三元共軛聚合物用于NIR-II熒光成像及光熱/光動(dòng)力聯(lián)合治療

2,6-二(三甲基錫)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩購(gòu)自賽樂新材料科技有限公司. 3,6-雙(5-溴噻吩-2-基)-2,5-雙(2-辛基十二烷基)-2,5-二氫吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮購(gòu)自納凱科技有限公司. 3,8-二溴1,10菲羅啉和四三苯基膦鈀購(gòu)自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的所有材料均從南京凱基生物技術(shù)有限公司購(gòu)買. 實(shí)驗(yàn)中使用的溶劑等其他材料均為直接購(gòu)買，無需進(jìn)一步純化.

BDP合成路線如圖1所示. 將2,6-二(三甲基錫)-4,8-二(5-(2-乙基己基)噻吩基-2-)-苯并二噻吩(0.05 g，0.055 mmol)、3,?8-二溴1,10菲羅啉(0.0093 g，0.0276 mmol)、3,6-雙(5-溴噻吩?-2-基)-2,5-雙(2-辛基十二烷基)-2,5-二氫吡咯并[3,4-c]吡咯-1,4-二酮(0.028 g，0.0276 mmol)和四三苯基膦鈀(20 mg)加入到Schlenk瓶(100 mL)中，抽真空鼓氮?dú)?0 min. 加入10 mL無水甲苯作為溶劑，110 ℃反應(yīng)24 h，冷卻后用飽和食鹽水萃取，有機(jī)相旋干后用甲醇洗滌3次，抽濾烘干，得黑色固體粉末(產(chǎn)率73%)，在Ultra Shield Plus，Bruker 400 MHz NMR上表征獲得核磁共振氫譜，通過凝膠滲透色譜測(cè)定BDP分子量，儀器型號(hào)為Shim-pack GPC-80X型. 結(jié)構(gòu)表征見電子支持信息圖S1和S2.

  

Fig. 1  Schematic illustration of BDP preparation.

將BDP (1 mg)溶于THF (2 mL)中，然后將溶液快速加入到F127 (20 mg)的超純水溶液(8 mL)中，用超聲儀震蕩5 min. 鼓吹氮?dú)? h以去除THF，過濾得到深綠色的BDP NPs水溶液.

BDP NPs的粒徑大小及形貌分別通過動(dòng)態(tài)光散射儀(ALV/CGS-3，DLS)和HT-7700型透射電子顯微鏡(TEM)來測(cè)定. 將制備好的BDP NPs水溶液直接用于DLS表征. 而TEM樣品則是將BDP NPs水溶液滴至銅網(wǎng)，于通風(fēng)櫥自然風(fēng)干過夜后可用于測(cè)試. UV-Vis-NIR吸收光譜通過Shimadzu UV-3600 Plus型號(hào)儀器測(cè)得，近紅外二區(qū)熒光光譜通過型號(hào)為Horiba Fluorolog 3型熒光光譜儀獲得.

使用產(chǎn)自Estonia的FLIR E50型紅外熱成像相機(jī)測(cè)量BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換性能. 用730 nm激光(1 W/cm²)照射不同濃度的NPs. 此外，將150 μg/mL的NPs用不同功率密度的730 nm激光照射.

將DPBF的乙醇溶液(2×10^-5 mol/L)加入BDP NPs溶液中(1 mL，1×10^-5 mol/L)，用不同功率密度(0~0.75 W/cm²) 的730 nm激光照射樣品，利用UV-Vis-NIR 分光光度計(jì)測(cè)得其吸收光譜.

