo)，最終提高產(chǎn)品效益。

光催化-生物雜合系統(tǒng)具有可持續(xù)、高效產(chǎn)專一化學(xué)品的能力[105, 112-114]，無論從新能源開發(fā)還是固碳角度來說都是實現(xiàn)“碳中和”的重要手段，在進行溫和、無污染的催化反應(yīng)的同時，還能實現(xiàn)低成本底物到單一增值化學(xué)品、清潔能源的可持續(xù)高效轉(zhuǎn)化[68]，其潛在優(yōu)勢還表現(xiàn)在其他方面，如能量效率可遠高于自然光合效率（<1%）[115]，為提高反應(yīng)效率、優(yōu)化體系等提供了基礎(chǔ)，是自然光合作用的復(fù)現(xiàn)、簡化和優(yōu)化，未來糅合仿生學(xué)理念可進行更深層次、更廣泛性的研究，是人類利用自然、改造自然的合理舉措。