基于代謝組學(xué)分析黑老虎果實(shí)營養(yǎng)成分及不同部位富集差異

黑老虎(Kadsura coccinea Lem.)又名冷飯團(tuán)、布福娜、大葉五味子等，為多年生常綠木質(zhì)藤本，南五味子屬五味子科植物，分布于貴州、廣西、云南等地。其根俗稱大血藤，有較多藥用功效，是一種重要的中藥材[1-2]，在民間用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性腸胃炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打腫痛、痛經(jīng)等；其還具有抗腫瘤、抗HIV、抗炎、保肝、抗氧化等活性作用[3-6]，從而受到廣泛關(guān)注。黑老虎果實(shí)為集合果，單果重50～580 g，由30～70個小漿果聚合而成，表面似足球，成熟時呈粉紅、紫紅、紅綠和青綠等多種顏色；果肉似荔枝、口味獨(dú)特；每個小漿果含2～3粒種子，千粒種重(213.01±2.30) g。黑老虎果實(shí)在貴州黔東南、湖南通道縣等少數(shù)民族地區(qū)被當(dāng)作珍稀野生水果，初步研究顯示其具有較高營養(yǎng)與保健價值[7-9]。近年來黑老虎果實(shí)因果實(shí)外觀奇特、色澤艷麗，一度供不應(yīng)求[10]，不斷被種植。但其可食率較低(30%～52%)、果皮較厚(占果重的32%～50%)、種子多(100～210粒，占7%～15%)，果肉和種子不易分離[8,11]，不耐貯運(yùn)等嚴(yán)重制約著更進(jìn)一步發(fā)展。對果實(shí)和果實(shí)副產(chǎn)物(果皮和種子)進(jìn)行精深加工利用已成為解決其瓶頸的途徑之一[8,10-12]。

前期在黑老虎果肉和果皮中檢出20種氨基酸[8-9,13]。籽中含8種飽和脂肪酸(葵酸、月桂酸、豆蔻酸等)和4種不飽和脂肪酸(棕櫚油酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸)[14]。果肉中維生素C、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖等常規(guī)營養(yǎng)成分及鈣、鐵、鋅、鎂等微量元素中多個指標(biāo)優(yōu)于龍眼、草莓、荔枝等[9,15]。進(jìn)一步表明了黑老虎果實(shí)是一種極具開發(fā)前景的新型水果，基于代謝組學(xué)分析營養(yǎng)成分還鮮有報道。代謝組學(xué)是生物組學(xué)中新發(fā)展起來的一門重要學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[16-17]，其通過高通量化學(xué)分析技術(shù)對生物樣品中代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析。以黑老虎果實(shí)為材料，利用廣泛靶向代謝組學(xué)方法，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)技術(shù)，高通量、高靈敏、廣覆蓋檢測果肉、果皮和種子中的代謝物，解析其中的營養(yǎng)成分，分析不同部位富集格局，旨在闡明果皮和種子中可能功能與果肉類似或高度富集的營養(yǎng)成分，挖掘其利用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和提取方法

試驗(yàn)所用黑老虎果實(shí)為人工培育的6年植株所結(jié)，栽植于覆蓋80%遮陽網(wǎng)的塑料大棚，位于貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)下壩鎮(zhèn)普渡村，定期管理、長勢良好。于2020年10月11日，隨機(jī)采摘數(shù)10株成熟果實(shí)，選果型端正的大果(質(zhì)量>250 g)作為樣品。果實(shí)經(jīng)自來水洗凈后純凈水沖洗3次，將其分開成小漿果，置于小板上、用手術(shù)刀剖開剝離出果肉、果皮，用砂布包裹揉搓種子使其干凈，分別裝入10 mL離心管中。編號為果肉KF1-3，果皮KP1-3和種子KD1-3；然后迅速置于液氮中，隨后干冰保存轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將超低溫冷凍保存的3組供試樣品放置于凍干機(jī)(Scientz-100F)中真空冷凍干燥，用研磨儀(MM 400，Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀；準(zhǔn)確稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇提取液中；每30 min渦旋1次，每次持續(xù)30 s，共渦旋6次，樣本置于4 ℃冰箱過夜；離心(12 000 r/min,10 min)后，吸取上清液，用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)(Applied Biosystems 4500 Q TRAP)分析。

1.2 色譜質(zhì)譜采集條件

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)(QTRAP)。

液相條件：色譜柱：Agilent SB-C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：水相，超純水(加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸)，乙腈(加入0.1%的甲酸)；洗脫梯度：0.00 min乙腈比例為5%，9.00 min內(nèi)乙腈比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min，10.00～11.10 min，乙腈比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量4 μL。

