不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜褐變和假單胞菌的抑制作用

鮮切蔬菜是指以新鮮蔬菜為原料，經(jīng)清洗、切分、殺菌、拼盤等工藝加工后，再經(jīng)過冷鏈運送至消費者處的一種拆封即食食品[1]。由于其新鮮、方便、衛(wèi)生等特點，目前在市場大受重視，是蔬菜消費的新趨勢，同時也是延長蔬菜產(chǎn)業(yè)鏈的新的突破口。生菜，是一類重要的綠葉蔬菜，因口感甜脆，營養(yǎng)價值高，富含多種維生素、膳食纖維、蛋白質(zhì)、碳水化合物和無機(jī)鹽等，有抗衰老、加強腸胃道功能和排毒利尿的功能而深受消費者的青睞[2]，同時也是最常見的鮮切蔬菜之一。鮮切生菜的外觀和口感尤為重要，但是由于切面損傷，加上不適宜的溫度和氣調(diào)比等非生物因素，使得鮮切生菜在加工以及貯藏期間容易發(fā)生品質(zhì)劣變[3]。褐變和腐敗菌是造成鮮切生菜品質(zhì)劣變的兩大重要原因。由于機(jī)械損傷，鮮切生菜極易褐變，尤其以酶促褐變最為常見，對果蔬的外觀、口感等感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值等方面有較大影響，降低消費者的接受度。假單胞菌為專性需氧的革蘭氏陰性菌，廣泛地分布于空氣、土壤、水，以及人體皮膚、消化道和呼吸道中[4]，可導(dǎo)致動物和植物產(chǎn)品腐敗。假單胞菌在生菜等很多綠葉蔬菜上都是優(yōu)勢腐敗菌，產(chǎn)生水解酶，致使蔬菜軟腐爛。在鮮切生菜中假單胞菌的污染問題更為嚴(yán)重。

目前關(guān)于鮮切生菜保鮮的物理和化學(xué)方法有很多，氣調(diào)貯藏、電解水和臭氧等方法已被證實能有效抑制生菜褐變和腐敗[5]。然而，這些方法存在有害化學(xué)物質(zhì)殘留、成本高、處理量有限、可能造成細(xì)菌耐藥性增強等問題。近年來，研究者用天然產(chǎn)物進(jìn)行鮮切菜的保鮮，提高農(nóng)業(yè)廢棄物的利用效率，并提供了更加安全的保鮮方法。桑樹在我國分布廣泛，桑葉中含有很多活性成分，目前并未被充分利用。其中的桑葉多酚是具有生物活性的酚類次生代謝產(chǎn)物，是構(gòu)成桑葉抗氧化能力的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我們過去的研究已經(jīng)證實，桑葉多酚可以作為一種天然的生物保鮮劑，用于鮮切的果蔬保鮮[6]。

桑葉多酚的抗氧化性一直是食品果蔬保鮮領(lǐng)域應(yīng)用的難題，不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜抗褐變程度以及對優(yōu)勢腐敗菌的抑制作用尚不清楚。因此，有必要通過從桑葉中提取多酚，以鮮切生菜為原料，通過稀釋得到不同濃度梯度桑葉多酚進(jìn)行實驗，從而更好地了解桑葉多酚在抗褐變和抑制熒光假單胞菌中的作用。本研究旨在對比褐變度以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)，過氧化物酶(peroxidase，POD)，苯丙氨酸酶(phenylalanine ammonia，PAL)這3種主要酶活性來確定不同濃度桑葉多酚的抗褐變能力。同時，本研究通過繪制熒光假單胞菌生長曲線以及測定生物膜量來探究其對熒光假單胞菌的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉，采摘自西南大學(xué)桑葉園，品種為納溪族；生菜，購自重慶市北碚區(qū)永輝超市；大孔樹脂，范德(北京)生物科技有限公司；無水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈木創(chuàng)酚、過氧化氫、硼酸鹽緩沖液、苯丙氨酸、丙酮，所有試劑均為分析純，重慶市鈦興化工試劑廠；假單胞菌，實驗室從腐敗生菜中分離培養(yǎng)所得。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP,電子天平，Sartorius；5810R冷凍高速離心機(jī)、測色儀，Eppendorf；721 N型可見分光光度計，上海生工生物科技有限公司；1510型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同濃度桑葉多酚的制備

