黃連對(duì)腸道致病菌的體外抑菌作用

黃連，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛莨科植物黃連(Coptis chinensis Franch.，味連)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao，雅連)、云連(Coptis teeta Wall.)的干燥根莖[1-2]。黃連抗菌譜廣，對(duì)各種細(xì)菌、真菌以及流感病毒均有一定的抑制作用，臨床常用其進(jìn)行抗菌與抗病毒[3]。雅連對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，且藥效最佳，歷代都被視為黃連屬的上品[4]。但由于雅連多為野生，生長(zhǎng)慢且栽培采挖條件苛刻，目前產(chǎn)量較低，缺乏相關(guān)科學(xué)研究。

目前食源性疾病頻發(fā)[5]，多由于各種致病菌和腐敗菌的污染[6]，營(yíng)養(yǎng)豐富的食物使得細(xì)菌更好的生長(zhǎng)和繁殖并產(chǎn)生致病毒素[7]。因此為預(yù)防食源性疾病和延緩食品的腐敗變質(zhì)，常在食品中加入防腐保鮮劑[8]。近年來(lái)，天然食品防腐保鮮劑的研究成為熱點(diǎn)，使用黃連等抗菌譜廣、高效且持久、無(wú)毒、無(wú)殘留與污染的天然植物或中草藥開(kāi)發(fā)天然防腐劑受到越來(lái)越多的關(guān)注[9-10]。

黃連在抑菌抗菌方面具有顯著的藥理活性，但不同品種、不同炮制方式的黃連對(duì)常見(jiàn)腸道致病菌的抑菌作用研究未見(jiàn)報(bào)道，黃連抑菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究仍然不足。本實(shí)驗(yàn)采用體外抑菌活性測(cè)定方法，分析比較不同品種及炮制方式的黃連對(duì)食品中常見(jiàn)的腸道致病菌的抑菌效果，為進(jìn)一步明確黃連發(fā)揮抑菌作用的極性部位及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提高參考，也為以黃連為原料開(kāi)發(fā)天然抑菌劑提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

味連(生品、酒制)，太極大藥房溫江店；雅連(生品、酒制)，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium.)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院。

1.1.3 試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亞砜，成都科隆化學(xué)品有限公司；PBS緩沖液，Life Technologies Corporation。

KH3200V超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；YM-75高壓蒸汽滅菌，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 味連、雅連及其炮制品不同極性部位的制備

將烘干的黃連藥材干燥根莖粉碎，過(guò)20目篩，稱取100 g粉末，用70%甲醇水溶液超聲輔助提取3次，每次1 000 mL，合并提取液，減壓濃縮得粗提物浸膏。加水分散均勻，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，合并后減壓濃縮得甲醇提取物(methanol extracts，ME)、石油醚部位(petroleum ether extract，PE)、乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇部位(n-butanol extract，BE)和水部位(water extract，WE)浸膏，密封保存于4 ℃冰箱[11]。

1.2.2 抗菌初篩供試藥液的制備

將制備所得黃連各部位浸膏，用適量二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解并混合均勻，制成200 mg/mL的各藥材不同極性部位的供試藥液。

1.2.3 菌懸液的制備

在無(wú)菌操作條件下，將活化后的細(xì)菌接種到裝有5 mL PBS緩沖液的試管中，制成濃度約為1×108～2×108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定

在無(wú)菌環(huán)境中，將濾紙片(直徑6 mm)分別浸泡于味連、雅連提取液及不同極性部位的藥液中浸泡4 h，取200 μL濃度約1×108CFU/mL的菌懸液均勻涂布在冷卻凝固的固體培養(yǎng)基上，將供試藥液濾紙片和空白濾紙片(DMSO溶液浸泡)呈等邊三角形貼在培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.5 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定

將味連、雅連及炮制品的甲醇粗提物用兩倍稀釋法制成質(zhì)量濃度梯度為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的供試藥液。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入細(xì)菌菌懸液100 μL，于37 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)后棄去孔內(nèi)液體，用無(wú)菌PBS緩沖液漂洗1次。再向各孔中加入50 μL的不同濃度供試藥液和100 μL的液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)24 h，肉眼觀察每個(gè)孔中是否產(chǎn)生渾濁，未見(jiàn)培養(yǎng)液渾濁的最低藥物濃度即為MIC。每個(gè)梯度的供試藥液重復(fù)3次，并設(shè)陰性對(duì)照組(50 μL空白溶劑)[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果初篩

由表1和圖1可知，4種藥材的提取物原液對(duì)9種腸道致病細(xì)菌都有一定的抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，且具有顯著差異(P<0.05)。4種藥材對(duì)福氏志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、陰溝腸桿菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用(P<0.05)。

表1 藥材提取液原液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果
Table 1 Antibacterial effects of extracts of different medicinal materials on different bacteria

注：n=3±s；表中同列數(shù)據(jù)后的小寫(xiě)英文字母用以表示數(shù)據(jù)經(jīng)最小顯著性差異法(least significant difference，LSD)法相互檢驗(yàn)后差異是否呈顯著，其中若首字母不同表示向下比較差異顯著(P<0.05),首字母相同表示向下比較差異不顯著(P>0.05)，首字母后其他字母相同表示向上比較差異不顯著(P>0.05)(下同)

圖1 四種藥材對(duì)9種腸道致病菌的抑菌效果
Fig.1 Antibacterial effect of 4 medicinal materials on 9 kinds of intestinal pathogenic bacteria

