4-羥基異亮氨酸無抗發(fā)酵的菌株構(gòu)建和上罐條件優(yōu)化

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)是一種天然的非蛋白質(zhì)氨基酸，被首次發(fā)現(xiàn)于葫蘆巴種子中[1]。4-HIL具有降低胰島素抵抗、治療高血脂和代謝紊亂等非傳染性疾病，是一種治療Ⅱ型糖尿病[2]及其并發(fā)癥的潛在藥物，具有非常廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。4-HIL具有8種立體異構(gòu)體，研究表明，其中具有治療糖尿病作用的結(jié)構(gòu)僅為(2S, 3R, 4S)-4-HIL一種構(gòu)型[5]。

最早期生產(chǎn)4-HIL的方法主要采用胡蘆巴種子提取法，但是該生產(chǎn)方法存在原料需求量大、雜質(zhì)多導(dǎo)致分離純化較為困難、最終收率較低和成本昂貴等缺點(diǎn)[1]。利用化學(xué)-酶合成法可以較大的提升產(chǎn)品的最終得率[6]，但也存在操作繁瑣、耗時較長以及產(chǎn)品純度較低等缺點(diǎn)，不利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。2009年，KODERA等[7]在Bacillus thuringiensis 2e2中發(fā)現(xiàn)了異亮氨酸雙加氧酶(isoleucine dioxygenase，IDO)。IDO可以直接特異性催化異亮氨酸(isoleucine，Ile)的C4發(fā)生羥基化，從而生成(2S, 3R, 4S)-4-HIL。IDO的催化生產(chǎn)不會產(chǎn)生4-HIL的其他構(gòu)型，自身也具備易獲取、催化過程簡單和生產(chǎn)成本少等特點(diǎn)，最適合用來工業(yè)化生產(chǎn)4-HIL[8]。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過在Ile生產(chǎn)菌株C. glutamicum ssp. lactofermentum SN01(以下簡稱為SN01)中表達(dá)ido基因，構(gòu)建了重組菌株SN02，利用自身合成的Ile催化合成得到(65.44±2.27) mmol/L的4-HIL，實(shí)現(xiàn)了4-HIL的從頭生物合成[9]。為了增加Ile的供應(yīng)，過表達(dá)天冬氨酸激酶編碼基因lysC；為了增強(qiáng)ido表達(dá)，過表達(dá)韋氏芽孢桿菌中的ido3基因，構(gòu)建了質(zhì)粒pJYW4-ido-lysC-ido3[10]。

在很早之前，抗生素的過度使用而引起的抗生素抗性基因擴(kuò)散便引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注?？股乜剐曰虻臄U(kuò)散會引起大量具有抗性的微生物產(chǎn)生，在疫苗和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，這種抗生素耐藥菌株的擴(kuò)散可能會引起更大的危害[11-12]。谷氨酸棒桿菌的表達(dá)質(zhì)粒中攜帶有抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記。通常在發(fā)酵過程中，為了維持菌株中質(zhì)粒的穩(wěn)定性和活性，需要在培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素。這不僅增加了抗生素抗性基因擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，還增加了生產(chǎn)成本[13]。alr基因編碼丙氨酸消旋酶，參與催化將L-丙氨酸轉(zhuǎn)化為D-丙氨酸的反應(yīng)，D-丙氨酸為谷氨酸棒桿菌中細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)及前體合成的必需物質(zhì)[14-15]。在谷氨酸棒桿菌中敲除alr后，菌株自身沒有其他途徑進(jìn)行回補(bǔ)，所以在培養(yǎng)基上表現(xiàn)為穩(wěn)定的營養(yǎng)缺陷型菌株。隨后通過在表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)alr基因?qū)η贸赀M(jìn)行回補(bǔ)，就能使質(zhì)粒在不添加抗生素的情況下仍能穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中。