取12 g桑葉粉與400 mL乙醇(70%，體積分?jǐn)?shù))混合于錐形瓶中，在超聲功率為400 W的條件下進(jìn)行超聲處理60 min。提取液經(jīng)103號定性濾紙過濾，在40 ℃真空條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得到200 mL桑葉粗多酚提取液。粗多酚在8 000×g離心10 min，取40 g 經(jīng)預(yù)處理大孔吸附樹脂，裝入3 cm×30 cm的層析柱中，將離心后上清液緩慢加入層析柱中，用大孔樹脂吸附酚類物質(zhì)。用蒸餾水對大孔樹脂中的水溶性化合物進(jìn)行2次洗滌，用60%乙醇(pH 4.0±0.1)洗脫樹脂中酚類物質(zhì)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃下濃縮多酚溶液以獲得純凈的桑葉多酚提取液，放置在低溫暗處保存。用無菌蒸餾水將初始質(zhì)量濃度為100 g/L的桑葉多酚溶液分別稀釋為0.1、0.5、1、10 g/L。

1.3.2 生菜預(yù)處理

將鮮切生菜純水沖洗，洗去表面泥土，摘去外層葉片和不健康的葉片，用滅菌后的剪刀將健康的生菜切成2.0 cm×2.0 cm，再用200 mg/L次氯酸鈉溶液浸泡10 min，用無菌純水沖洗后將其放入生物安全柜中晾干。晾干后，各處理組準(zhǔn)確稱量10 g樣品于一次性果蔬托盤中，裝入滅菌后的保險密封袋并做好標(biāo)記，置于4 ℃下貯藏，在第0、1、3、5、7天觀測鮮切生菜的貯藏品質(zhì)變化并測量特性。

1.3.3 不同濃度桑葉多酚對生菜褐變的抑制作用

1.3.3.1 褐變測定

5種濃度梯度生菜樣品在第0、1、3、5、7天分別稱取2 g，加入95%乙醇6 mL，研磨均勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液于420 nm處測定吸光度A，即為樣品褐變度。

1.3.3.2 色差測定

5種濃度梯度生菜樣品在第0、1、3、5、7天分別使用全自動色差計(TCP2-B)測量樣品色澤，在每片生菜兩側(cè)和中心位置進(jìn)行3次測量，記錄下L*、a*、b*值。

1.3.3.3 葉綠素含量測定

5種濃度梯度生菜樣品在第0、1、3、5、7天分別稱取0.5 g，加入2.0 mL丙酮研磨，收集研磨液后再加入2.0 mL丙酮反復(fù)沖洗研缽并收集沖洗液，匯總后再加入離心管中，8 000 r/min離心10 min。取上清液，以丙酮作為空白對照，分別在645、663 nm測定吸光度值，葉綠素濃度計算如公式(1)～公式(4)所示:

Ca=12.72A663-2.59A645

(1)

Cb=22.88A645-4.67A645

(2)

C總=Ca+Cb

(3)

葉綠素含量

(4)

式中：Ca為葉綠素a濃度；Cb為葉綠素b濃度；C總為葉綠素總濃度；V為提取液總體積，mL；W為取樣質(zhì)量，g。

1.3.3.4 PPO活性測定

粗酶液的提取:分別在第0、1、3、5、7天取經(jīng)過5種濃度梯度桑葉多酚處理生菜樣品1.0 g，加入4 mL 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)溶液(0.1 g PVP溶于20 mL磷酸緩沖液)研磨成勻漿，于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

PPO活性采用鄰苯二酚法測定：將上述酶液稀釋10倍，取0.5 mL稀釋后的酶液，再加2.5 mL的0.2 mol/L鄰苯二酚溶液，空白組以蒸餾水代替酶液，在480 nm處測定3 min內(nèi)吸光度變化。以1 min吸光值增加0.1個吸光度值為1個酶活力單位(U)。

