側(cè)流膠體金免疫試紙快速測(cè)定牛奶中的泰樂(lè)菌素

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是非常重要的一類抗菌化合物，廣泛用于人類和獸醫(yī)的治療和預(yù)防[1]。泰樂(lè)菌素(tylosin，TYL)是最常用的預(yù)混大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌、支原體、巴斯德氏菌以及衣原體具有很高的活性[2]。它們被廣泛用于動(dòng)物生產(chǎn)中，以預(yù)防和治療家畜的腸道和呼吸道感染[3-4]。濫用抗生素可能會(huì)在可食用的動(dòng)物組織和牛奶中留下殘留物，對(duì)消費(fèi)者健康造成不利的影響。因此，許多國(guó)家禁止在飼料添加劑中使用TYL，它于1998年在歐盟被禁止。在中國(guó)，可食用動(dòng)物組織中TYL的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)規(guī)定為50 μg/kg(牛奶)和200 μg/kg(肌肉組織)[5]。牛奶中TYL的MRL也是巴西農(nóng)業(yè)、畜牧和食品供應(yīng)部在牛奶中TYL殘留法規(guī)中采用的MRL。這與歐盟和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)要求的MRL一致[6-7]。為了評(píng)估TYL的殘留量，需要靈敏的分析方法以確保低濃度下的測(cè)定。文獻(xiàn)揭示了幾種測(cè)定肌肉組織中TYL殘留的方法，如HPLC[8-9]、薄層色譜[10]、LC-MS/MS[11-12]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析[13]。盡管這些方法準(zhǔn)確可靠，但它們昂貴，預(yù)處理(尤其是提取和純化)復(fù)雜且耗時(shí)，因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試或常規(guī)分析的高通量分析篩查[14]。從實(shí)踐的角度來(lái)看，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單，低成本，省時(shí)的篩選技術(shù)至關(guān)重要[15]。

自1980年初期發(fā)展以來(lái)，側(cè)流免疫層析測(cè)定技術(shù)已獲得廣泛認(rèn)可[16]，其受歡迎的主要原因是測(cè)試設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單性。側(cè)流免疫層析測(cè)定裝置緊湊且易于攜帶，大多數(shù)不需要外部試劑即可獲得結(jié)果，添加液體樣品將啟動(dòng)并完成測(cè)試，結(jié)果快速且易于解釋，通常無(wú)需借助儀器，檢測(cè)試紙條的制造相對(duì)容易且便宜。近年來(lái)，側(cè)流免疫層析試紙被用作檢測(cè)激素[17]、病毒(艾滋病毒、乙肝和丙型肝炎、新冠病毒)[18-20]、細(xì)菌[21]和寄生蟲等抗原的流行診斷工具[22]。對(duì)于較小的分析物，可以使用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定[23]，檢測(cè)試劑通常是針對(duì)分析物的膠體金標(biāo)記抗體。捕獲線通常是與固定在膜上的載體蛋白綴合的分析物。樣品中的分析物將與固定在膜上的分析物競(jìng)爭(zhēng)，從而與檢測(cè)抗體結(jié)合。樣品中存在的分析物越多，它將越有效地阻止膠體金標(biāo)記抗體的捕獲。因此，樣品中分析物數(shù)量的增加將導(dǎo)致讀出區(qū)域中信號(hào)的減少[24-25]。到目前為止，競(jìng)爭(zhēng)性剝離測(cè)試主要用于檢測(cè)小分子物質(zhì)(半抗原)，尤其是在動(dòng)物飼養(yǎng)中濫用的藥物。這種競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的檢測(cè)極限可以達(dá)到ppb水平(每克樣品分析物的納克級(jí)數(shù))。

在這項(xiàng)工作中，針對(duì)TYL的免疫原，產(chǎn)生了TYL的特異性單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAb)。在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了一種單步免疫色譜測(cè)試條，用于檢測(cè)牛奶中的TYL殘留性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸和酪蛋白，American Sigma Company；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，American Amresco Company；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，American Jackson Laboratory；聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料片、血液濾過(guò)膜、吸收紙，上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素(nitrocellulose membrane，NC)膜，American Millipore Company。

1.2 儀器與設(shè)備

Forma 371 Steri-Cycle酶標(biāo)儀，Thermo Fisher；XYZ Biostrip分配器、CM 4000切割機(jī)，美國(guó)加利福尼亞州Bio-Dot。

