基于氣相離子遷移色譜的雪蓮菌發(fā)酵乳香氣與雪蓮菌菌群動態(tài)變化研究

雪蓮菌，又名開菲爾粒(Kefir grain)，起源于高加索地區(qū)，呈白色或乳白色，表面卷曲類似花椰菜，外形不規(guī)則，大小不一[1]，在我國西藏也有發(fā)現(xiàn)。雪蓮菌作為一種原生態(tài)復合發(fā)酵劑，其內(nèi)部和表面的微生物組成復雜，極易被生長條件所影響[2]，不同地區(qū)的雪蓮菌，菌群結(jié)構(gòu)也不同。

雪蓮菌發(fā)酵乳是經(jīng)過雪蓮菌發(fā)酵鮮牛乳或羊乳后得到的黏稠狀、味微酸，同時伴有酒精味的發(fā)酵乳[2]。它是經(jīng)過多種微生物共同發(fā)酵的產(chǎn)物，相對于普通的發(fā)酵型酸奶營養(yǎng)更加豐富，而且含有多種揮發(fā)性化合物，具有獨特的香味。目前已經(jīng)有多種研究表明雪蓮菌發(fā)酵乳具有降血壓[3]、改善便秘[4]、降膽固醇[5]、調(diào)節(jié)循環(huán)和呼吸系統(tǒng)功能[6]、防癌抗癌[7]、消炎抗菌[8]等作用。雪蓮菌中混菌體系的作用使雪蓮菌發(fā)酵乳具有獨特的酸醇混合風味[9]，而發(fā)酵乳制品的香氣是決定消費者接受度的一個重要指標，但是目前關(guān)于雪蓮菌發(fā)酵乳香氣的研究報道較少。

頂空氣相色譜-離子遷移色譜聯(lián)用技術(shù)(headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy，HS-GC-IMS)是一種結(jié)合了氣相色譜和離子遷移譜的新型檢測技術(shù)，待測物質(zhì)經(jīng)過氣相色譜預分離以后，經(jīng)過離子遷移色譜二次分離，可以克服GC-MS耗時長，且解譜較難的缺點[10]。相對于其他檢測技術(shù)，氣相離子遷移色譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)具有靈敏度高、現(xiàn)場移動性和實時監(jiān)測的能力[11-12]?，F(xiàn)如今，氣相離子遷移色譜在食品領(lǐng)域中快速發(fā)展，基于其對揮發(fā)性氣體的快速準確檢測，在食品風味分析及香氣指紋圖譜構(gòu)建中顯示出巨大的潛力[13-15]。

本研究通過高通量測序和GC-IMS風味分析，得到了雪蓮菌發(fā)酵乳隨發(fā)酵時間變化的香氣指紋圖譜以及發(fā)酵過程中微生物組成的變化，并對雪蓮菌發(fā)酵乳中微生物種類和其香氣隨時間的改變進行動態(tài)變化分析，揭示了微生物菌群和香氣物質(zhì)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菌種：雪蓮菌菌種產(chǎn)地為西藏林芝地區(qū)；純牛奶，伊利股份有限公司。

儀器：Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯(lián)用儀，德國G.A.S公司；902GP型-80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific；IS-RDD3型恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；GR60DA型滅菌鍋，ZEALWAY儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雪蓮菌活化

將雪蓮菌以2%(質(zhì)量分數(shù))的比例接種于純牛奶中，溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，用無菌紗布封口置于恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)，每24 h更換牛奶。更換牛奶時需將菌種倒在濾網(wǎng)中，用無菌水進行沖洗，直到菌種表面無奶泡附著，再放入錐形瓶中加入適當比例的牛奶循環(huán)發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 雪蓮菌發(fā)酵乳制備

將活化好的雪蓮菌以2%(質(zhì)量分數(shù))接入150 mL純牛奶中，于28 ℃、140 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，分別在0、2、5、8、11、14 d時取樣品10 mL(3個重復)。

1.2.3 GC-IMS測定不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳香氣

樣品處理：不同時間發(fā)酵的雪蓮菌發(fā)酵乳樣品均使用屈臣氏蒸餾水稀釋5倍，且以屈臣氏蒸餾水作為空白對照，各取1 mL置于頂空進樣瓶中，每個樣品取3個重復測定。

頂空條件：孵育溫度為60 ℃；孵育時間15 min；頂空進樣量300 μL；樣針溫度80 ℃；孵育轉(zhuǎn)速500 r/min；

GC-IMS條件：IMS溫度45 ℃；色譜柱FC-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm，1 μm)；柱溫40 ℃；漂移氣和載氣均為高純氮氣(純度≥99.999%)；色譜洗脫程序：0～10 min，(E1)漂流氣流量恒定為150 mL/min；0～2 min內(nèi)，(E2)載氣流量：初始2 mL/min，保持2 min，8 min 內(nèi)增加到20 mL/min，10 min內(nèi)增加到100 mL/min。