為了提高4-HIL的產(chǎn)量以及減少抗生素在發(fā)酵過程中的使用，首先在谷氨酸棒桿菌SN01中敲除丙氨酸消旋酶基因alr，并使用質(zhì)粒pJYW4-ido來回補(bǔ)alr基因并表達(dá)異亮氨酸雙加氧酶IDO，該方法有效地減少了發(fā)酵過程中抗生素的使用，成功地使谷氨酸棒桿菌菌株正常生長并且生產(chǎn)4-HIL。在SN01Δalr菌株中轉(zhuǎn)入pJYW4-ido-lysC-ido3質(zhì)粒后，從接種時的種子活力、溶氧水平的調(diào)整和補(bǔ)料等方面進(jìn)行上罐水平的優(yōu)化，從而提高4-HIL的上罐產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本課題所構(gòu)建的菌株如表1所示。

表1 本課題所用菌株
Table 1 Strains used in this study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

七水合硫酸亞鐵、氯化鈉、氨水、硫酸銨,中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨，英國OXOID公司；發(fā)酵培養(yǎng)基所使用的阿拉丁玉米漿，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸吡哆醛、甜菜堿，美國TEDIA公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件

谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過程中種子培養(yǎng)基(g/L)：固體玉米漿40、磷酸二氫鉀1、硫酸氨0.5、尿素1.25、葡萄糖25、硫酸鎂0.5。固體玉米漿使用前攪拌混勻，培養(yǎng)基定容后，pH約為3.8，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH 7.2。121 ℃，15 min條件滅菌。

上罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，硫酸氨20，玉米漿15，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂0.75，酵母粉3，維生素B1 1.0×10-3，甜菜堿1.5×10-3，七水合硫酸亞鐵1.1。用氫氧化鉀調(diào)節(jié)至pH 7.2，滅菌條件115 ℃，15 min。

培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌抗生素添加量：氯霉素10 μg/mL，卡那霉素30 μg/mL。

谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)條件：自動往復(fù)式搖床30 ℃，200 r/min。

敲除alr基因的重組菌株在發(fā)酵過程中無需向培養(yǎng)基中添加抗生素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 alr基因敲除菌株及發(fā)酵菌株的構(gòu)建

alr基因的敲除按照胡瑾瑜[16]所構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌基因敲除方法進(jìn)行。隨后在SN01Δalr中使用電轉(zhuǎn)的方法分別轉(zhuǎn)入pJYW4-ido以及pJYW4-ido-lysC-ido3質(zhì)粒，構(gòu)建出了Δalr/p4-ido和Δalr-ILI3菌株。這兩個質(zhì)粒所用的載體pJYW-4上攜帶有alr基因表達(dá)框[17]。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌上罐發(fā)酵

谷氨酸棒桿菌上罐發(fā)酵具體步驟如下，使用迪必爾生物公司2 L四連罐：

(1)活化菌株：將保存于-80 ℃冰箱中的菌株涂布于LBB固體培養(yǎng)基平板上活化48 h。

(2)種子培養(yǎng)；將平板上已經(jīng)活化好菌苔接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL發(fā)酵搖瓶中，在往復(fù)式搖床中30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至上罐所需要的種子濃度。

(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將生長至對數(shù)期的種子液接種于滅菌完成的發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵罐上的菌株培養(yǎng)，一個發(fā)酵周期為96 h。

發(fā)酵過程中pH調(diào)節(jié)試劑：體積分?jǐn)?shù)為25%的氨水。

發(fā)酵過程補(bǔ)料試劑：800 g/L葡萄糖。當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)葡萄糖質(zhì)量濃度低于20 g/L時，將葡萄糖補(bǔ)加到30 g/L。

