基于金屬有機框架載體的免疫球蛋白G印跡材料的構(gòu)筑及其識別性能研究

人免疫球蛋白G (Ig G，純度95%，M_w=150 kDa，pI=8.0)，辣根過氧化物酶(HRP，純度98%，M_w = 40 kDa，pI=7.2)，卵清白蛋白(OVA，純度98%，M_w = 45 kDa，pI=4.7)，人血清白蛋白(HSA，純度98%，M_w = 66 kDa，pI=4.8)和細胞色素C (Cyt C，>純度95%，M_w=10.5 kDa，pI=12.5)購自Sigma-Aldrich公司. 四氯化鋯(ZrCl₄)和2-氨基對苯二甲酸(H₂BDC-NH₂)，分析純，購自上海麥克林生物化學(xué)技術(shù)有限公司；N,N,N',N'-四甲基二胺(TEMED，純度98%)、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，純度98%)、丙烯酰胺(AAm，純度98%)、甲基丙烯酸(AM，純度98%)、過硫酸銨(APS，純度98%)購自國藥化學(xué)試劑有限公司；3-二甲基-(甲基丙烯酰氧乙基)丙烷磺酸銨(SBMA，純度99%)和甲基丙烯酸酐(MA，分析純)購自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；整個過程中都使用去離子水；所有其他溶劑和洗脫劑，如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，氯仿和乙醇至少是分析級的，無需進一步處理即可使用.

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)采用Bruker公司所生產(chǎn)的TENSOR27型號FTIR分光計來測量. X射線光電子能譜(XPS)采用Kratos Axis Ultra DLD儀器來測量樣品的化學(xué)組成. 樣品的晶體結(jié)構(gòu)通過Bruker公司生產(chǎn)的D8 Advance型X射線衍射儀(XRD)來檢測. 熱重(TG)表征通過日立公司的STA200RV型熱重分析儀來測試. 紫外吸收光譜(UV)通過紫外分光光度計(Varian, Cary-1E)來測量. 材料的動態(tài)光散射(DLS)檢測通過Malvern公司的Zetasizer Nano ZS來完成，該設(shè)備配備了波長為633 nm的激光，散射角為173°. 電子掃描顯微鏡(SEM)的測試采用Oxford公司生產(chǎn)的Inca Oxford型號電子掃描顯微鏡來完成. 材料的比表面積通過Micromeritics公司的ASAP 2460型氮氣吸附-解析儀通過Brunauer-Emmett- Teller (BET)方法來測量. 采用DYY-6C電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測.

通過溶劑熱法合成了UIO-66納米粒子^[14]，具體實驗過程如下：首先，在三頸圓底燒瓶中混合191 mg ZrCl₄、146 mg H₂BDC-NH₂和82 mL DMF；然后，在攪拌下加入4.83 g乙酸，反應(yīng)體系在25 ℃下攪拌30 min；隨后，將混合物轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)膽的不銹鋼高壓釜中，將高壓釜放入馬弗爐中于120 °C加熱24 h；冷卻后，將納米顆粒用DMF和甲醇分別洗滌3次，并在60 ℃下真空干燥. 為了在其表面引入乙烯基官能團，將0.60 g UIO-66納米粒子進一步分散在50 mL氯仿中，隨后添加2.46 g甲基丙烯酸酐和0.20 g三乙胺. 將混合物在55 ℃下攪拌并回流24 h后，將產(chǎn)物離心并用氯仿洗滌3次，并在60 ℃下真空干燥過夜，獲得乙烯基官能團功能化的UIO-66-MA.

將20 mg的UIO-66-MA納米顆粒靜置于10 mL含濃度為3 mg/mL Ig G的磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，10 mmol/L). 25 ℃恒溫震蕩3 h后，通過離心分離納米顆粒，并用去離子水洗滌. 隨后，將負載Ig G的UIO-66納米顆粒分散在10 mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，10 mmol/L)中，隨后加入35.5 mg AAm，34.4 mg AM，10 mg MBA和一定質(zhì)量的SBMA. 將預(yù)聚合溶液在25 °C下靜置1 h，然后添加20 μL TEMED和20 mg APS. 反應(yīng)溶液在25 ℃下將攪拌24 h后，將產(chǎn)物離心. 在室溫下用0.5 mol/L的NaCl溶液和乙酸溶液(6.0 vt%)交替洗滌，直至洗脫液無法在紫外分光光度計中檢測到蛋白特征峰強度(280 nm). 最后，用去離子水洗滌并冷凍干燥后得到UIO-66@MIPs. 非印跡材料(UIO-66@NIPs)的制備過程采用與UIO-66@MIPs相似的流程，但不添加模板蛋白Ig G.