1.3.3.5 POD活性測定

粗酶液的提取:5種濃度梯度生菜樣品在第0、1、3、5、7天分別取樣1.0 g，加入4 mL PVP溶液研磨成勻漿，于4 ℃下8 000 r /min離心10 min，取上清液備用。

POD活性采用消光值法測定：取2 mL 0.05%愈創(chuàng)木酚溶液，隨即加入0.5 mL酶液并快速搖勻，空白組以蒸餾水代替酶液，30 ℃孵育5 min，最后加入1 mL 0.08%過氧化氫溶液，混勻，在420 nm處測定3 min 內(nèi)吸光度變化。以1 min吸光值增加0.1個吸光度值為1個酶活力單位(U)。

1.3.3.6 PAL活性測定

5種濃度梯度生菜樣品在第0、1、3、5、7天分別用5.0 mL pH 8.5硼酸鹽緩沖液研磨1 g樣品，在10 000 r/min 離心10 min后，將1.0 mL酶液與1.0 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸和2.0 ml蒸餾水混合，空白對照以1.0 mL上述硼酸緩沖液代替酶液。在37 ℃下，利用酶標(biāo)儀測定30 min前后290 nm處的吸光度，以吸光度A 1 h增加0.01為1個酶活力單位(U)。

1.3.4 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌的抑制作用

1.3.4.1 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌生長的抑制作用

從-80 ℃冰箱中挑取并培養(yǎng)實驗室貯存的從腐敗生菜中篩選的熒光假單胞菌，在LB培養(yǎng)液中37 ℃ 下培養(yǎng)16 h。取菌懸液，分別加入9 mL各濃度的桑葉多酚溶液，用無菌生理鹽水代替桑葉多酚溶液作為對照。每隔2 h測吸光值OD600，連續(xù)測量24 h。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.4.2 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌在生菜上形成生物被膜的抑制作用

采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行生物膜的測定。取5 mL菌懸液于裝有5 g鮮切生菜的無菌袋中，分別加入1 mL 各濃度的桑葉多酚溶液，用無菌生理鹽水代替桑葉多酚溶液作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。移除培養(yǎng)液后，取鮮切生菜于無菌燒杯中，用0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) NaCl溶液洗滌鮮切生菜3次并去除所有洗滌液。向燒杯內(nèi)加入1 mL質(zhì)量濃度為1 g/L結(jié)晶紫染色劑染色15 min。用0.85% NaCl溶液洗滌鮮切生菜2次，自然晾干。隨后，用1 mL 95%乙醇溶解鮮切生菜上的生物膜，并測定OD570值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與整理。使用Origin 2019和SigmaPlot 14.0軟件作誤差圖并分析結(jié)果。使用 SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重差異顯著性比較(P<0.05為顯著差異)。所有試驗均進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變度

酶促褐變是酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的反應(yīng)過程。當(dāng)生菜被切分后，機(jī)械傷害使生菜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致底物和酶的結(jié)合，形成了酶促褐變[7]。由圖1可知，鮮切生菜隨著貯藏時間延長，褐變度顯著上升(P<0.05)。這是因為鮮切處理后，生菜細(xì)胞壁受到破壞，酚類物質(zhì)不斷流出并與酶結(jié)合。而經(jīng)過0.1～1 g/L桑葉多酚處理，鮮切生菜褐變度的上升減緩，0.5 g/L桑葉多酚處理的褐變抑制效果最好。10 g/L桑葉多酚處理反而有促進(jìn)褐變的作用，可能由于濃度太高，為褐變提供了酚類物質(zhì)，增加了底物濃度，促進(jìn)了酶促褐變。

圖1 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜褐變度的影響
Fig.1 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on the browning of fresh-cut lettuce 注：同列標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)； 標(biāo)有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.2 色差