1.2.3 發(fā)酵參數(shù)測定

發(fā)酵過程中每4 h取1次樣，測量OD562值、殘?zhí)呛桶被岷俊?/p>

OD562值：將樣品稀釋一定倍數(shù)，用紫外分光光度計(jì)在562 nm處進(jìn)行OD值的測量。

殘?zhí)牵簩l(fā)酵樣品用離心機(jī)12 000 r/min，15 min離心，減少大分子物質(zhì)對還原糖測定儀的損傷，取10 μL 的發(fā)酵上清液用ddH2O稀釋100倍后，再使用生物傳感儀SBA40測定殘留葡萄糖數(shù)值濃度。

氨基酸含量測定：將發(fā)酵液樣品進(jìn)行預(yù)處理并稀釋一定倍數(shù)后使用高效液相色譜測定樣品中的氨基酸含量。首先進(jìn)行各個氨基酸標(biāo)樣的液相測定，確定各個氨基酸的出峰時間和峰面積，然后進(jìn)行發(fā)酵樣品的液相測定，將某種氨基酸樣品的峰面積和標(biāo)樣中該氨基酸的峰面積進(jìn)行比值再乘以稀釋倍數(shù)，從而計(jì)算出該種氨基酸在樣品中的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除alr對4-HIL發(fā)酵的影響

alr作為一種替代抗生素的選擇標(biāo)記，其實(shí)用性已在其他谷氨酸棒桿菌中得到驗(yàn)證[17-18]。從實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性以及敲除alr之后的發(fā)酵效果考慮，有必要驗(yàn)證在SN01中敲除alr后菌株受到的影響，以及質(zhì)粒所攜帶的alr能否回補(bǔ)alr敲除菌體的D-丙氨酸營養(yǎng)缺陷。

2.1.1 alr敲除對菌株生長的影響

在alr基因敲除菌株基礎(chǔ)上過表達(dá)ido基因，得到重組菌株Δalr/p4-ido，該菌株的質(zhì)粒上同時攜帶了alr基因表達(dá)框。在不添加卡那霉素的情況下，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵144 h后，菌株Δalr/p4-ido的生長和糖耗情況如圖1所示。以攜帶pJYW4-ido質(zhì)粒的野生菌SN02在添加卡那霉素時的發(fā)酵作為對照。

a-生長變化；b-殘?zhí)亲兓?br/>圖1 SN02和alr敲除菌株Δalr/p4-ido發(fā)酵過程中 生長和殘?zhí)亲兓?br/>Fig.1 Cell growth and residual glucose of SN02 and alr-deleting strain Δalr/p4-ido during the fermentation

在整個發(fā)酵周期中，菌株Δalr/p4-ido與對照菌株SN02保持相似的生長趨勢。而且在96 h之前，Δalr/p4-ido 菌株的生長速率略微高于對照菌株，最終兩者的生物量幾乎相同，OD562值都在115左右。生長速率的變化說明敲除alr基因并沒有影響菌株的生長。在耗糖能力方面，SN02和Δalr/p4-ido在0～72 h耗糖速率幾乎相同，在72 h時都能將葡萄糖耗盡，該結(jié)果說明，敲除了alr基因后，通過質(zhì)粒pJYW4-ido回補(bǔ)alr基因并沒有阻礙菌株的生長狀況，菌株的耗糖能力也沒有減弱。在產(chǎn)量方面，菌株Δalr/p4-ido發(fā)酵144 h后的4-HIL產(chǎn)量為152.59 mmol/L，對照菌株SN02的4-HIL產(chǎn)量為147.79 mmol/L，產(chǎn)量無明顯波動，說明該方法對4-HIL的生產(chǎn)無明顯不良影響。

2.1.2 alr回補(bǔ)替代抗生素使用的效果

隨后驗(yàn)證alr敲除之后，通過轉(zhuǎn)入攜帶alr基因的質(zhì)粒pJYW4-ido進(jìn)行回補(bǔ)是否能夠不用添加卡那霉素就保持質(zhì)粒穩(wěn)定存在，從而有效地替代發(fā)酵過程中抗生素的使用。取正常發(fā)酵144 h后菌株Δalr/p4-ido先稀釋至OD562值為1，然后再稀釋一定倍數(shù)后分別涂布于含有或不含有卡那霉素的平板，觀察兩種平板上菌落生長的情況，結(jié)果如表2所示。