1.3 免疫原的偶聯(lián)

通過(guò)碳二亞胺法制備該程序中的TYL。將5 mg的TYL溶解在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PBS，pH 7.0)中，然后加入10 mg的碳二亞胺化合物。將混合物在黑暗中于4 ℃攪拌約6 h。將BSA或卵清蛋白(ovalbumin，OVA)溶解在PBS緩沖液中，并加入混合物中。TYL與BSA或OVA的摩爾比為25∶1。將免疫原BSA-TYL(OVA-TYL)在室溫下攪拌過(guò)夜，并用PBS透析約3 d [26]。通過(guò)紫外光譜和SDS-PAGE分析免疫原。免疫原在-20 ℃的條件下保存。

1.4 單克隆抗體生產(chǎn)

用3種免疫原中的每一種免疫5只雌性BALB/c小鼠(6周齡)(每只小鼠的劑量為50 μg蛋白)，以產(chǎn)生mAb。每2周使用弗氏完全佐劑中的免疫原乳劑對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫。第三次免疫后從每只小鼠收集血清，并通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)抗體滴度。處死具有最高抗體滴度的小鼠，并使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合脾細(xì)胞。融合的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中繁殖。融合后，使用HAT培養(yǎng)基針對(duì)選擇未融合的細(xì)胞。在選擇融合細(xì)胞之后，將HAT培養(yǎng)基替換為HT培養(yǎng)基。使用非競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA篩選生長(zhǎng)中的雜交瘤細(xì)胞中抗體的產(chǎn)生。通過(guò)有限稀釋法將產(chǎn)生針對(duì)TYL的特異性mAb的雜交瘤亞克隆2次。收集亞克隆的雜交瘤細(xì)胞，離心并在液氮中冷凍[20]。用飽和硫酸銨沉淀法純化雜交瘤小鼠的腹水，并用于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(icELISA)。

1.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

微量滴定板的每個(gè)孔均涂有100 μL包被抗原。將板在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后用200 μL封閉緩沖液(0.01 mol/L含50 g/L BSA的PBS)封閉。隨后將50 μL最佳抗體稀釋液和50 μL具有連續(xù)稀釋度的TYL標(biāo)準(zhǔn)液添加到孔中，并將滴定板在37 ℃下孵育30 min。洗滌后再加入100 μL稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP溶液，并將板在37 ℃下孵育30 min。洗滌后，加入100 μL 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)底物(在0.05 mol/L檸檬酸緩沖液中，pH 4.5 的10 g/L TMB和H2O2)，在37 ℃ 孵育10 min后，反應(yīng)用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。然后，用在450 nm處測(cè)量吸光度OD450值。為了間接比較不同的校準(zhǔn)曲線，將OD450值轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的測(cè)試抑制率，如公式(1)所示：

測(cè)定抑制率

(1)

式中：B，OD450值；B0，非競(jìng)爭(zhēng)性抗原OD450值；Bck，陰性對(duì)照OD450值。

1.6 膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備

通過(guò)用10 g/L檸檬酸鈉控制還原氯化金來(lái)制備平均直徑為15 nm的膠體金。簡(jiǎn)而言之，將50 mL的0.1 g/L氯化金三水合物的超純水溶液(Millipore，美國(guó))加熱至沸騰，然后在攪拌的同時(shí)添加1 mL的10 g/L檸檬酸鈉溶液。顏色從淺黃色變?yōu)榱良t色后，將溶液再煮沸5 min，以完成氯化金的還原。用碳酸鈉(0.2 mol/L)將膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.0。通過(guò)以下步驟確定最佳的蛋白質(zhì)標(biāo)記濃度[27]：將25 μL抗-TYL mAb溶液與25 μL膠體金溶液混合。將混合物在室溫下孵育15 min，然后添加100 μL的100 g/L NaCl溶液。用于膠體金標(biāo)記的mAb的最佳濃度是不改變顏色的最低mAb溶液濃度。在20 mmol/L硼酸鈉(pH 9.0)中加入1 mL 100 g/L BSA溶液后，將混合物在室溫下再孵育10 min，然后在10 ℃下通過(guò)重復(fù)離心(25 000×g)洗滌標(biāo)記的mAb用含有10 g/L BSA和1 g/L疊氮化鈉的20 mmol/L硼酸鈉(pH 9.0)處理30 min。沉淀物重懸在洗滌緩沖液中，并保存在4 ℃以便使用[20]。

