三元共軛聚合物用于NIR-II熒光成像及光熱/光動力聯(lián)合治療

2,6-二(三甲基錫)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩購自賽樂新材料科技有限公司. 3,6-雙(5-溴噻吩-2-基)-2,5-雙(2-辛基十二烷基)-2,5-二氫吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮購自納凱科技有限公司. 3,8-二溴1,10菲羅啉和四三苯基膦鈀購自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司. 細胞實驗的所有材料均從南京凱基生物技術(shù)有限公司購買. 實驗中使用的溶劑等其他材料均為直接購買，無需進一步純化.

BDP合成路線如圖1所示. 將2,6-二(三甲基錫)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩(0.05 g，0.055 mmol)、3,?8-二溴1,10菲羅啉(0.0093 g，0.0276 mmol)、3,6-雙(5-溴噻吩?-2-基)-2,5-雙(2-辛基十二烷基)-2,5-二氫吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮(0.028 g，0.0276 mmol)和四三苯基膦鈀(20 mg)加入到Schlenk瓶(100 mL)中，抽真空鼓氮氣10 min. 加入10 mL無水甲苯作為溶劑，110 ℃反應(yīng)24 h，冷卻后用飽和食鹽水萃取，有機相旋干后用甲醇洗滌3次，抽濾烘干，得黑色固體粉末(產(chǎn)率73%)，在Ultra Shield Plus，Bruker 400 MHz NMR上表征獲得核磁共振氫譜，通過凝膠滲透色譜測定BDP分子量，儀器型號為Shim-pack GPC-80X型. 結(jié)構(gòu)表征見電子支持信息圖S1和S2.

  

Fig. 1  Schematic illustration of BDP preparation.

將BDP (1 mg)溶于THF (2 mL)中，然后將溶液快速加入到F127 (20 mg)的超純水溶液(8 mL)中，用超聲儀震蕩5 min. 鼓吹氮氣1 h以去除THF，過濾得到深綠色的BDP NPs水溶液.

BDP NPs的粒徑大小及形貌分別通過動態(tài)光散射儀(ALV/CGS-3，DLS)和HT-7700型透射電子顯微鏡(TEM)來測定. 將制備好的BDP NPs水溶液直接用于DLS表征. 而TEM樣品則是將BDP NPs水溶液滴至銅網(wǎng)，于通風櫥自然風干過夜后可用于測試. UV-Vis-NIR吸收光譜通過Shimadzu UV-3600 Plus型號儀器測得，近紅外二區(qū)熒光光譜通過型號為Horiba Fluorolog 3型熒光光譜儀獲得.

使用產(chǎn)自Estonia的FLIR E50型紅外熱成像相機測量BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換性能. 用730 nm激光(1 W/cm²)照射不同濃度的NPs. 此外，將150 μg/mL的NPs用不同功率密度的730 nm激光照射.

將DPBF的乙醇溶液(2×10^-5 mol/L)加入BDP NPs溶液中(1 mL，1×10^-5 mol/L)，用不同功率密度(0~0.75 W/cm²) 的730 nm激光照射樣品，利用UV-Vis-NIR 分光光度計測得其吸收光譜.

NIH3T3細胞和Hela細胞在DMEM培養(yǎng)基中孵育. MTT法用于評估BDP NPs對正常細胞NIH3T3和Hela細胞的生物毒性. 將NIH3T3或Hela細胞與不同濃度的NPs在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h然后測試暗毒性. 對于光毒性，Hela細胞在與NPs孵育后用730 nm激光(0.75 W/cm²)照射5 min. 然后加入MTT (20 μL，500 μg/mL)溶液共培養(yǎng). 去除含有MTT的培養(yǎng)基后，添加100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解MTT formazan晶體，然后使用微孔板讀取器(Bio-Rad Laboratories，Hercules)在490 nm波長下分析產(chǎn)物的吸光度. 本實驗采用Hela細胞進行活死細胞檢測，細胞培養(yǎng)方法參照上述方法. 將培養(yǎng)好的Hela細胞與鈣黃綠素共同孵育以標記活細胞，用細胞碘化丙啶(PI)標記死亡細胞10 min. 用倒置熒光顯微鏡記錄相關(guān)細胞圖像.

將配置好的BDP NPs水溶液(200 μL，2 mg/mL)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，在不同時間點采用近紅外二區(qū)熒光成像儀進行實時NIR-Ⅱ熒光成像，激發(fā)波長為808 nm，激光功率80 mW/cm²，濾光片為980 nm長通濾光片.