表2 alr敲除菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性
Table 2 Plasmid stability of alr knockout bacteria

從表2中可以看出，alr敲除后的回補(bǔ)菌株Δalr/p4-ido在含有抗生素的平板上長出的菌落數(shù)(這些菌株中質(zhì)粒存在)幾乎接近于在不含有抗生素的平板上長出的菌落數(shù)(包括質(zhì)粒存在的菌株和質(zhì)粒丟失的菌株)，說明在谷氨酸棒桿菌的144 h的發(fā)酵周期內(nèi)，alr敲除回補(bǔ)菌中的質(zhì)粒能夠穩(wěn)定存在，可以使用alr敲除菌株并使用攜帶alr基因的質(zhì)粒進(jìn)行回補(bǔ)，以此代替抗生素的使用來維持質(zhì)粒穩(wěn)定存在。

2.2 上罐水平上的發(fā)酵條件優(yōu)化

在構(gòu)建SN01Δalr的基礎(chǔ)上使用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入pJYW4-ido-lysC-ido3質(zhì)粒，構(gòu)建出了Δalr-ILI3菌株。對該菌株進(jìn)行上罐條件的優(yōu)化。

2.2.1 菌株Δalr-ILI3種子生長時間對發(fā)酵生產(chǎn)4-HIL的影響

針對種子活力，主要通過選擇不同的種子生長時間進(jìn)行接種。以Δalr-ILI3為發(fā)酵菌株，分別選16、18、18.5、19.5、21 h的種子生長時間進(jìn)行接種，上罐發(fā)酵的結(jié)果如圖2和圖3所示。

a-生長情況；b-耗糖情況
圖2 菌株Δalr-ILI3不同種子活力時上罐發(fā)酵的生長和耗糖
Fig.2 Fermentation of strain Δalr-ILI3 with different seed cultivation time in 2 L fermenters

圖3 種子培養(yǎng)18 h上罐發(fā)酵的氨基酸產(chǎn)量
Fig.3 The amino acid production of strain Δalr-ILI3 with 18 h seed cultivation time in a 2 L fermenter

從圖2可以看出，在只變動種子生長時間的條件下，生長狀況和4-HIL產(chǎn)量顯著不同。當(dāng)種子生長時間為18 h時菌株在發(fā)酵罐上的生長最好。種子生長時間為16 h的菌株延滯期過長，生長速率緩慢，最終沒有完全生長起來。而種子生長時間為18.5、19.5、21 h的種子液活力完全不足，在菌株還沒有生長起來的時候就進(jìn)入了衰亡期，最終也沒有4-HIL產(chǎn)量。在測定菌株Δalr-ILI3的生長曲線時發(fā)現(xiàn)：種子液培養(yǎng)18 h已經(jīng)是對數(shù)期后期了，過早接種會使菌株的延滯期變長，超過18 h接種也會降低菌株的活力。從圖3中可以看出，正常生長起來的菌株發(fā)酵16 h之后，當(dāng)菌株的OD562值超過50之后，開始積累4-HIL。在48 h進(jìn)入穩(wěn)定期，OD562值在145左右進(jìn)行波動。在48 h之前，4-HIL的產(chǎn)量只是在緩緩積累，主要能量還是提供給菌株的生長和Ile的積累，在48 h時4-HIL和Ile的產(chǎn)量分別34.69、113.74 mmol/L。當(dāng)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期之后，4-HIL的積累速度加快，分別在48～72 h以及84～96 h，4-HIL積累的速度最快。最終4-HIL的產(chǎn)量為242.18 mmol/L，Ile剩余47.33 mmol/L。L-異亮氨酸在發(fā)酵進(jìn)行至96 h還有剩余，說明在發(fā)酵過程中IDO的活性不足以在短時間內(nèi)將全部的Ile轉(zhuǎn)化為4-HIL，所以后續(xù)將以增加IDO活性為目的進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 菌株Δalr-ILI3溶氧水平改變對發(fā)酵生產(chǎn)4-HIL的影響