本文以UIO-66為載體，AM、AAm和兩性離子單體SBMA作為功能單體組，MBA作為交聯(lián)劑，通過表面印跡技術(shù)結(jié)合蛋白固定化策略的方法，用于構(gòu)筑高性能Ig G印跡材料(UIO-66@MIPs)，如圖1所示. 由于UIO-66材料自身極高的比表面積、表面豐富的氨基官能團、苯環(huán)結(jié)構(gòu)以及不飽和的鋯離子，應(yīng)能夠通過氫鍵、靜電、π-π堆疊等作用，對Ig G產(chǎn)生優(yōu)異的固載量. 因而，由大量負載Ig G的MOF而制備的聚合物材料，在Ig G洗脫后，將形成眾多的、與模板蛋白在形狀、大小以及官能團相互匹配的印跡孔穴，最終有利于MIPs在吸附量和識別性的高性能表現(xiàn). 此外，將兩性離子單體(SBMA)引入到印跡層的構(gòu)筑過程中，理論上能有效減少印跡材料對蛋白質(zhì)的非特異性吸附.

  

Fig. 1  Schematic illustration of the preparation of UIO-66@MIPs.

通過FTIR表征了所制備材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2(a)所示. 在原始UIO-66的譜圖中，位于3452，3345，1255和766 cm^-1的峰分別對應(yīng)于UIO-66中氨基(―NH₂)的對稱和反對稱伸縮振動，碳氮鍵(C_ar―N)伸縮振動以及N－H的擺動振動^[15]. 而在1669和1504 cm^-1位置處的特征峰為羰基的不對稱和對稱伸縮振動. 與原始UIO-66相比，UIO-66-MA光譜圖在1664 cm^-1處的峰強度明顯增強，這應(yīng)該是甲基丙烯酸酐改性所引起的^[16]. 此外，UIO-66@MIPs的紅外光譜圖除了具備上述特征峰之外，在1042 cm^-1處出現(xiàn)了新的特征峰，它對應(yīng)于兩性離子官能團中SO₃^-的伸縮振動^[17].

  

Fig. 2  FTIR spectra (a), XPS spectra (b), TGA curves (c) and XRD patterns (d) of UIO-66, UIO-66-MA, and UIO-66@MIPs.

采用XPS來表征所制備材料的元素組成，結(jié)果顯示于圖2(b). 可以發(fā)現(xiàn)，原始UIO-66和UIO-66-MA在398.54 eV和182.38，329.56，343.22，429.92 eV位置處，分別為N元素和Zr元素的結(jié)合能^[18]. 在UIO-66-MA表面進行聚合后，UIO-66@MIPs在167.81 eV處出現(xiàn)了S元素的特征峰，證明了兩性離子官能團的存在. 此外，從TGA分析結(jié)果(圖2(c))也可以發(fā)現(xiàn)，印跡材料比UIO-66和UIO-66-MA在100~600 ℃范圍內(nèi)具有更大的熱失重，這應(yīng)該是上述材料表面含有聚合物層的原因所致. 另外，XRD分析結(jié)果(圖2(d))也表明UIO-66@MIPs在2θ=7.34°，8.48°處，存在與UIO-66和UIO-66-MA晶體一致的特征峰^[18]. 因而，上述表征的綜合結(jié)果可以說明UIO-66@MIPs已被成功制備.

SEM和DLS分別用于材料的形貌和粒徑的表征. 如圖3(a)和3(b)所示，UIO-66和UIO-66-MA晶體呈現(xiàn)出規(guī)則的正八面體形狀，并且結(jié)合圖4(a)中DLS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們的平均粒徑尺寸為143和138 nm. 此外，不論從SEM圖還是DLS圖結(jié)果都說明，UIO-66和UIO-66-MA具有極好的單分散性. 與之相比，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的SEM圖(圖3(c)和3(d))顯示出UIO-66被新的物質(zhì)包覆，并且材料顯示出明顯的團聚現(xiàn)象. 這一現(xiàn)象也與DLS結(jié)果(圖4(a))一致. 這可能是UIO-66極大的比表面積和極高的表面能，使其在后續(xù)印跡過程中發(fā)生了嚴重的團聚現(xiàn)象所致.

  

Fig. 3  SEM images of UIO-66 (a), UIO-66-MA (b), UIO-66@MIPs (c) and UIO-66@NIPs (d).

