當歸莖葉精油對四種果蔬采后腐敗真菌的抑制活性

當歸(Angelica sinensis(Oliv.)Diels.)為傘形科(Umbelliferae)當歸屬(Angelica)植物，作為甘肅的道地大宗藥材，在甘肅種植面積為12 000 hm2左右，約占全國總產(chǎn)量的85%以上[1]。作為名貴的藥食同源材料，當歸具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎、抗腫瘤和治療婦女原發(fā)性痛經(jīng)等作用，還可用于藥膳配制[2]，素有“十方九歸”之稱[3]。當歸是多年生草本植物，株高0.4～1 m，根長僅有0.15～0.25 m[4]。莖葉占全株的大部，但由于不能入藥，采收后通常被遺棄或焚燒。當歸莖葉富含多種活性成分，其總黃酮的含量遠高于當歸根[5]，可制成綠原酸、金絲桃苷含量較高的當歸莖葉茶[6]。充分發(fā)掘利用當歸莖葉的生物活性物質(zhì)，實現(xiàn)變廢為寶，對提高當歸的資源化利用程度和當歸產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要的意義。

植物病原真菌侵染造成的損失占我國果蔬總產(chǎn)量的20%～25%[7]，腐爛后的果蔬易積累真菌毒素[8]，嚴重危害人體健康并造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，化學合成殺菌劑是控制果蔬采后病害的主要方法，但其過度使用可導致有害菌耐藥菌株的出現(xiàn)、污染環(huán)境以及危害人類健康等多種后果[9]。具有較高抑菌活性的天然植物代謝產(chǎn)物有望成為化學殺菌劑的替代品[10]。精油是一類具有多種生物活性的植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實中[11]。丁香精油和姜黃精油等多種精油有良好的抑菌活性，具有潛在食品抑菌防腐的應用價值[12-13]。

本試驗以當歸莖葉為原料，通過水蒸餾法提取精油并計算其提取率，采用GC-MS分析其主要化學成分，探究其對造成果蔬腐敗的4種采后病原真菌的抑制活性，旨在為當歸的資源化利用及新型抑菌劑的研究開發(fā)提供新的科學基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與菌株

當歸莖葉于2020年10月份采自甘肅省渭源縣會川鎮(zhèn)，干燥粉碎后過篩保存。

4種采后病原真菌[互隔交鏈孢(Alternaria alternata)、擴展青霉(Penicillium expansum)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)和硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)]均分離自發(fā)病果實，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學采后生物學與技術實驗室。供試櫻桃番茄購自蘭州市安寧區(qū)桃海市場，選取大小均勻、顏色均一、成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害侵染的果實進行體內(nèi)抑菌試驗。試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設備

CN69M/FW80高效植物樣品粉碎機，北京中西遠大科技有限公司；7890 B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；D小D加濕器，深圳市維特世嘉科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 當歸莖葉精油的提取

采用水蒸餾法提取精油。干燥當歸莖葉粉碎后過篩，采用Clevenger裝置進行提取，蒸餾結束后收集上層油狀液體，加少量無水硫酸鈉靜置片刻后，離心分離除去水分，收集精油后避光保存于4 ℃冰箱中。提取率計算如公式(1)所示：

提取率

(1)

1.2.2 當歸莖葉精油成分的測定

用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行成分分析，質(zhì)譜分析儀為Agilent 7890 B系列(Agilent Technologies, Palo Alto, USA)，配備HP-5 MS非極性柱(內(nèi)徑30 m×0.25 mm；薄膜厚度0.25 μm)。氦氣作為載氣以1 mL/min的速度進入，進樣口的溫度保持在220 ℃，進樣量為1 μL，分流比為250∶1。升溫程序：初始溫度50 ℃，持續(xù)1 min，以4 ℃/min的速度升溫并使最終溫度達到220 ℃，持續(xù)8 min。質(zhì)譜條件：EI離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV，四極桿溫度保持在150 ℃，掃描速度為0.5 m/s，掃描范圍為35～550 m/z。在相同的條件下，用各化合物的保留時間和正構烷烴(C7～C40)的保留時間計算揮發(fā)油成分的保留指數(shù)(retention index,RI)，采用NIST02.1標準質(zhì)譜庫進行檢索和分析。