1.7 TYL試紙條的組裝

免疫層析卡包括樣品墊、共軛墊、NC膜、吸收墊、PVC底板以及檢測(cè)線和質(zhì)控線，并在其兩端覆蓋有彩色膜。TYL與BSA連接，然后用作檢測(cè)線捕獲試劑(BSA-TYL)。將山羊抗小鼠IgG用作捕獲試劑，在NC膜上進(jìn)行測(cè)試。金標(biāo)抗體用量按照上述優(yōu)化后的條件加入96孔板的微孔，在40 ℃下干燥1 h后，將膜密封并在室溫下在干燥條件下貯存。通過(guò)用20 mmol/L含87.5 g/L蔗糖，87.5 g/L BSA，0.6 mol/L NaCl的硼酸鈉緩沖液(pH 8.0)將膠體金標(biāo)記的mAb稀釋為TYL制備綴合物溶液。10 mmol/L EDTA和1 g/L 疊氮化鈉的終質(zhì)量濃度為2 μg/mL。將7 mm×300 mm 玻璃纖維(Millipore，MA，USA)浸入共軛溶液中，制成共軛墊，然后在56 ℃下干燥1 h。樣品墊和吸收墊是由無(wú)紡布的100%純纖維素制成的[25,28]。使用切割機(jī)將主卡切成3 mm寬的條。然后將條帶在干燥劑凝膠存在的情況下密封在塑料袋中，并保存在4 ℃下。

1.8 測(cè)試程序和原則

牛奶樣品在5 000 r/min下離心15 min以去除脂肪。將一塊測(cè)試條插入80 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品中10 s，然后將其平放以使溶液遷移。膠體金標(biāo)記的抗TYL mAb被固定在膜上的BSA-TYL捕獲，形成一條清晰的紅色測(cè)試線。過(guò)量標(biāo)記的抗TYL mAb進(jìn)一步遷移并被形成對(duì)照系的山羊抗小鼠IgG抗體捕獲，完成測(cè)試需要10 min。如果樣品中存在TYL，它將與測(cè)試線上的固定BSA-TYL競(jìng)爭(zhēng)，以結(jié)合有限量的膠體金標(biāo)記的抗TYL mAb(圖1)。

圖1 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)原理示意圖[29]
Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of colloidal gold immunochromatographic test strips[29]

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)14.0(data processing system，DPS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[30]。數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有數(shù)據(jù)均適用于分析，無(wú)需任何轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 mAb對(duì)TYL的影響

通過(guò)ELISA法評(píng)估了針對(duì)TYL的單克隆抗體mAb對(duì)TYL的影響?？贵w效價(jià)表示為最大稀釋度的倒數(shù)，最大稀釋度產(chǎn)生的OD450值比陰性對(duì)照高2.1倍。結(jié)果表明，抗體效價(jià)為2.56×10-5(圖2)。將IC50(IC50是捕獲在測(cè)試線上的膠體金標(biāo)記的抗TYL mAb 50%抑制的濃度。交叉反應(yīng)性表示為競(jìng)爭(zhēng)者的IC50濃度除以TYL的百分比)評(píng)估為50%測(cè)試抑制率下的TYL濃度。結(jié)果表明，IC50為4.609 1 ng/mL。通過(guò)用PBS稀釋TYL來(lái)建立ELISA的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(圖3)。

圖2 抗TYL抗體滴度
Fig.2 Anti-TYL antibody titer
注：NC為陰性對(duì)照

圖3 icELISA的抑制曲線
Fig.3 Inhibitory curves by icELISA
注：標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為1、2、4、8、16、32 ng/mL, 以標(biāo)準(zhǔn)樣品取對(duì)數(shù)計(jì)算

2.2 試紙的靈敏度

通過(guò)測(cè)試TYL標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)預(yù)測(cè)試紙條的靈敏度。用讀數(shù)儀掃描檢測(cè)線。G/Peak和G/D×相對(duì)光密度(relative optical density，ROD)的面積隨著標(biāo)準(zhǔn)樣品中TYL濃度的增加而降低(圖4和表1)。