NIH3T3細(xì)胞和Hela細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中孵育. MTT法用于評(píng)估BDP NPs對(duì)正常細(xì)胞NIH3T3和Hela細(xì)胞的生物毒性. 將NIH3T3或Hela細(xì)胞與不同濃度的NPs在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h然后測(cè)試暗毒性. 對(duì)于光毒性，Hela細(xì)胞在與NPs孵育后用730 nm激光(0.75 W/cm²)照射5 min. 然后加入MTT (20 μL，500 μg/mL)溶液共培養(yǎng). 去除含有MTT的培養(yǎng)基后，添加100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解MTT formazan晶體，然后使用微孔板讀取器(Bio-Rad Laboratories，Hercules)在490 nm波長(zhǎng)下分析產(chǎn)物的吸光度. 本實(shí)驗(yàn)采用Hela細(xì)胞進(jìn)行活死細(xì)胞檢測(cè)，細(xì)胞培養(yǎng)方法參照上述方法. 將培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞與鈣黃綠素共同孵育以標(biāo)記活細(xì)胞，用細(xì)胞碘化丙啶(PI)標(biāo)記死亡細(xì)胞10 min. 用倒置熒光顯微鏡記錄相關(guān)細(xì)胞圖像.

將配置好的BDP NPs水溶液(200 μL，2 mg/mL)通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)采用近紅外二區(qū)熒光成像儀進(jìn)行實(shí)時(shí)NIR-Ⅱ熒光成像，激發(fā)波長(zhǎng)為808 nm，激光功率80 mW/cm²，濾光片為980 nm長(zhǎng)通濾光片.

通過對(duì)BDP NPs進(jìn)行TEM表征，可以確定BDP NPs的粒徑約為90 nm，與所測(cè)試得的DLS數(shù)據(jù)一致(圖2(a)). 此外，BDP NPs儲(chǔ)存5周后粒徑大小也無明顯變化，表明在水和PBS中具有出色的穩(wěn)定性(圖2(b)). 接下來對(duì) BDP NPs的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究.如紫外吸收/熒光發(fā)射光譜所示，所制備的納米顆粒主要吸收峰為735 nm，發(fā)射峰值在1039 nm，較BDP的四氫呋喃溶液有一定紅移(圖2(c)). 通過對(duì)BDP NPs進(jìn)行光穩(wěn)定性測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示，與FDA批準(zhǔn)染料ICG相比，在730 nm激光照射(0.75 W/cm²，60 min)后，BDP NPs顯示出極好的光穩(wěn)定性(圖2(d)). 同時(shí) BDP NPs具有較高的質(zhì)量消光系數(shù)(4.67 mL/mg/cm，電子支持信息圖S3)，表明該納米探針具有較強(qiáng)的近紅外光吸收能力. 此外，使用IR26染料的1,2,-二氯乙烷(DCE)溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)量了BDP NPs的NIR-II熒光量子產(chǎn)率(QY). 首先分別測(cè)試不同吸光度下，BDP NPs水溶液及IR26溶液的熒光光譜，并在900~1500 nm范圍內(nèi)積分計(jì)算相應(yīng)吸光度下的總發(fā)射強(qiáng)度(電子支持信息圖S4). 接著，繪制積分熒光強(qiáng)度與樣品吸光度的曲線，通過線性擬合求得2種物質(zhì)對(duì)應(yīng)曲線的斜率. 最后，利用公式(1)，計(jì)算得BDP NPs水溶液中的QY為0.62%.

  

Fig. 2  (a) DLS data and TEM image of BDP NPs; (b) Particle size stability of BDP NPs; (c) Absorption/fluorescence spectra of THF solution of BDP and BDP NPs; (d) Photo-stability of BDP NPs.

其中QY為對(duì)應(yīng)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，slope為相應(yīng)積分熒光強(qiáng)度-吸光度曲線的斜率，n為溶劑的折射率. 該數(shù)值能夠較好地滿足活體成像的需求. 綜上所述，BDP NPs具有出色的光學(xué)性質(zhì)，有利于生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用.