質(zhì)譜條件：在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(quadrupole-linear ion trap mass spectrometer，QTRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上完成線性離子阱(linear ion trap，LIT)和三重四極桿(triple quadrupole，QQQ)掃描。該系統(tǒng)配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運(yùn)行正負(fù)2種離子模式。ESI源操作參數(shù)如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓(ion spray，IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負(fù)離子模式)；離子源氣體(ion source gas I，GSI)，氣體II(GSII)和簾氣(curtain gas，CUR)分別設(shè)置為344.8、413.7和172.4 kPa，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體(N2)設(shè)置為中等。通過進(jìn)一步的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)優(yōu)化，完成了各個多反應(yīng)檢測模式(multi reaction monitor，MRM)離子對的DP和CE。根據(jù)每個時期內(nèi)洗脫的代謝物，在每個時期監(jiān)測一組特定的MRM離子對。

1.3 樣本質(zhì)控

質(zhì)控樣本由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每3個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于邁維生物公司(武漢)自建數(shù)據(jù)庫MWDB(metware database)和代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性(1：樣本物質(zhì)二級質(zhì)譜、RT與數(shù)據(jù)庫物質(zhì)核對一致；2：樣本物質(zhì)Q1、Q3、RT、DP、CE與數(shù)據(jù)庫物質(zhì)核對一致)，分析時去除了同位素信號，含的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子質(zhì)量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對代謝物定量分析。MRM模式中，四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子(母離子)，排除掉其他分子質(zhì)量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[18]。

根據(jù)正交偏最小二乘法判別模型(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)分析代謝組數(shù)據(jù)，繪制各分組的得分圖，進(jìn)一步展示各個樣本組之間的差異[19]。評價模型的預(yù)測參數(shù)有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測能力，這3個指標(biāo)越接近于1時表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2>0.5時可認(rèn)為是有效的模型，Q2>0.9時為出色的模型。基于OPLS-DA結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection, VIP)，初步篩選出不同組織間有差異的代謝物。同時結(jié)合單變量分析的P-value和差異倍數(shù)值(fold change)來進(jìn)一步篩選出差異代謝物(differentially accumulating metabolites, DAMs)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：選取fold change≥2和fold change≤0.5的代謝物；選取VIP≥1的代謝物，VIP值表示對應(yīng)代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強(qiáng)度，一般認(rèn)為VIP≥1的代謝物為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控及統(tǒng)計(jì)分析

通過對不同質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測分析的MRM代謝物檢測多峰圖(多物質(zhì)提取的離子流譜圖，XIC)進(jìn)行重疊展示分析，可以看到重復(fù)樣本不同物質(zhì)的離子峰值重疊性比較好(圖1)，說明實(shí)驗(yàn)過程具有穩(wěn)定性，檢測結(jié)果可靠。

圖1 MRM代謝物檢測多峰圖(XIC圖)
Fig.1 MRM detection of multimodal maps

通過對樣本(包括質(zhì)控樣品)進(jìn)行主成分分析，判別黑老虎果皮(KP1-3)、果肉(KF1-3)、種子(KD1-3)各樣本組間和組內(nèi)的變異度大小。全部樣本主成分分析(principal component analysis, PCA)得分圖(圖2)顯示UC-MS/MS分析所得原始數(shù)據(jù)在PC1、PC2兩種主成分中得到良好地呈現(xiàn)。在圖2中，第一主成分的貢獻(xiàn)率為58.58%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為22.77%，代表2個主成分能夠基本反映檢測樣品的主要特征信息；3組樣本在二維圖上表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明對各樣本數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信，各樣本間存在明顯差異。

圖2 三組樣本及質(zhì)控樣的PCA結(jié)果
Fig.2 PCA results of three groups of samples and quality control

為了鑒別出具體有哪些DAMs造成了分離現(xiàn)象，建立黑老虎果皮與果肉(KP vs KF)、果肉與種子(KF vs KD)之間的2組OPLS-DA模型。由2組比較OPLS-DA驗(yàn)證結(jié)果顯示模型具有很好的預(yù)測能力和可靠性，能夠很好地表現(xiàn)各組間代謝物的變化趨勢。對OPLS-DA模型進(jìn)行200次排列驗(yàn)證，模型(表1)有意義，可根據(jù)VIP值分析篩選取DAMs。

表1 兩組比較的OPLS-DA 模型驗(yàn)證值
Table 1 The calculated OPLS-DA model values of the two pairwise groups