  

Fig. 4  DLS (a) and N₂ adsorption-desorption isotherms (b) of UIO-66,UIO-66-MA, UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs.

為了進一步研究所制備材料的孔結(jié)構(gòu)和比表面積，所制備的材料用于氮氣吸附-脫附等溫實驗，結(jié)果如圖4(b)和表1所示. 從圖中可以發(fā)現(xiàn)，含UIO-66晶體的4種材料都呈現(xiàn)出典型的I型吸附脫附等溫曲線，說明了它們含有微孔結(jié)構(gòu)^[19].

此外，相應(yīng)BET、平均孔徑和孔隙體積數(shù)據(jù)如表1所示，原始UIO-66和UIO-66-MA能夠顯示出優(yōu)異的比表面積648.3和627.9 m²/g，并且它們的平均孔徑為2.132和2.118 nm，說明lg G蛋白與UIO-66晶體的結(jié)合應(yīng)該發(fā)生在材料表面. 此外，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的比表面積和孔體積與UIO-66和UIO-66-MA相比明顯降低，這也與上述SEM表征結(jié)果相符. 盡管這樣，印跡和非印跡材料的比表面積依然達到較高的362.5和357.9 m²/g，這對于它們高效分離目標蛋白具有積極作用.

本文將兩性離子單體SBMA用于MIPs的制備，以降低該材料對蛋白的非特異性結(jié)合. 因此，SBMA用量對UIO-66@MIPs吸附量和識別性的影響被進一步探究. 如圖5所示，不加入SBMA的MIPs對Ig G的吸附量可達到306.9 mg/g，明顯優(yōu)于之前報道的Ig G印跡凍膠55.1和106.1 mg/g的最大吸附量^[20,21]. 這應(yīng)該歸因于UIO-66載體極大的比表面積，使得所制備的UIO-66@MIPs具有更多的作用位點所致. 然而，在不加入SBMA的情況下，UIO-66@NIPs亦能對Ig G產(chǎn)生較大的吸附量，因而，該制備條件下的UIO-66@MIPs印跡因子只有1.63. 隨著SBMA用量的增加，MIPs和NIPs的吸附量逐漸降低，這應(yīng)該是由于兩性離子官能團的存在可以通過溶劑化作用和氫鍵形成水殼層，因此減弱了吸附劑與蛋白之間的相互作用. 此外，可以發(fā)現(xiàn)隨著SBMA用量的增加，所制備MIPs的識別性出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象. 這可能是因為當?shù)鞍住岸栊浴弊饔脝误wSBMA用量較低時，它不能像其他功能單體一樣通過靜電、氫鍵等作用與模板蛋白進行結(jié)合. 因而，MIPs中的兩性離子基團主要分布在印跡孔穴之外的材料區(qū)域，降低了其對蛋白的非特異性吸附，提高了識別性^[12,13]. 進一步增加SBMA用量，可能導(dǎo)致它會同時參與到印跡孔穴和孔穴之外的區(qū)域構(gòu)筑，因此降低印跡孔穴對模板蛋白的結(jié)合，最終可能會減弱UIO-66@MIPs的識別能力^[22,23]. 為了獲得最佳的識別性，占功能單體總質(zhì)量20%的SBMA用量成為制備UIO-66@MIPs的最優(yōu)條件.

  

Fig. 5  Effect of SBMA dosage on adsorption capacity and recognition of UIO-66@MIPs. The concentration of Ig G is 2.0 mg/mL, and adsorption time is 50 min. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

吸附動力學(xué)實驗用來研究吸附時間對MIPs和NIPs吸附性能的影響. 如圖6(a)所示，在初始40 min內(nèi)，UIO-66@MIPs 對2.0 mg/mL Ig G溶液的吸附量明顯高于UIO-66@NIPs，說明UIO-66@MIPs與Ig G之間作用力更強. 這應(yīng)該是印跡材料中形成了與模板分子在形狀和大小相互匹配的印跡孔穴所致. 在吸附40 min后，UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附速率逐漸降低，最終在50 min左右達到吸附平衡. UIO-66@MIPs較快的吸附平衡時間可能是由于本工作中采用了表面印跡技術(shù)，降低了蛋白在聚合物層的傳質(zhì)阻力所致. 因此，本文后續(xù)的吸附實驗采用50 min作為最佳吸附實驗條件.