顏色是研究加工果蔬品質(zhì)的一個重要指標(biāo)[8]，生菜鮮切后的顏色變化影響其感官品質(zhì)，因此研究其顏色表征對產(chǎn)品價值判斷有重要意義[9]。由圖2可知，在貯藏過程中，L*值曲線整體逐漸下降，a*值和b*值曲線整體逐漸上升。L*值代表明暗度，a*值代表紅色度，b*值代表黃色度。經(jīng)0.1～1 g/L桑葉多酚處理的鮮切生菜在7 d里相較對照組亮度更高，紅色度和黃色度更低，褐變程度受到抑制，其中0.5 g/L桑葉多酚處理效果最佳。而經(jīng)10 g/L桑葉多酚處理的鮮切生菜相較對照組亮色度更低，紅色度和黃色度更高，褐變程度受到促進(jìn)。

2.3 葉綠素含量

葉綠素含量是維持鮮切生菜貯存品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。由圖3可知，隨著時間推移，鮮切生菜葉綠素含量顯著降低(P<0.05)。葉綠素酶是迄今為止了解最多的葉綠素酶促降解途徑的重要組成酶之一[10]。葉綠素含量越低表明生菜葉表面綠色褪色越嚴(yán)重，與葉片褐變程度息息相關(guān)[11]。貯藏期間，0.1～1 g/L桑葉多酚處理能有效減緩葉綠素含量減少，抑制其褐變速率，其中0.5 g/L桑葉多酚處理效果最佳。而10 g/L桑葉多酚處理促進(jìn)葉綠素含量下降，有促進(jìn)褐變作用。

A-L*；B-a*；C-b*
圖2 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜色差的影響
Fig.2 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on the color difference of fresh-cut lettuce

圖3 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜葉綠素含量的影響
Fig.3 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on the chlorophyll content of fresh-cut lettuce

2.4 酶活性測定

2.4.1 PPO活性變化

PPO是參與果蔬組織酶促褐變的關(guān)鍵性酶[12]。果蔬中多酚類物質(zhì)在PPO的催化作用下氧化而顯現(xiàn)褐色。這些多酚類物質(zhì)包括鄰苯二酚、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸等，它們在完整的細(xì)胞中作為呼吸傳遞物質(zhì)[13]。由圖4可知，在貯藏過程中，0～3 d，PPO活性不斷增強。當(dāng)生菜在被切分后受到機(jī)械損傷，細(xì)胞組織被破壞后,原本在細(xì)胞液泡中的酚類物質(zhì)外溢，在酚酶的作用下形成醌及其褐色聚合物[14-15]，同時PPO被激活。在第3～7天，PPO活性降低，可能是因為隨著酚類物質(zhì)流失，反應(yīng)底物減少，酶活性降低。0.1～1 g/L桑葉多酚處理可以抑制PPO活性，0.5 g/L桑葉多酚處理抑制效果最好。而10 g/L桑葉多酚處理促進(jìn)PPO活性，可能是濃度過高反而提供了酚類物質(zhì)底物促進(jìn)PPO反應(yīng)。

2.4.2 POD活性變化

在過氧化氫存在的情況下，POD能將酚類和類黃酮催化氧化、聚合而形成醌類化合物，進(jìn)而形成黑色素，與鮮切果蔬組織褐變密切相關(guān)[16]。由圖5可知，貯藏過程中POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，第3天達(dá)到活性的峰值。一是因為生菜鮮切處理后細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到機(jī)械損傷，大量過氧化氫流出，促進(jìn)POD反應(yīng)；二是因為雖然果蔬中過氧化氫含量較低，但是PPO不斷生成的過氧化氫和醌類物質(zhì)能為POD反應(yīng)繼續(xù)提供底物[17]。在第3～7天，POD活性降低?？赡芤驗樯吮旧頎I養(yǎng)物質(zhì)流失，反應(yīng)底物減少；另外，PPO反應(yīng)減緩后，無法提供更多的過氧化氫和醌類物質(zhì)。這些使得POD活性降低。0.1～1 g/L桑葉多酚處理可以抑制POD活性，0.5 g/L桑葉多酚處理抑制效果最好。而10 g/L桑葉多酚處理反而促進(jìn)了POD活性。