1.2.3 體外抑真菌試驗

1.2.3.1 當歸莖葉精油對采后病原真菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)

參考YANG等[14]的方法并略作修改，按照二倍稀釋法測定，在96孔板中的第1個孔中加入用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解的精油和馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth, PDB)液體培養(yǎng)基，使精油體積分數(shù)為150 μL/mL，然后不斷稀釋使第10個孔的精油體積分數(shù)為0.15 μL/mL，在每個孔中分別加入20 μL濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以48 h后無肉眼可見的微生物生長的濃度為其MIC值。將不長菌的孔中的液體吸取30 μL至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)中，26 ℃培養(yǎng)48 h后仍不長菌的濃度為MFC值。

1.2.3.2 當歸莖葉精油處理對采后病原真菌菌絲生長的影響

采用濾紙片熏蒸法進行測定[15]。在培養(yǎng)基中央接種3 μL濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，將直徑為6 mm的無菌圓形濾紙片貼在培養(yǎng)皿的蓋子上，分別在濾紙片上滴加3、6、9 μL精油，使精油在培養(yǎng)皿中的體積分數(shù)分別為0.05、0.10、0.15 μL/mL，無菌水為對照。26 ℃倒置培養(yǎng)，3、5、7 d時分別測量菌落直徑。第7天時的生長抑制率按公式(2)計算：

生長抑制率

(2)

式中：d對照，對照組直徑，mm;d處理,處理組直徑，mm。

1.2.3.3 當歸莖葉精油處理對采后病原真菌生物量的影響

在凝固后的PDA上鋪無菌玻璃紙，精油處理方法及接菌方法同上述熏蒸法，培養(yǎng)5 d后從玻璃紙上刮下菌絲稱重。

1.2.4 體內(nèi)抑真菌試驗

參考WANG等[16]的方法并略作修改。挑選大小適中且無病害的櫻桃番茄，清洗后用質(zhì)量分數(shù)為0.2%的NaClO溶液浸泡2 min，無菌水沖洗干凈后室溫下晾干，在每個番茄的赤道部位用10 mL無菌注射器針頭打2個孔，每個孔接種5 μL濃度為1×104 CFU/mL的T.roseum孢子懸浮液，室溫放置2 h后置于底部帶孔的塑料密封盒(38 cm×25 cm×14 cm)中，用無水乙醇將精油稀釋使其濃度分別為0、60、90 μL/mL，然后用霧化器通過塑料盒底部的孔分別熏蒸30 min，結束后用膠帶將孔密封，室溫(26±2)℃，相對濕度85%下儲存。接種后的第3天開始測定其病斑直徑，連續(xù)測定5 d。3次重復，每次試驗16個番茄。通過十字測量法測定其病斑直徑，病斑直徑超過3 mm時即為發(fā)病，發(fā)病率按公式(3)計算：

發(fā)病率

(3)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

每個試驗均重復3次，試驗結果表示為平均值±標準差。采用Origin 8.5繪圖，采用SPSS 24進行數(shù)據(jù)處理。應用單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯氏(Duncan’s)法進行差異分析。

2 結果與分析

2.1 精油提取得率

采用水蒸餾法提取精油，所得精油呈淺黃色，經(jīng)干燥稱重后計算得當歸莖葉精油的提取率為0.057%。

2.2 精油的化學成分分析

采用GC-MS分析其化學成分，發(fā)現(xiàn)當歸莖葉精油中相對含量>0.01%的組分有51種，占總成分的89.88%。相對含量最多的組分是2, 4, 5-三甲基苯甲醛，占比22.7%，其次是α-蒎烯(11.1%)、十氫-3-甲基-7-亞甲基-1-(1-甲基乙基)(6.69%)、α-法呢烯(6.44%)、反式-蛇床內(nèi)酯(5.84%)和β-蒎烯(5.16%)，還含有少量D-檸檬烯、檜烯、蛇麻烯、D-吉瑪烯和反式-α-香柑油烯(表1)。當歸莖葉精油中含氧單萜類化合物的含量最高，占比24.51%，然后是單萜烯類(20.08%)、倍半萜烯類(16.31%)和含氧倍半萜類(2.72%)，占總成分的63.22%，而其他類占比26.66%，主要是醛類、酯類和醇類等組分。