2.2 代謝物分析

基于所鑒定出代謝物的結(jié)構(gòu)配置，將其歸屬11類(Ⅰ級)，以其中氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、脂質(zhì)、其他(糖及醇類、維生素)5類營養(yǎng)成分進(jìn)行分析。果實(shí)共鑒定出營養(yǎng)代謝物429個，其中果皮424個、果肉429個、種子391個，3個部位共有的為389個。進(jìn)一步對營養(yǎng)物質(zhì)歸類分為12個Ⅱ類，其中氨基酸類數(shù)量最多，占總數(shù)(429個)的22.6%；有機(jī)酸次之，占18.6%；其余依次為游離脂肪酸(13.5%)、糖及醇類(12.8%)、核苷酸類(11.2%)、溶血磷脂酰膽堿(6.8%)、溶血磷脂酰乙醇胺(6.3%)、甘油酯(3.3%)、維生素(2.8%)、其他類(1.6%)、鞘脂(0.2%)、磷脂酰膽堿(0.2%)。果皮與果肉在12類中分布的代謝物數(shù)量幾乎相當(dāng)，種子在氨基酸類、有機(jī)酸、甘油酯、糖及醇類、其他類分布略少(圖3)。

圖3 黑老虎果肉、果皮、種子的營養(yǎng)成分?jǐn)?shù)量統(tǒng)計(jì)
Fig.3 Number of metabolites detected in each class of compounds in different organs of K. coccinea

2.3 差異代謝物分析

基于OPLS-DA結(jié)果，根據(jù)DAMs選擇標(biāo)準(zhǔn)，KP v KF篩選到124個DAMs，KF vs KD有256個DAMs；2個對照中的DAMs主要集中于氨基酸類、有機(jī)酸、核苷酸類。此外，KF vs KD組中來自于甘油酯、游離脂肪酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、糖及醇類的DAMs遠(yuǎn)多于KP vs KF，這使得該對照組有更多數(shù)量的DAMs(表2)。

表2 差異代謝物種類與變化情況
Table 2 Species types and changes of DAMs

DAMs在KP vs KF中以上調(diào)模式占主導(dǎo)，而在KF vs KD中則以下調(diào)占優(yōu)；2組對比中同時為DAMs的有81個，其中11個[N-甲酰-L-蛋氨酸、N-乙酰-L-谷氨酰胺、L-賴氨酸丁酸酯、N-(3-吲哚乙?；?-L-丙氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、α-酮戊二酸、2,3-二羥基苯甲酸、夾竹桃苷、巴斯苷、4,7,9,9′-四羥基-3,3′-二甲氧基-8-O-4′-新木質(zhì)素、白藜蘆醇苷]呈連續(xù)下調(diào)模式，16個[N,N-二甲基甘氨酸、L-賴氨酸、N-α-乙酰基-L-鳥氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-甘氨酰-L-異亮氨酸、高精氨酸、L-絲氨酰-L-異亮氨酸、L-甘氨酰-L-苯丙氨酸、L-脯氨酰-L-亮氨酸、L-丙氨酰-L-苯丙氨酸、L-異亮氨酰-L-天冬氨酸、γ-氨基丁酸、3-異丙基蘋果酸、二十碳二烯酸、溶血磷脂酰膽堿16∶0(2n異構(gòu))、溶血磷脂酰膽堿20∶1]連續(xù)向上表達(dá)。連續(xù)向下或向上表達(dá)的DAMs中氨基酸類數(shù)量最多，都含有機(jī)酸，連續(xù)下調(diào)成分中還含有多個其他類成分。

進(jìn)一步選出差異倍數(shù)排在前20(上調(diào)和下調(diào))的DAMs(圖4)，KF vs KP組中主要由氨基酸類和甘油酯類成分構(gòu)成，KF vs KD中包含溶血磷脂酰乙醇胺、氨基酸類、糖及醇類。KF vs KD組的差異倍數(shù)明顯大于KF vs KP，上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最大的物質(zhì)分別為溶血磷脂酰乙醇胺20∶5和磷酸二羥基丙酮，均來自KF vs KD組；這也表明：黑老虎果皮和果肉與種子比較，營養(yǎng)成分分離現(xiàn)象更為明顯，尤其在脂質(zhì)類成分中更顯著。

a-KP果皮vs KF果肉；b-KF果肉vs KD種子
圖4 兩組對比中差異倍數(shù)最大的20種代謝物
Fig.4 Top 20 DAMs between the two pairwise groups

2.4 主要營養(yǎng)成分富集程度

通過值峰積累及聚類熱圖(圖5)分析，果肉、果皮和種子中營養(yǎng)成分豐度分別為73.13×107、55.45×107和56.33×107，含量(以對應(yīng)部位檢出的所有代謝物值峰為基數(shù))分別為73.1%、55.5%和56.3%；在3個部位富集度都較高的是氨基酸類、有機(jī)酸、游離脂肪酸、糖及醇類和溶血磷脂酰膽堿。但整體積累格局差異仍然明顯，其中氨基酸類和游離脂肪酸豐度果皮<種子<果肉，有機(jī)酸、糖及醇類積累量種子<果皮<果肉，種子中磷脂酰膽堿表達(dá)量顯著高于果肉和果皮。