在730 nm激光照射下來測(cè)試BDP NPs的光熱性能. 如圖3(a)所示，BDP NPs溶液的溫度變化與激光功率密度成正比. 激光功率保持不變的情況下，BDP NPs溶液升到的最高溫度隨濃度的升高而升高(圖3(b)). 在激光的持續(xù)照射下，濃度為150 μg/mL的BDP NPs溶液的溫度從25 ℃升高至64 ℃. 相同條件下，水的溫度升高極少，這與紅外熱像儀的數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)(圖3(c)). 通過730 nm激光照射BDP NPs溶液(光照/冷卻4次循環(huán))來評(píng)估其光熱穩(wěn)定性(圖3(d))，溶液上升到的最高溫度幾乎保持不變，說明BDP NPs在激光照射下有良好的光熱穩(wěn)定性. 接下來，按照文獻(xiàn)中的方法^[13]，測(cè)試 BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率. 經(jīng)計(jì)算，BDP NPs的光熱轉(zhuǎn)換效率約為18.2%.

  

Fig. 3  (a) The heating curves of BDP NPs under different power of 730 nm laser irradiation; (b) The heating curves of BDP NPs solution with different concentrations under 730 nm laser irradiation; (c) Infrared thermal images of centrifuge tubes with various concentrations of BDP NPs under laser irradiation; (d) Photothermal stability of BDP NPs.

隨后，進(jìn)一步測(cè)試了納米粒子的光動(dòng)力效果. 由于熒光探針DPBF可以與活性氧發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DPBF吸光度降低，因此本研究選用DPBF作為活性氧探針. 由圖4(a)~4(c)得知，隨著光照時(shí)間的增加，BDP NPs和DPBF的混合溶液在414 nm處的吸收度不斷降低，這表明在730 nm激光照射下BDP NPs可以產(chǎn)生大量活性氧. 此外，隨著激光功率的增加，DPBF探針降解趨勢(shì)增加(圖4(d))，表明可以通過控制激光功率實(shí)現(xiàn)BDP NPs活性氧的產(chǎn)生. 此外，為了排除干擾，對(duì)單獨(dú)激光照射進(jìn)行了探究(圖4(e))，單獨(dú)激光照射8 min后也不會(huì)造成DPBF的降解，說明BDP NPs不存在的情況下不會(huì)產(chǎn)生活性氧. 然后在細(xì)胞層面對(duì)材料的活性氧產(chǎn)生能力進(jìn)行測(cè)試. DCFH-DA探針能夠與活性氧反應(yīng)產(chǎn)生綠色熒光，因此選用DCFH-DA探針檢測(cè)納米粒子在細(xì)胞層面的活性氧產(chǎn)生. BDP NPs培育Hela細(xì)胞24 h后用激光照射，通過共聚焦成像觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光且照射6 min時(shí)明顯比照射3 min時(shí)更強(qiáng)(圖5). 而沒有進(jìn)行激光照射時(shí)，幾乎觀察不到綠色熒光，證實(shí)了BDP NPs在激光照射下可以在活細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧. 以上所有數(shù)據(jù)證實(shí): BDP NPs在激光照射下?lián)碛辛己玫墓鉄?光動(dòng)力性能，可能對(duì)腫瘤具有優(yōu)異的聯(lián)合治療效果.

  

Fig. 4  Absorption spectra of BDP NPs and DPBF mixed aqueous solutions at different power densities (a) 0.50 W/cm²; (b) 0.75 W/cm² and (c) 1 W/cm² of 730 nm laser irradiation; (d) The intensity changes of the absorption peak of DPBF under irradiation with different powers; (e) Absorption spectra of DPBF solution treated with NIR laser (730 nm, 1 W/cm²).

  

Fig. 5  The detection of ROS in Hela cells.