2.2 甲醇提取物及各極性段萃取物的抑菌作用

由表2和圖2可知，4種藥材對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)，即ME>BE>WE>PE>EAE，表明除ME外，對(duì)金黃色葡萄球菌起抑菌效果的成分主要存在于BE和WE部位。味連與雅連相比，無(wú)論是生品還是炮制品，均表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌更強(qiáng)的抑菌性(P<0.05)。4種藥材的ME部位、味連BE、WE部位對(duì)福氏志賀氏菌的抑菌效果最好(P<0.05)，4種藥材的ME部位對(duì)福氏志賀氏菌的抑菌效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，而各極性部位有顯著差異(P<0.05)。對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)的為生雅連和酒雅連的ME和WE部位，且顯著高于生味連和酒味連(P<0.05)，說(shuō)明雅連對(duì)陰溝腸桿菌有更好的抑菌效果。生、酒味連及酒雅連的ME部位對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果最好，且酒雅連ME的抑菌效果強(qiáng)于生雅連ME(P<0.05)，說(shuō)明雅連經(jīng)酒制后，對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果有明顯增強(qiáng)。酒味連ME和BE部位、酒雅連ME部位對(duì)肺炎克雷伯有最好的抑菌效果，且顯著強(qiáng)于生品(P<0.05)，說(shuō)明酒制之后的黃連對(duì)肺炎克雷伯菌有更好的抑菌效果。

通過(guò)比較味連和雅連ME部位的抑菌活性可得，味連對(duì)金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的抑菌性強(qiáng)于雅連(P<0.05)，對(duì)福氏志賀氏菌、肺炎克雷伯抑菌活性兩者差異不顯著(P>0.05)，而對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌性顯著弱于雅連，說(shuō)明黃連的品種不同，對(duì)某些特定的細(xì)菌的抑菌效果亦有不同。

經(jīng)過(guò)酒制后，雅連和味連對(duì)肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明顯增強(qiáng)，而對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌活性減弱，說(shuō)明炮制會(huì)影響黃連對(duì)某些細(xì)菌的抑菌效果。

4種藥材的抑菌活性最強(qiáng)部位為ME部位，除ME外，黃連抑菌效果最強(qiáng)的部位主要存在于BE部位和WE部位。

表2 黃連不同炮制不同極性部位對(duì)腸道致病菌的抑菌效果
Table 2 Antibacterial effects of different polar parts of Coptis herbs on intestinal pathogenic bacterias

注：*表示對(duì)不同腸道致病菌抑菌活性最佳的各極性部位(P<0.05)

2.3 最小抑菌濃度值的測(cè)定

由表3可知，4種黃連對(duì)腸道致病菌均有一定的抑菌活性，其中生味連對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，其MIC值可達(dá)3.125 mg/mL。黃連對(duì)福氏志賀氏菌的MIC值在6.25～12.5 mg/mL左右，而對(duì)其他細(xì)菌MIC值為12.5～25 mg/mL。

a-生味連；b-酒味連；c-生雅連；d-酒雅連
圖2 各黃連的不同極性部位對(duì)5種腸道致病菌的抑菌效果
Fig.2 Antibacterial effects of polar parts of different Coptis herbs on 5 kinds of intestinal pathogenic bacterias

表3 黃連提取液原液對(duì)腸道致病菌的最小抑菌濃度 單位：mg/mL

Table 3 MIC of extracts of Coptis herbs against intestinal pathogenic bacterias

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)分析比較了味連及雅連對(duì)食品中常見(jiàn)9種腸道致病菌的抑菌活性，結(jié)果顯示，黃連表現(xiàn)出廣譜抑菌活性，對(duì)供試菌株均有不同程度的抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)。

研究發(fā)現(xiàn)黃連的品種、炮制前后都會(huì)對(duì)抑菌活性產(chǎn)生影響：味連對(duì)金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果更佳，而雅連對(duì)陰溝腸桿菌抑菌作用更強(qiáng)。經(jīng)過(guò)酒制后，雅連和味連對(duì)肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明顯增強(qiáng)，原因可能是經(jīng)過(guò)酒制，能提高多種生物堿等其他抑菌物質(zhì)的溶出率[14-15]，從而影響抑菌效果，但進(jìn)一步的抑菌機(jī)理和機(jī)制還有待深入探究。

4種中藥飲片的抑菌活性最強(qiáng)的部位為ME部位，說(shuō)明黃連的抑菌效果是多種抑菌物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。除ME外，黃連抑菌效果最強(qiáng)的部位為BE和WE部位，即正丁醇部位和水部位，推測(cè)其主要的抑菌成分是與極性較大的生物堿或者酸性成分有關(guān)[16]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較黃連品種、炮制等因素對(duì)腸道致病菌的抑菌作用影響，但是選取的菌種、黃連的種類及炮制品的種類有限。在下一步的研究中，可進(jìn)一步全面比較黃連品種和不同炮制品之間的抑菌活性差異，為后期對(duì)黃連抑菌成分的單體化合物的靶向分離及鑒定奠定基礎(chǔ)[17-20]，以發(fā)現(xiàn)新的具有較強(qiáng)抑菌活性的天然單體化合物，進(jìn)一步闡釋黃連的抑菌機(jī)理，并對(duì)不同黃連品種的開(kāi)發(fā)利用提供參考。