圖4 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜PPO活性的影響
Fig.4 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on PPO activity of fresh-cut lettuce

圖5 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜POD活性的影響
Fig.5 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on POD activity of fresh-cut lettuce

2.4.3 PAL活性變化

PAL是酚類物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)最上游的關(guān)鍵限速酶，催化苯丙烷類代謝，不斷形成酚類物質(zhì)[18]。酚類物質(zhì)不僅是酶促褐變的底物，同時也是PAL催化反應(yīng)的產(chǎn)物。由圖6可知，貯藏過程中PAL活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，第3天達(dá)到活性的峰值。生菜受到機(jī)械損傷后，PAL被大量誘導(dǎo)合成積累[19]，與大量暴露的苯丙氨酸反應(yīng)。同時，新合成的乙烯也加速苯丙氨酸的分解，生成大量的酚類物質(zhì)。此時酚類物質(zhì)與因機(jī)械損傷而被激活的PPO相結(jié)合導(dǎo)致了褐變的發(fā)生[13,20]。在第3～7天，PAL活性降低，因為PAL合成速率降低和反應(yīng)底物的減少。0.1～1 g/L桑葉多酚處理可以抑制PAL活性，0.5 g/L桑葉多酚處理抑制效果最好，是理想桑葉多酚濃度。而10 g/L桑葉多酚處理反而促進(jìn)PAL活性。

圖6 不同濃度桑葉多酚對鮮切生菜PAL活性的影響
Fig.6 Effects of different concentrations of mulberry polyphenol on PAL activity of fresh-cut lettuce

2.5 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌生長的抑制作用

由圖7可知，各處理組的假單胞菌生長呈典型的S型曲線，有典型的延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。在整個生長過程中，各濃度桑葉多酚處理均抑制了假單胞菌的生長，且桑葉多酚濃度越大抑制效果越強；在14～22 h差異性逐漸減?。辉?2～24 h，除10 g/L桑葉多酚處理與對照組有顯著性差異(P<0.05)以外，其他處理組均無顯著性差異。

圖7 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌生長的抑制作用
Fig.7 Inhibitory effects of different concentrations of mulberry polyphenol on the growth of Pseudomonas spp.

2.6 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌在生菜上形成生物被膜的抑制作用

生物膜是緊密黏附于生物體表面并且難以去除的細(xì)菌團(tuán)塊與細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)合體，該復(fù)合體通過細(xì)胞之間的相互作用緊密結(jié)合，穩(wěn)定且難以除去[21]。生物膜抗逆性強，對外界環(huán)境及宿主免疫系統(tǒng)的耐受能力強且穩(wěn)定，黏附于果蔬表面會使得果蔬易腐爛變質(zhì)，所以生物膜是導(dǎo)致腐敗菌持續(xù)污染食品的重要因素之一[22]。由圖8可知，與對照組相比，各濃度桑葉多酚處理下假單胞菌生物膜量均低于對照組，其中0.5、1、10 g/L桑葉多酚處理假單胞菌生物膜量有顯著性差異(P<0.05)。因此，桑葉多酚溶液處理可以有效抑制假單胞菌生物膜量，從而抑制其致腐能力，而且濃度越高，抑制效果越顯著。

圖8 不同濃度桑葉多酚對假單胞菌在生菜上形成生物 被膜的抑制作用
Fig.8 Inhibitory effects of different concentrations of mulberry polyphenol on biofilm formation of Pseudomonas spp.on lettuce

3 結(jié)論

本研究證明，桑葉多酚可以抑制鮮切生菜的褐變以及優(yōu)勢腐敗菌的生長，進(jìn)而有良好的保鮮效果。其中0.5 g/L桑葉多酚處理對鮮切生菜褐變抑制效果最佳，10 g/L桑葉多酚處理對假單胞菌抑制作用最佳。因此本研究進(jìn)一步明確了桑葉多酚這種天然生物保鮮劑的適宜作用濃度，有望更好地根據(jù)實際需求加以運用。