表1 當歸莖葉精油化學成分分析
Table 1 Chemical composition of A.sinensis leaf essential oil

續(xù)表1

2.3 對4種真菌的體外抑制活性

2.3.1 對4種真菌的MIC和MFC

通過二倍稀釋法測定當歸莖葉精油對4種常見采后病原真菌的MIC和MFC，發(fā)現(xiàn)其對T.roseum的MIC為1.17 μL/mL，對A.alternata、F.sulphureum和P.expansum的MIC值均為2.34 μL/mL，對上述4種菌的MFC均為9.37 μL/mL。說明當歸莖葉精油對4種采后病原真菌均有較強的抑制活性。

2.3.2 菌絲生長抑制率

當培養(yǎng)至第7天時，對照組中的4種真菌生長狀況良好，而當歸莖葉精油處理后的真菌生長速度較緩慢且孢子形態(tài)出現(xiàn)了不同程度的變化(圖1-a)。測定菌落直徑并計算精油對4種真菌的抑制率(圖1-b)，當歸莖葉精油的體積分數(shù)為0.15 μL/mL時，對T.roseum的抑制活性最強，抑制率為95.73%，對F.sulphureum、A.alternata和P.expansum的抑制率分別為90.82%、85.54%和64.74%，綜上表明，當歸莖葉精油對不同菌種的抑制活性不同，4種菌對精油的敏感性由強到弱可排序為T.roseum>F.sulphureum>A.alternata>P.expansum。

a-4種菌菌絲形態(tài)；b-4種菌的生長抑制率
圖1 當歸莖葉精油熏蒸處理對4種真菌菌絲生長的抑制活性
Fig.1 Effect of the A.sinensis leaf essential oil treatment on mycelial morphology and inhibition ratio of the four fungi 大小寫字母分別代表組間和組內(nèi)差異顯著性(P<0.05)(下同)

2.3.3 對菌體生物量的影響

當歸莖葉精油處理可使供試真菌的生物量積累顯著降低。對照組中菌體的生物量最高，隨著精油濃度逐漸升高，4種真菌的生物量均顯著降低(圖2)。說明當歸莖葉精油對4種真菌的生物量積累均有較大影響。

圖2 當歸莖葉精油對4種采后病原真菌的 生物量積累的影響
Fig.2 Effect of the A.sinensis leaf essential oil treatment to the biomass of the four fungi

2.4 對T.roseum的體內(nèi)抑制活性

當歸莖葉精油處理對T.roseum在番茄上的擴展(櫻桃番茄紅粉病)有明顯的抑制效果，病斑直徑被顯著抑制，這和在培養(yǎng)皿中對T.roseum菌絲生長和生物量的抑制作用一致。60 μL/mL的當歸莖葉精油處理已能達到較佳抑制效果，當體積分數(shù)升高至90 μL/mL時，T.roseum在小番茄上幾乎不生長，說明該濃度完全抑制了T.roseum的生長(圖3-a)。隨著當歸莖葉精油濃度的增加，接種T.roseum的櫻桃番茄的病斑直徑明顯降低，第5天時，對照組病斑直徑為13.5 mm，但60、90 μL/mL當歸莖葉精油處理組果實的病斑直徑分別為6.4、5.3 mm，比對照組分別降低了53%、61%。第7天時，60、90 μL/mL當歸莖葉精油處理組的病斑直徑分別比對照組降低了51%、69%(圖3-b)。隨著精油濃度的增加，接種T.roseum的櫻桃番茄的發(fā)病率明顯降低(圖3-c)，第3天時，對照組已有50%的果實發(fā)病，但當歸莖葉精油處理組無發(fā)病的果實，第5天時，對照組果實已全部發(fā)病，但60、90 μL/mL當歸莖葉精油處理組果實的發(fā)病率分別為17.78%、8.89%。當歸莖葉精油處理的果實發(fā)病率也隨著儲存時間逐漸增加，但遠低于對照組，說明精油處理可以有效抑制櫻桃番茄上紅粉病的發(fā)病率。

a-當歸莖葉精油對櫻桃番茄紅粉病擴展的影響； b-櫻桃番茄紅粉病病斑直徑；c-櫻桃番茄紅粉病發(fā)病率
圖3 不同濃度當歸莖葉精油熏蒸處理對櫻桃 番茄紅粉病防治效果
Fig.3 Effects of A.sinensis leaf essential oil with different concentrations on controlling pink-mold rot on cherry tomatoes