1.2.4 雪蓮菌以及不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳中微生物菌群鑒定

對所購買的雪蓮菌菌種進行菌種多樣性檢測，檢測雪蓮菌中是否含有致病菌，并且得到雪蓮菌中的菌種組成。高通量測序委托諾禾致源公司測定，測序選擇細菌16S rDNA的高度可變V3～V4區(qū), 上游引物為5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAA-3′，下游引物為5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′, 提取細菌全基因組DNA后進行PCR擴增和高通量測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

最終數(shù)據(jù)采用OriginPro-2021b軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

HS-GC-IMS風味成分通過GC-IMS Library search 1.0.3軟件進行分析，并采用LAV中Gallery插件構(gòu)建指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段雪蓮菌發(fā)酵乳的特征指紋圖譜

雪蓮菌發(fā)酵乳經(jīng)過GC-IMS檢測以后，一共定性檢測出49種成分(14種未知成分與27種已知成分)，其中8個成分同時存在單體和二聚體。定性的已知成分中有酯類11種、醇類6種、酮類6種、醛類2種、酸類2種，各成分及其氣味描述見表1。

表1 雪蓮菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性化合物及其氣味閾值
Table 1 Volatile compounds in Kefir milk and their odor thresholds

注：后綴“M(monomer)”表示物質(zhì)的單體，“D(dimer)”表示物質(zhì)的二聚體

圖1-a為發(fā)酵不同時間的雪蓮菌發(fā)酵乳中的香氣二維圖譜，紅色豎線為反應(yīng)離子峰(reaction ion peak，RIP)，其右側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性化合物，顏色表示物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越高，可以比較出不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度的差異。其中黃色圓圈標注位置為0 d發(fā)酵樣品的特有揮發(fā)性物質(zhì)，紅色方形標注位置是發(fā)酵不同時間的雪蓮菌發(fā)酵乳中特有揮發(fā)性物質(zhì)變化區(qū)域。經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生很多新的揮發(fā)性物質(zhì)，例如具有水果香味的乙酸丁酯，麥芽香味的異戊酯和發(fā)酵乳的特征香氣物質(zhì)2,3-丁二酮等。

圖1-b是不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳的指紋圖譜，比較揮發(fā)性物質(zhì)之間的相對差異。不同揮發(fā)性物質(zhì)的濃度隨發(fā)酵時間的增加發(fā)生顯著的變化，結(jié)合指紋圖譜可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵0 d時，苯甲酸甲酯、苯甲醛、2-庚酮、2,3-丁二酮等物質(zhì)濃度較高，這些揮發(fā)性物質(zhì)皆是純牛奶的特征性風味物質(zhì)，主要是加熱滅菌的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。發(fā)酵2 d后，上述化合物濃度明顯降低。隨發(fā)酵時間的延長，出現(xiàn)大量新的揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇酯類物質(zhì)較多，如異戊醇、乙醇、2-甲基-1-丙醇等醇類物質(zhì)，乙酸異戊酯、乙酸丁酯、異丁酸乙酯等酯類物質(zhì)。其中異戊醇帶有花香味和酒精味，乙醇和異戊醇的存在使雪蓮菌發(fā)酵乳被稱為“乳中香檳”，兩種醇類物質(zhì)在一般發(fā)酵乳內(nèi)較少檢出，但是本研究采用的雪蓮菌是一種原生態(tài)復合發(fā)酵劑，故出現(xiàn)以上兩種醇類物質(zhì)，賦予雪蓮菌發(fā)酵乳獨特的風味。發(fā)酵至第5天時，作為發(fā)酵乳特征性風味物質(zhì)的2,3-丁二酮濃度顯著增高。發(fā)酵8 d以后，帶有香蕉香味的乙酸異戊酯、帶有青草味的正己醛和帶有水果香味的2-己酮、以及乙酸異丁酯和辛酸乙酯等帶有良好香味的物質(zhì)濃度增加且發(fā)酵至第11天時，以上帶有積極香氣的化合物濃度皆大幅度降低。高薇等[17]對兩種不同地理來源的西藏開菲爾粒的發(fā)酵乳中揮發(fā)性物質(zhì)進行測定，在兩種發(fā)酵乳中檢測到7種酯類，其中乙酸苯乙酯是A發(fā)酵乳中特有，乙酸異戊酯是B發(fā)酵乳中特有，兩種發(fā)酵乳中酯類化合物的總香氣活力值(odor activity value，OVA)遠高于其他4種化合物，表明酯類是兩種發(fā)酵乳中最重要的香氣貢獻化合物。而雪蓮菌發(fā)酵乳發(fā)酵至8 d后大多數(shù)酯類物質(zhì)濃度降低，且發(fā)酵至14 d時，帶有刺激性氣味的丙酸濃度逐漸增大，且酒精濃度也逐漸增大，可能會給雪蓮菌發(fā)酵乳風味帶來具有消極影響的香氣。故在雪蓮菌發(fā)酵乳的實際生產(chǎn)中，發(fā)酵至第8天時，雪蓮菌發(fā)酵乳香氣最為豐富，帶有積極香氣的揮發(fā)性化合物最多，若持續(xù)發(fā)酵，則會損失部分重要的香氣貢獻化合物，且產(chǎn)生帶有刺激性氣味的化合物，進而影響雪蓮菌發(fā)酵乳的風味。