使用無(wú)污染牛奶測(cè)定了檢出限(limit of detection，LOD)。LOD以陰性樣品20次測(cè)定結(jié)果的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。與陰性對(duì)照(NC)相比，LOD對(duì)應(yīng)于G/D×Area-ROD下降10%的濃度。結(jié)果表明，使用掃描儀計(jì)算出的LOD為1.563 4 ng/mL，而使用眼睛計(jì)算出的LOD為10 ng/mL。計(jì)算其IC50為7.836 2 ng/mL。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的ROD曲線
Fig.4 ROD curves of standard samples
注：使用測(cè)試條測(cè)試了0、2、4、8、16、32、64 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)TYL樣品； 用TSR3000膜條讀取器掃描測(cè)試線(309 mm×188 mm，分辨率72×72)

表1 G/Peak和G/D×標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試線的ROD面積
Table 1 G/Peak and G/D×Area of the ROD of test lines of standard samples

2.3 試紙的特異性

根據(jù)四參數(shù)對(duì)數(shù)方程，抗TYL mAb對(duì)TYL和其他獸藥的IC50和反應(yīng)性如表2所示。計(jì)算得出TYL的IC50為7.836 2 ng/mL，而其他獸藥(包括替米考星、螺旋霉素、交沙霉素、羅紅霉素、紅霉素、阿奇霉素、磺胺甲氧二嗪、克侖特羅、鏈霉素和萊克多巴胺)IC50值均>3 000 ng/mL。近年來(lái)，許多研究人員開(kāi)發(fā)了ELISA方法來(lái)檢測(cè)動(dòng)物尿液和組織中的TYL[5,31-32]。眾所周知，這種方法至少需要3～4 h才能完成。相反，本發(fā)明的免疫層析側(cè)流試紙條是一步測(cè)定，需要的專業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)儀器少得多。此外，就潛在的交叉反應(yīng)性而言，與檢測(cè)TYL殘基的多克隆抗體相比，單克隆抗體似乎是更好的解決方案。

2.4 試紙和HPLC之間的比較研究

作為比較任務(wù)，HPLC分析[27]被用作鑒定和定量牛奶中TYL的確認(rèn)方法。從河南省的10個(gè)農(nóng)場(chǎng)中隨機(jī)抽取10個(gè)有代表性的測(cè)試樣品。結(jié)果如表3所示。與HPLC檢測(cè)相比，期望的最小符合率<15%。

表2 抗TYL單抗與其他獸藥的反應(yīng)性
Table 2 Reactivity of anti-TYL mAb with other veterinary drugs

盡管發(fā)現(xiàn)HPLC、ELISA和試紙條都適合分析生物樣品中的TYL殘留，但ELISA和試紙條更為靈敏。當(dāng)樣品中存在高濃度的TYL時(shí)，HPLC和試紙條給出的結(jié)果一致或幾乎相同，而當(dāng)樣品中存在低濃度的TYL時(shí)，其讀數(shù)卻不同(表3)。原因是TYL的量已達(dá)到定量極限。在TYL濃度低于HPLC定量限的條件下，測(cè)試條是分析TYL殘留的更好選擇。

表3 用試紙條和HPLC分析檢測(cè)牛奶中TYL 殘留的測(cè)試結(jié)果比較
Table 3 Comparison of testing results with test strips and HPLC analysis for detection of TYL residues in milk

3 結(jié)論

本文以牛奶中的TYL為免疫原，成功開(kāi)發(fā)了使用TYL特異性mAb的側(cè)流膠體金免疫層析試紙條。通過(guò)和HPLC、ELISA檢測(cè)方法的比較，發(fā)現(xiàn)試紙的LOD為1.563 4 ng/mL,IC50為7.836 2 ng/mL，與ELISA的檢測(cè)結(jié)果有良好的符合率，該指標(biāo)完全可以滿足國(guó)家的最低標(biāo)準(zhǔn)要求。結(jié)果表明，它對(duì)牛奶樣品中TYL殘留的檢測(cè)具有很高的特異性和靈敏度。特別是，無(wú)需特殊設(shè)備，即可在20 min 內(nèi)獲得結(jié)果。綜上所述，這種牛奶中的TYL快速檢測(cè)方法，對(duì)于牛奶飲用安全性提供了保障。