  

Fig. 6  Adsorption kinetics (a) and isotherm curves (b) of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

吸附等溫實驗用來研究UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs的吸附量隨Ig G初始濃度變化的影響. 如圖6(b)所示，2種材料的吸附量隨著蛋白濃度的增加而增大. 并且UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs分別在1.5和2.0 mg/mL分別達到飽和吸附. 此外，UIO-66@MIPs的飽和吸附量(217.4 mg/g)明顯高于UIO-66@NIPs的值(87.6 mg/g)，印跡因子IF可達2.48. 這進一步證明UIO-66@MIPs中存在對Ig G具有識別作用的印跡孔穴. 因此，為了更好地對比印跡和非印跡材料，如無特殊說明，本工作中后續(xù)吸附實驗的Ig G濃度選為2.0 mg/mL.

為了研究上述MIPs和NIPs對Ig G的吸附機理，本工作分別采用Langmuir吸附模型和Freundlich吸附模型對吸附等溫曲線進行擬合. Langmuir吸附模型描述的是在吸附劑表面形成飽和單分子層的過程，而Freundlich吸附模型通常用于模擬非均相吸附劑表面的吸附現(xiàn)象. Langmuir吸附模型公式為c_e/Q_e = 1/K_LQ_m + c_e/Q_m，K_L是親合常數(shù)，而是Q_m理論最大吸附量. Freundlich吸附模型公式為InQ_e = InK_f + (1/n)InC_e，K_f和1/n分別是與Freundlich模型擬合相關(guān)的吸附量和吸附強度. 擬合結(jié)果如表2所示. 可以發(fā)現(xiàn)，印跡和非印跡材料對Langmuir吸附模型擬合的R²均大于Freundlich吸附模型，說明UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs對Ig G的吸附行為應(yīng)是以單分子層吸附為主. 此外，可以看到UIO-66@MIPs對Ig G的親合常數(shù)K_L與理論最大吸附量Q_m都明顯高于UIO-66@NIPs，這進一步證明印跡材料中存在眾多的、能夠與Ig G相互匹配的印跡孔穴，能夠?qū)崿F(xiàn)它對模板蛋白的吸附識別.

UIO-66@MIPs的選擇吸附性能可以通過它們對模板蛋白和參比蛋白的比較來獲得. 本文以不同分子量和等電點的HRP (M_w= 40 kDa，pI=7.2)，OVA (M_w= 45 kDa，pI=4.7)，HSA (M_w= 66 kDa，pI=4.8)和Cyt C (M_w= 10.5 kDa，pI=12.5)分別作為參比蛋白. 如圖7所示，UIO-66@MIPs對模板蛋白Ig G的印跡因子IF值遠高于對其他蛋白，再次說明了MIPs中存在與Ig G大小和官能團相互匹配的印跡孔穴. 此外，與其他參比蛋白相比，印跡材料和非印跡材料具有對Cyt C更高的吸附量，這可能是由于其較小的分子體積以及較高的等電點pI，使其能夠較為容易地與UIO-66@MIPs表面和印跡孔穴中的羧基官能團產(chǎn)生作用. 即使這樣，UIO-66@MIPs對Cyt C的選擇性因子β依然大于2.3，說明其具有優(yōu)異的蛋白選擇性.

  

Fig. 7  Selective adsorption experiment of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. Significance: ns ≡ not significant (p≥0.05), * ≡ significant (p<0.05).

UIO-66@MIPs的特異識別性采用SDS-PAGE來檢測. 如圖8所示，第2列條帶痕跡為含有2 mg/mL的HSA和Ig G混合蛋白溶液，第3和第4列條帶分別為從UIO-66@MIPs和UIO-66@NIPs中洗脫的蛋白. 可以發(fā)現(xiàn)，從第3列UIO-66@MIPs中洗脫的蛋白，在150 kDa處的痕跡顏色明顯比第4列條帶中UIO-66@NIPs相同位置處的痕跡深，同時UIO-66@MIPs在66 kDa處的蛋白痕跡又淺于UIO-66@NIPs. 說明與非印跡材料相比，所制備的印跡材料能夠在蛋白混合溶液中更好地識別和分離Ig G蛋白. 這也證明了本文所制備UIO-66@MIPs可應(yīng)用于含Ig G樣本實際檢測和分離的良好潛力.

  

Fig. 8  SDS-PAGE analysis of competitive adsorption of UIO-66@MIPs and UIO-66@NIPs. (Lane 1, protein molecular weight marker; Lane 2, the mixture solution of Ig G and HSA with each concentration of 2.0 mg/mL; Lane 3, the protein eluted from UIO-66@MIPs; Lane 4, the protein eluted from UIO-66@NIPs).