a-不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳的二維圖譜； b-不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳的特征圖譜
圖1 不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳的二維圖譜與指紋圖譜
Fig.1 Two-dimensional chromatogram and fingerprint of Kefir milk of different fermentation

2.2 主成分分析(principal component analysis，PCA)

對不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳進一步做PCA，如圖2所示。前兩個主成分可以反映所有信息的87.9%，說明兩個主成分可以代替原始的樣品信息。從PCA中可以看出，每3個重復樣本聚在一起，說明重復性較好。不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳揮發(fā)性化合物含量有所波動，其中發(fā)酵0 d的樣品聚集在一起，發(fā)酵2、5、8 d的樣品較為鄰近，發(fā)酵11、14 d的樣品相鄰。PCA的結(jié)果與香氣物質(zhì)指紋圖譜中得到的結(jié)論相似，隨著發(fā)酵時間的延長，香氣的濃度和種類都會發(fā)生變化，發(fā)酵至第8天大多數(shù)香氣物質(zhì)達到最高濃度，發(fā)酵至11 d開始大幅下降。

圖2 不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳PCA圖
Fig.2 PCA of Kefir milk in different fermentation days 注：相同樣品有3個生物學重復

2.3 雪蓮菌及雪蓮菌發(fā)酵乳中微生物菌群動態(tài)變化規(guī)律

雪蓮菌菌種的高通量測序結(jié)果表明，在種分類水平下可以得出所使用的雪蓮菌菌種由乳桿菌屬(Lactobacillus)和醋酸菌屬(Acetobacter)組成，但是主要以乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，醋酸菌屬(Acetobacter)豐度只有0.01，同時沒有檢測出致病菌及其他有害菌，符合已報道的雪蓮菌菌種特征[18]。同時也可以保證此雪蓮菌菌種可以用于發(fā)酵健康食品。圖3為不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳16S rDNA高通量測序結(jié)果，可以看出乳桿菌是優(yōu)勢菌屬，占所有雪蓮菌微生物種群的92%以上，醋酸桿菌屬于亞優(yōu)勢，占微生物種群的1%～8%，結(jié)果與其他研究結(jié)果相似[19]。0 d發(fā)酵(對照)時各種細菌的相對豐度較高，此結(jié)果與丁瑞雪等[20]的研究結(jié)果一致，純牛奶中含有例如不動細菌屬(Actinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等微生物。發(fā)酵開始以后，純牛奶中的原始菌群的豐度降低，Lactobacillus和Acetobacter豐度急劇升高。乳桿菌為厭氧發(fā)酵，且能夠利用乳糖而生長速度較快，進行耗氧發(fā)酵的醋酸菌則生長緩慢。發(fā)酵前期Lactobacillus占據(jù)發(fā)酵的主導地位，相對豐度較高，香氣物質(zhì)增多。但隨著發(fā)酵時間增長，供氧量增大，故Acetobacter相對豐度逐漸增加，隨著發(fā)酵時間延長，醋酸桿菌的數(shù)量逐漸增多。

圖3 不同發(fā)酵時間的雪蓮菌發(fā)酵乳高通量測序結(jié)果
Fig.3 Sequencing results of Kefir milk amplicon in different fermentation days

2.4 雪蓮菌發(fā)酵乳的香氣與微生物菌群的動態(tài)變化關(guān)系解析

圖4通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析雪蓮菌發(fā)酵過程中乳桿菌屬和醋酸桿菌屬與雪蓮菌發(fā)酵乳的香氣之間的相關(guān)性，圖中紫色代表正相關(guān)，橙色代表負相關(guān)，圓點的大小代表相關(guān)性，圓點越大，其相關(guān)性越大。