為了提高菌株Δalr-ILI3的生產(chǎn)效率，需要加強(qiáng)其IDO的活性。IDO是一種雙加氧酶，它催化的反應(yīng)會消耗O2并產(chǎn)生CO2，有研究表明進(jìn)行兩階段溶氧的調(diào)節(jié)有助于4-HIL生產(chǎn)水平的提高[19]。在發(fā)酵進(jìn)入到中期時，菌株在合成4-HIL時，需要消耗大量的O2，為了使反應(yīng)正常進(jìn)行，需要在4-HIL積累過程中提高發(fā)酵罐中的O2供給量，使反應(yīng)能夠順利進(jìn)行。針對Δalr-ILI3菌株的發(fā)酵情況：在發(fā)酵早期，較低的溶氧值會使菌株的生長變得緩慢，不利于Ile的積累和4-HIL的生產(chǎn)，而過高的溶氧值會使得菌株隨著氣泡附著在液面之上的發(fā)酵罐壁上，嚴(yán)重影響菌株的生長。所以在發(fā)酵初期選擇20%溶氧，以便使菌株能夠正常生長并且不會使大量菌株附著在發(fā)酵罐壁上。在發(fā)酵中期，隨著菌株生物量生長至OD562值超過50以后，逐漸開始積累4-HIL，這時產(chǎn)生大量氣泡。此時如果溶氧值不夠會阻礙4-HIL的積累，溶氧值過高會發(fā)生噴罐。當(dāng)溶氧值上升至35%時，氣泡已經(jīng)升至發(fā)酵罐頂層，所以為了提高試驗(yàn)的成功率和4-HIL產(chǎn)量，選擇30%為提升后的溶氧值。綜上所述，實(shí)驗(yàn)以Δalr-ILI3為發(fā)酵菌株，在菌株OD562值達(dá)到50以上時，將設(shè)定的溶氧值由20%提高至30%，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。

a-菌株生長和殘?zhí)乔闆r；b-菌株氨基酸產(chǎn)量
圖4 菌株Δalr-ILI3溶氧調(diào)節(jié)時上罐發(fā)酵的 生長和殘?zhí)且约鞍被岙a(chǎn)量
Fig.4 Fermentation of strain Δalr-ILI3 with adjusted dissolved oxygen in 2 L fermenters

從圖4可以看出，在溶氧改變之后，菌株的生長速率相較于圖2的溶氧值恒定的菌株基本沒有變化，發(fā)酵結(jié)束時，OD562值為148.45，最終生物量也沒有提高。發(fā)酵96 h時，4-HIL產(chǎn)量達(dá)到269.20 mmol/L，相較于未優(yōu)化前，4-HIL產(chǎn)量提高了11.2%。Ile產(chǎn)量在發(fā)酵終點(diǎn)有42.18 mmol/L，雖然還是有較多的Ile沒有轉(zhuǎn)化成4-HIL，但是根據(jù)4-HIL產(chǎn)量可以說明，溶氧值的提高有助于Ile向4-HIL的轉(zhuǎn)化。

2.2.3 菌株Δalr-ILI3補(bǔ)料改變對發(fā)酵生產(chǎn)4-HIL的影響

在上罐發(fā)酵過程中，之前的補(bǔ)料都是添加單一的葡萄糖濃縮液，為了進(jìn)一步增加上罐發(fā)酵過程中菌株的活力，使用初始培養(yǎng)基中的葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、酵母粉、維生素B1、甜菜堿組成混合溶液，配成8倍濃縮液進(jìn)行補(bǔ)料。發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

a-生長和殘?zhí)?；b-氨基酸產(chǎn)量
圖5 菌株Δalr-ILI3補(bǔ)料調(diào)節(jié)時上罐發(fā)酵的生長和 殘?zhí)且约鞍被岙a(chǎn)量
Fig.5 Fermentation of strain Δalr-ILI3 when changing feed supplement in 2 L fermenters