通過對BDP NPs進行TEM表征，可以確定BDP NPs的粒徑約為90 nm，與所測試得的DLS數(shù)據(jù)一致(圖2(a)). 此外，BDP NPs儲存5周后粒徑大小也無明顯變化，表明在水和PBS中具有出色的穩(wěn)定性(圖2(b)). 接下來對 BDP NPs的光學(xué)性質(zhì)進行研究.如紫外吸收/熒光發(fā)射光譜所示，所制備的納米顆粒主要吸收峰為735 nm，發(fā)射峰值在1039 nm，較BDP的四氫呋喃溶液有一定紅移(圖2(c)). 通過對BDP NPs進行光穩(wěn)定性測試，測試結(jié)果顯示，與FDA批準染料ICG相比，在730 nm激光照射(0.75 W/cm²，60 min)后，BDP NPs顯示出極好的光穩(wěn)定性(圖2(d)). 同時 BDP NPs具有較高的質(zhì)量消光系數(shù)(4.67 mL/mg/cm，電子支持信息圖S3)，表明該納米探針具有較強的近紅外光吸收能力. 此外，使用IR26染料的1,2,-二氯乙烷(DCE)溶液作為參考標準，測量了BDP NPs的NIR-II熒光量子產(chǎn)率(QY). 首先分別測試不同吸光度下，BDP NPs水溶液及IR26溶液的熒光光譜，并在900~1500 nm范圍內(nèi)積分計算相應(yīng)吸光度下的總發(fā)射強度(電子支持信息圖S4). 接著，繪制積分熒光強度與樣品吸光度的曲線，通過線性擬合求得2種物質(zhì)對應(yīng)曲線的斜率. 最后，利用公式(1)，計算得BDP NPs水溶液中的QY為0.62%.

  

Fig. 2  (a) DLS data and TEM image of BDP NPs; (b) Particle size stability of BDP NPs; (c) Absorption/fluorescence spectra of THF solution of BDP and BDP NPs; (d) Photo-stability of BDP NPs.

其中QY為對應(yīng)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，slope為相應(yīng)積分熒光強度-吸光度曲線的斜率，n為溶劑的折射率. 該數(shù)值能夠較好地滿足活體成像的需求. 綜上所述，BDP NPs具有出色的光學(xué)性質(zhì)，有利于生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用.

在730 nm激光照射下來測試BDP NPs的光熱性能. 如圖3(a)所示，BDP NPs溶液的溫度變化與激光功率密度成正比. 激光功率保持不變的情況下，BDP NPs溶液升到的最高溫度隨濃度的升高而升高(圖3(b)). 在激光的持續(xù)照射下，濃度為150 μg/mL的BDP NPs溶液的溫度從25 ℃升高至64 ℃. 相同條件下，水的溫度升高極少，這與紅外熱像儀的數(shù)據(jù)相對應(yīng)(圖3(c)). 通過730 nm激光照射BDP NPs溶液(光照/冷卻4次循環(huán))來評估其光熱穩(wěn)定性(圖3(d))，溶液上升到的最高溫度幾乎保持不變，說明BDP NPs在激光照射下有良好的光熱穩(wěn)定性. 接下來，按照文獻中的方法^[13]，測試 BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率. 經(jīng)計算，BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率約為18.2%.

  

Fig. 3  (a) The heating curves of BDP NPs under different power of 730 nm laser irradiation; (b) The heating curves of BDP NPs solution with different concentrations under 730 nm laser irradiation; (c) Infrared thermal images of centrifuge tubes with various concentrations of BDP NPs under laser irradiation; (d) Photothermal stability of BDP NPs.

隨后，進一步測試了納米粒子的光動力效果. 由于熒光探針DPBF可以與活性氧發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DPBF吸光度降低，因此本研究選用DPBF作為活性氧探針. 由圖4(a)~4(c)得知，隨著光照時間的增加，BDP NPs和DPBF的混合溶液在414 nm處的吸收度不斷降低，這表明在730 nm激光照射下BDP NPs可以產(chǎn)生大量活性氧. 此外，隨著激光功率的增加，DPBF探針降解趨勢增加(圖4(d))，表明可以通過控制激光功率實現(xiàn)BDP NPs活性氧的產(chǎn)生. 此外，為了排除干擾，對單獨激光照射進行了探究(圖4(e))，單獨激光照射8 min后也不會造成DPBF的降解，說明BDP NPs不存在的情況下不會產(chǎn)生活性氧. 然后在細胞層面對材料的活性氧產(chǎn)生能力進行測試. DCFH-DA探針能夠與活性氧反應(yīng)產(chǎn)生綠色熒光，因此選用DCFH-DA探針檢測納米粒子在細胞層面的活性氧產(chǎn)生. BDP NPs培育Hela細胞24 h后用激光照射，通過共聚焦成像觀察到細胞呈現(xiàn)綠色熒光且照射6 min時明顯比照射3 min時更強(圖5). 而沒有進行激光照射時，幾乎觀察不到綠色熒光，證實了BDP NPs在激光照射下可以在活細胞中產(chǎn)生活性氧. 以上所有數(shù)據(jù)證實: BDP NPs在激光照射下?lián)碛辛己玫墓鉄?光動力性能，可能對腫瘤具有優(yōu)異的聯(lián)合治療效果.