圖5 聚類熱圖
Fig.5 Heatmap representing the accumulation (ion intensity) of metabolites in three tissues

3個部位含量(同上)≥0.5%的營養(yǎng)成分共55個(表3)，其中氨基酸類最多，占41.8%；游離脂肪酸、磷脂酰膽堿和有機(jī)酸均占12.7%。果肉、果皮和種子主要代謝物分別有43、25、41個，共有21個，其分別是L-甲硫氨酸亞砜、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸、溶血磷脂酰膽堿18∶2(2n異構(gòu))、溶血磷脂酰膽堿18∶2、溶血磷脂酰乙醇胺16∶0、γ-亞麻酸、α-亞麻酸、硬脂酸(十八烷酸)、亞油酸、肉豆蔻酸、16-甲基十七烷酸、D-果糖、1-癸醇、肌醇半乳糖苷、檸檬酸、3-脫氫-L-蘇糖酸、琥珀酸、甲基丙二酸、異檸檬酸。這些成分中很多種被證實(shí)具有重要生物活性和作用功能，在食品及藥用領(lǐng)域具有較好利用前景。

表3 果肉、果皮、種子含量≥0.5%的營養(yǎng)成分

Table 3 Nutrient components with content≥0.5% in the pulp, peel, and seeds

續(xù)表3

注：*表示該物質(zhì)包括其同分異構(gòu)體

3 結(jié)論與討論

采用廣泛靶向代謝組學(xué)分析方法，鑒定黑老虎果實(shí)不同部位代謝成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)配置歸屬I級類，以其中的氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸、脂質(zhì)、其他類(糖及醇類、維生素)5個類別為營養(yǎng)成分進(jìn)行分析。在黑老虎果實(shí)中共鑒定出429個營養(yǎng)成分，果皮424個、果肉429個、種子391個，3個部位共有389個。進(jìn)一步將營養(yǎng)物質(zhì)細(xì)分為12個Ⅱ類，氨基酸類、有機(jī)酸、游離脂肪酸和糖及醇類數(shù)量和含量在3個部位中都處于優(yōu)勢地位，種子中營養(yǎng)成分少于果皮和果肉，主要因這些優(yōu)勢成分(氨基酸類、有機(jī)酸、糖及醇類)數(shù)量較少。3個部位營養(yǎng)成分豐度呈現(xiàn)出明顯差異，有機(jī)酸、游離脂肪酸、溶血磷脂酰乙醇胺在果肉中顯著向上表達(dá)，因此，果肉營養(yǎng)成分積累量明顯高于果皮和種子；而溶血磷脂酰乙醇胺在種子表達(dá)量顯著上調(diào)。

黑老虎營養(yǎng)成分的鑒定很好地補(bǔ)充和豐富了其營養(yǎng)價值，如氨基酸類多達(dá)97種，除包括人體必需的氨基酸外，還含有組氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸等具有獨(dú)特營養(yǎng)功能和重要生理作用的氨基酸。有機(jī)酸也非常豐富，其中檸檬酸、琥珀酸、3-脫氫-L-蘇糖酸等積累量較高。研究顯示其具有抑菌、利膽、消炎、降血糖、抗氧化以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，能夠增加冠狀動脈血流量、抑制腦組織脂質(zhì)過氧化物生成、軟化血管、促進(jìn)鈣、鐵元素的吸收；同時幫助胃液消化脂肪，還能夠預(yù)防疾病和促進(jìn)新陳代謝等[20]。果實(shí)中富含脂質(zhì)，其中亞油酸豐度居所有代謝物之首，α-亞麻酸、γ-亞麻酸含量也較高；含有磷脂(溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺)56種，這些成分不僅有較高的營養(yǎng)價值，同時還具有促進(jìn)人體新陳代謝、預(yù)防疾病、增強(qiáng)免疫力等作用，在醫(yī)療及免疫學(xué)方面的研究意義重大[21-23]。

目前黑老虎果實(shí)以直接食用為主，但可食率較低，果肉(果肉和種子不易分離)被盡可能吸食后，種子和果皮被廢棄。從營養(yǎng)成分富集格局看，果皮具有與果肉接近的營養(yǎng)價值，可以連同開發(fā)利用；而種子中脂質(zhì)表達(dá)量豐富，人體必需脂肪酸含量較高，還含有多種特有成分[溶血磷脂酰乙醇胺20∶5、溶血磷脂酰乙醇胺20∶4(2n異構(gòu))、溶血磷脂酰乙醇胺20∶4]，可作為優(yōu)質(zhì)植物脂肪酸來源的新興理想原料。代謝組學(xué)在黑老虎果實(shí)不同部位鑒定出高度富集和獨(dú)特的代謝物，將為進(jìn)一步研究與利用提供重要支持。