從圖5可以看出，在改變補(bǔ)料后，菌株的生物量總量有了增長，最大OD562值可達(dá)到167.3。發(fā)酵96 h時，4-HIL的產(chǎn)量可達(dá)到324.72 mmol/L，相較于未用該方法優(yōu)化前，產(chǎn)量又提高了20.6%，相比于2.2.1產(chǎn)量則提高了34.1%，并且Ile的產(chǎn)量也有了提高。這也是目前報(bào)道的由葡萄糖從頭合成4-HIL的最高產(chǎn)量。根據(jù)4-HIL產(chǎn)量可以說明，在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)4-HIL的上罐過程中不僅僅補(bǔ)加葡萄糖溶液，也補(bǔ)加微生物發(fā)酵所需的其他成分可以增加4-HIL的產(chǎn)量，延長菌株的活力。

3 結(jié)論

本研究為了提高谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)4-HIL的應(yīng)用能力和發(fā)酵水平，首先在菌株SN01中敲除丙氨酸消旋酶編碼基因alr，并向敲除菌中轉(zhuǎn)入表達(dá)alr基因和ido基因的質(zhì)粒進(jìn)行回補(bǔ)，回補(bǔ)菌株Δalr/p4-ido在生長速率和糖耗方面和未敲除菌株基本相同，且在發(fā)酵時無需添加抗生素就可以維持質(zhì)粒穩(wěn)定存在和4-HIL合成，因此能夠代替抗生素作為篩選標(biāo)記。其次結(jié)合菌株發(fā)酵特點(diǎn)，進(jìn)行發(fā)酵罐上的發(fā)酵條件優(yōu)化。當(dāng)種子在種子培養(yǎng)基中生長到18 h，進(jìn)行接種，這時種子活力最高，能夠生產(chǎn)4-HIL 242.18 mmol/L，Ile 47.33 mmol/L；在菌株OD562值超過50時將發(fā)酵罐的溶氧值由20%調(diào)節(jié)為30%，這時4-HIL的產(chǎn)量可以達(dá)到269.20 mmol/L。最后調(diào)整了補(bǔ)料方法，進(jìn)行初始培養(yǎng)基濃縮液補(bǔ)料之后，4-HIL的產(chǎn)量達(dá)到了324.72 mmol/L，相比未優(yōu)化前提高了34.1%。此前，實(shí)驗(yàn)室TAN等通過對L-異亮氨酸生物傳感器Lrp-PbrnFE中的PbrnFE啟動子進(jìn)行改造和篩選，利用不同的PbrnFE啟動子動態(tài)調(diào)控ido的表達(dá)，同時動態(tài)調(diào)節(jié)α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)和氧氣的供應(yīng)，搖瓶上4-HIL產(chǎn)量達(dá)到最高，為(135.34±12.55) mmol/L[20]。張成林等[21]通過代謝工程改造增加了4-HIL原料的供應(yīng)，同時通過動態(tài)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)α-KG的動態(tài)供應(yīng)，成功地改善了4-HIL的合成。最終菌株HIL18搖瓶水平4-HIL產(chǎn)量為42.13 mmol/L，7.5 L罐發(fā)酵4-HIL產(chǎn)量達(dá)到232.38 mmol/L。之后通過發(fā)酵優(yōu)化使4-HIL的產(chǎn)量達(dá)到了263.27 mmol/L[19]。所以，本文章結(jié)果也是目前報(bào)道的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)4-HIL的最高產(chǎn)量。該方法為提高4-HIL的合成效率提供了參考。