3 討論

本實驗以渭源當歸的莖葉為原料提取的精油得率為0.057%，共鑒定出51種化合物，其中主要成分為2, 4, 5-三甲基苯甲醛、α-蒎烯、β-蒎烯和α-法呢烯。前期研究表明當歸莖葉精油的主要成分為三甲基苯甲酸、咖啡酸和植物甾醇[17]，和本文的結果差異較大，可能是精油成分受到植株的生長環(huán)境、施肥情況和精油提取方式的影響[18]。

體外試驗表明0.05 μL/mL的當歸莖葉精油熏蒸就可抑制采后病原真菌的生長，體積分數(shù)升高至0.15 μL/mL時對T.roseum和F.sulphureum的抑制率高達90%以上，說明當歸莖葉精油對采后病原真菌具有很強的抑菌活性。精油的主要功能包括抵御食草動物和病原菌的侵害，吸引有助于花粉或種子傳播的有益動物或微生物，并在植物識別中發(fā)揮信號作用[19]；而植物的葉片和莖暴露在空氣中，需要抵御更多的外部脅迫，這可能是當歸莖葉精油具有較好的抑菌活性的原因。體內(nèi)實驗表明當歸莖葉精油對櫻桃番茄上T.roseum的生長具有顯著的抑制作用，60 μL/mL當歸莖葉精油熏蒸30 min就可顯著抑制櫻桃番茄紅粉病發(fā)病率及病斑的擴大。但體外與體內(nèi)抑制病原菌所需精油的濃度差異較大，可能是體內(nèi)環(huán)境復雜，相對于PDA，果蔬體內(nèi)的碳源、溫度、濕度、pH等更適合病原菌的生長[20]，這與JIAO等[21]用ε-PL處理草莓、葡萄、辣椒上的灰霉病所得的結果類似。因此，當歸莖葉精油在櫻桃番茄采后貯藏期間能有效減少病原真菌的侵染和病害的發(fā)生，可以作為開發(fā)天然防腐保鮮劑的材料，具有較好的開發(fā)潛力和應用前景。

本研究表明當歸莖葉精油中含氧單萜類化合物(24.51%)和單萜烯類(20.08%)的比重較大。植物精油作為一種混合物，其抑菌活性是各個成分共同作用的結果[22]。精油的基本特性是疏水性，單萜烯類物質(zhì)如α-蒎烯、β-蒎烯等可優(yōu)先從水相中分離并滲透到真菌的細胞膜內(nèi)，從而破壞細胞膜的磷脂層,引起細胞內(nèi)離子的泄漏[23-24]，導致細胞活力下降。而含氧單萜類化合物如2, 4, 5-三甲基苯甲醛、α-水芹烯-8-醇和4-萜烯醇等則通過阻止細胞分裂，影響微生物的生長周期發(fā)揮其抑菌作用[25]。含氧單萜類化合物中萜烯骨架的親脂性和其官能團的親水性的結合對其抑菌活性至關重要，其發(fā)揮抑菌活性的順序為醛類>酮類>醇類>酯類>烯烴類物質(zhì)[26]。孜然精油中的枯茗醛[27]、肉桂精油中的肉桂醛[28]均具有很好的抑菌活性，而當歸莖葉精油中2, 4, 5-三甲基苯甲醛的占比較大，可能是當歸莖葉精油中起抑菌作用的主要化合物，目前尚未見到其他精油中存在該化合物的報道，因此下一步可對該化合物的生物活性做進一步研究。

4 結論

本研究所提取的當歸莖葉精油得率為0.057%，經(jīng)GC-MS分析測定的主要成分為2, 4, 5-三甲基苯甲醛、α-蒎烯、十氫-3-甲基-7-亞甲基-1-(1-甲基乙基)、α-法呢烯、反式-蛇床內(nèi)酯和β-蒎烯，占總成分的57.93%。該精油能顯著抑制4種常見采后病原真菌，且抑制活性存在顯著濃度依賴性。在體內(nèi)條件下對櫻桃番茄紅粉病病斑的擴展也具有顯著的抑制作用。以上結果對當歸莖葉的資源化利用提供了理論依據(jù)，為開發(fā)天然綠色抑菌劑提供新材料。