圖4 雪蓮菌發(fā)酵乳中主要菌屬與香氣的相關(guān)性
Fig.4 Correlation between main bacteria and volatile substances in Kefir milk

乳桿菌發(fā)酵和部分揮發(fā)性物質(zhì)皆有相關(guān)性。乳桿菌在乳制品風味開發(fā)中主要通過乳糖、乳酸和檸檬酸的代謝，以及解離脂肪酸和蛋白質(zhì)分解來調(diào)控或產(chǎn)生揮發(fā)性化合物。乳桿菌將乳糖分解和檸檬酸鹽代謝后，形成乙醇、乳酸和一些C4揮發(fā)性風味物質(zhì)。其中，檸檬酸鹽作為乳制品的特征風味物質(zhì)2,3-丁二酮和乙偶姻的前體物質(zhì)，可以通過乳桿菌發(fā)酵進行降解得到。乳桿菌與苯甲酸甲酯、苯乙酮、苯甲醛和羊油酸(正己酸)等呈顯著負相關(guān)。李娟等[21]在復原乳的樣品中檢測到相對含量較高的苯甲醛，在發(fā)酵過程中，乳桿菌菌體自身代謝的各種酶作用于苯丙氨酸，使得苯甲醛的含量發(fā)生變化，對于雪蓮菌發(fā)酵乳的香氣有一定的調(diào)和作用。而酮類化合物和有機酸類化合物生成，則與乳桿菌分解氨基酸及解離脂肪酸有關(guān)[22]。高濃度的羊油酸呈辛辣味、酸味，通過研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌在發(fā)酵過程中可以降低其濃度，其機制有待深入研究。

乳桿菌與異戊醇、乙酸乙酯、乙醇等呈顯著正相關(guān)，乙醇是具有乙醇脫氫酶活性的異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵的結(jié)果[23]，發(fā)酵后期，乙醇含量和供氧量的增多可能導致乳桿菌生長受到抑制，同時醋酸桿菌可以利用乙醇和氧氣進行大量繁殖。醋酸桿菌屬與異辛醇、乙酸丁酯、丙酸、2-甲基-1-丙醇等呈顯著正相關(guān)，在發(fā)酵過程中，醋酸桿菌影響香氣物質(zhì)的數(shù)量和程度均少于乳桿菌，故認為醋酸桿菌相比較乳桿菌對雪蓮菌發(fā)酵乳的香氣影響較小。

3 結(jié)論

本研究通過GC-IMS技術(shù)和微生物菌群分析，揭示了在雪蓮菌發(fā)酵乳的發(fā)酵過程中乳桿菌和醋酸桿菌是發(fā)酵優(yōu)勢菌，同時獲得了發(fā)酵不同時間的雪蓮菌發(fā)酵乳香氣指紋圖譜。通過GC-IMS測定得到49種揮發(fā)性物質(zhì)，其中2-己酮、正己醛等可以被判定為發(fā)酵開始的標志物。發(fā)酵到第8天時，雪蓮菌發(fā)酵乳中香氣物質(zhì)含量和種類最豐富，發(fā)酵至11 d時，香氣物質(zhì)種類和含量大幅減少，乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、2-己酮等帶有水果香氣的化合物含量降低，且持續(xù)發(fā)酵會產(chǎn)生帶有刺激性氣味的丙酸等化合物。故發(fā)酵8 d時的雪蓮菌發(fā)酵乳含有最豐富的香氣物質(zhì)。通過皮爾遜相關(guān)性系數(shù)分析，解析出了雪蓮菌發(fā)酵乳發(fā)酵過程的動態(tài)變化關(guān)系，揭示了主要菌種和特征香氣物質(zhì)的關(guān)系。乳桿菌在發(fā)酵前期作為優(yōu)勢菌株，與苯甲酸甲酯、苯乙酮等呈顯著負相關(guān)，與異戊醇、乙酸乙酯等呈顯著正相關(guān)，說明其對雪蓮菌發(fā)酵乳香氣貢獻較大。隨著發(fā)酵時間的延長，醋酸桿菌的豐度逐漸增加，并與異辛醇、乙酸丁酯、丙酸、2-甲基-1-丙醇等4種物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。GC-IMS和微生物菌群分析有助于評估雪蓮菌發(fā)酵乳的香氣和微生物菌群的動態(tài)變化關(guān)系。本研究為加強雪蓮菌發(fā)酵乳的質(zhì)量控制和雪蓮菌發(fā)酵乳工業(yè)化生產(chǎn)過程中動態(tài)調(diào)控其風味與香氣提供參考依據(jù)。