  

Fig. 4  Absorption spectra of BDP NPs and DPBF mixed aqueous solutions at different power densities (a) 0.50 W/cm²; (b) 0.75 W/cm² and (c) 1 W/cm² of 730 nm laser irradiation; (d) The intensity changes of the absorption peak of DPBF under irradiation with different powers; (e) Absorption spectra of DPBF solution treated with NIR laser (730 nm, 1 W/cm²).

  

Fig. 5  The detection of ROS in Hela cells.

利用MTT方法對BDP NPs的生物相容性進行測試. 將不同濃度的BDP NPs溶液與NIH3T3正常細胞共培養(yǎng)，考察NIH3T3正常細胞的生存率. 如圖6(a)所示，即使BDP NPs濃度達到125 μg/mL，NIH3T3正常細胞依然保持較好的生存率，表明該納米粒子具有優(yōu)異的生物相容性. 隨后進一步對BDP NPs對癌細胞的細胞毒性進行測試. 首先用不同濃度的BDP NPs溶液與兩組Hela細胞共培養(yǎng)24 h后，然后一組Hela細胞用730 nm激光照射(730 nm，1 W/cm²)，另一組Hela細胞不進行光照，繼續(xù)孵育后加入MTT溶液和DMSO，最后通過酶標儀確定癌細胞生存率. 如圖6(b)所示，在沒有730 nm激光照射的情況下，BDP NPs對Hela細胞沒有明顯的毒副作用. 而在730 nm激光照射后Hela細胞生存率明顯降低，表明BDP NPs具有明顯的光毒性，這歸因于PTT/PDT的聯(lián)合治療功效. 接下來通過活/死細胞測試BDP NPs(濃度為125 μg/mL)的治療效果，鈣黃綠素AM是一種細胞活性染料，能夠染色活細胞產(chǎn)生綠色熒光，碘化丙啶PI能夠染色死細胞，使其發(fā)出紅色熒光. Hela細胞活/死分析的結(jié)論表明，BDP NPs具有較好的光療效果(圖6(c)). 以上實驗結(jié)果表明，BDP NPs在激光照射下可以有效殺死癌細胞.

  

  

Fig. 6(a) Determination of the biocompatibility of BDP NPs to NIH3T3 normal cells; (b) Determination of the cytotoxicity of BDP NPs to Hela tumor cells with or without laser irradiation; (c) Live/dead cell staining analysis. The concentration of BDP NPs is 125 μg/mL.

利用Hela荷瘤小鼠對BDP NPs的NIR-II熒光成像性能進行測試. 在通過小鼠尾靜脈注射BDP NPs 10 min后，使用NIR-II熒光成像儀對小鼠進行成像，如圖7(a)所示，注射10 min時可以清晰地觀察到小鼠全身血管，且圖像具有較高的成像質(zhì)量和分辨率. NPs注射進體內(nèi)后，小鼠腫瘤部位熒光強度隨時間逐漸增強，并在注射12 h后達到最大值，隨后強度有所下降. 24 h后，還能清楚地觀察到腫瘤組織，表明BDP NPs在體內(nèi)具有較長時間的成像能力(圖7(a)和7(b)). 最后通過NIR-II熒光成像研究了BDP NPs在離體的器官和腫瘤中的分布，如圖7(c)和7(d)所示，BDP NPs主要富集在肝、脾和腫瘤處. 這些實驗現(xiàn)象表明，BDP NPs具有較好的活體NIR-II熒光成像能力. 成像實驗結(jié)束后對主要離體器官進行了切片，并用H&E染色. 實驗結(jié)果如圖8所示，在這些組織中未檢測到明顯病變，表明BDP NPs在體內(nèi)無明顯的毒性. 在熒光成像的測試中發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾動脈注射12 h后 NPs在腫瘤部位富集程度達到最高值，這為腫瘤的光療提供了最佳治療時間. 為了探索BDP NPs在體內(nèi)進行NIR-II光療的可行性，將荷瘤鼠分為2組通過尾靜脈注射不同的制劑：(a) PBS，(b) BDP NPs，12 h后進行近紅外激光照射(730 nm，1 W/cm²) 實驗. 如電子支持信息圖S5所示，注射BDP NPs的小鼠腫瘤部位溫度顯著升高，并迅速達到55 ℃ 以上，該溫度足以殺死腫瘤細胞. 相比之下，只注射PBS的小鼠腫瘤部位在照射8 min后溫度無顯著變化. 該實驗結(jié)果證明了BDP NPs有能力實現(xiàn)NIR-II成像引導(dǎo)的光療.

  

Fig. 7  (a) NIR-II fluorescence images of BDP NPs; (b) NIR-II fluorescence intensity of tumor; (c) Fluorescence intensity of isolated organs; (d) Semi-quantitative analysis of isolated organs.

  

Fig. 8  Staining of major tissues after different treatments.