利用MTT方法對(duì)BDP NPs的生物相容性進(jìn)行測(cè)試. 將不同濃度的BDP NPs溶液與NIH3T3正常細(xì)胞共培養(yǎng)，考察NIH3T3正常細(xì)胞的生存率. 如圖6(a)所示，即使BDP NPs濃度達(dá)到125 μg/mL，NIH3T3正常細(xì)胞依然保持較好的生存率，表明該納米粒子具有優(yōu)異的生物相容性. 隨后進(jìn)一步對(duì)BDP NPs對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試. 首先用不同濃度的BDP NPs溶液與兩組Hela細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，然后一組Hela細(xì)胞用730 nm激光照射(730 nm，1 W/cm²)，另一組Hela細(xì)胞不進(jìn)行光照，繼續(xù)孵育后加入MTT溶液和DMSO，最后通過酶標(biāo)儀確定癌細(xì)胞生存率. 如圖6(b)所示，在沒有730 nm激光照射的情況下，BDP NPs對(duì)Hela細(xì)胞沒有明顯的毒副作用. 而在730 nm激光照射后Hela細(xì)胞生存率明顯降低，表明BDP NPs具有明顯的光毒性，這歸因于PTT/PDT的聯(lián)合治療功效. 接下來通過活/死細(xì)胞測(cè)試BDP NPs(濃度為125 μg/mL)的治療效果，鈣黃綠素AM是一種細(xì)胞活性染料，能夠染色活細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光，碘化丙啶PI能夠染色死細(xì)胞，使其發(fā)出紅色熒光. Hela細(xì)胞活/死分析的結(jié)論表明，BDP NPs具有較好的光療效果(圖6(c)). 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BDP NPs在激光照射下可以有效殺死癌細(xì)胞.

  

  

Fig. 6(a) Determination of the biocompatibility of BDP NPs to NIH3T3 normal cells; (b) Determination of the cytotoxicity of BDP NPs to Hela tumor cells with or without laser irradiation; (c) Live/dead cell staining analysis. The concentration of BDP NPs is 125 μg/mL.

利用Hela荷瘤小鼠對(duì)BDP NPs的NIR-II熒光成像性能進(jìn)行測(cè)試. 在通過小鼠尾靜脈注射BDP NPs 10 min后，使用NIR-II熒光成像儀對(duì)小鼠進(jìn)行成像，如圖7(a)所示，注射10 min時(shí)可以清晰地觀察到小鼠全身血管，且圖像具有較高的成像質(zhì)量和分辨率. NPs注射進(jìn)體內(nèi)后，小鼠腫瘤部位熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，并在注射12 h后達(dá)到最大值，隨后強(qiáng)度有所下降. 24 h后，還能清楚地觀察到腫瘤組織，表明BDP NPs在體內(nèi)具有較長(zhǎng)時(shí)間的成像能力(圖7(a)和7(b)). 最后通過NIR-II熒光成像研究了BDP NPs在離體的器官和腫瘤中的分布，如圖7(c)和7(d)所示，BDP NPs主要富集在肝、脾和腫瘤處. 這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，BDP NPs具有較好的活體NIR-II熒光成像能力. 成像實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)主要離體器官進(jìn)行了切片，并用H&E染色. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，在這些組織中未檢測(cè)到明顯病變，表明BDP NPs在體內(nèi)無明顯的毒性. 在熒光成像的測(cè)試中發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾動(dòng)脈注射12 h后 NPs在腫瘤部位富集程度達(dá)到最高值，這為腫瘤的光療提供了最佳治療時(shí)間. 為了探索BDP NPs在體內(nèi)進(jìn)行NIR-II光療的可行性，將荷瘤鼠分為2組通過尾靜脈注射不同的制劑：(a) PBS，(b) BDP NPs，12 h后進(jìn)行近紅外激光照射(730 nm，1 W/cm²) 實(shí)驗(yàn). 如電子支持信息圖S5所示，注射BDP NPs的小鼠腫瘤部位溫度顯著升高，并迅速達(dá)到55 ℃ 以上，該溫度足以殺死腫瘤細(xì)胞. 相比之下，只注射PBS的小鼠腫瘤部位在照射8 min后溫度無顯著變化. 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了BDP NPs有能力實(shí)現(xiàn)NIR-II成像引導(dǎo)的光療.

  

Fig. 7  (a) NIR-II fluorescence images of BDP NPs; (b) NIR-II fluorescence intensity of tumor; (c) Fluorescence intensity of isolated organs; (d) Semi-quantitative analysis of isolated organs.

  

Fig. 8  Staining of major tissues after different treatments.