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植物源抗凍蛋白對面筋蛋白性質影響研究進展

作者:張艷杰 王金慧 艾志錄 范會平來源:《食品與發(fā)酵工業(yè)》日期:2022-06-13人氣:2138

抗凍蛋白(antifreeze proteins, AFPs)又稱熱滯蛋白或是冰結構蛋白,可以抑制冰晶的生長,非依數性降低水溶液的冰點,但不改變溶液熔點,其在動植物、真菌和細菌中廣泛存在[1]。植物源抗凍蛋白是植物在外界環(huán)境發(fā)生改變時植物本身為了使細胞免受迫害而產生的一種功能性蛋白。不同植物體內的抗凍蛋白的分布是不同的,但是它們都具有一定的抗凍活性。GB 2760—2011指出AFPs可以作為一類新型的食品添加劑運用到冷凍食品中,植物源AFPs逐漸成為研究熱點[2]。

AFPs具有熱滯活性、能修飾冰晶形態(tài)及抑制冰晶再結晶3個重要特征[3]。而植物源AFPs抑制冰晶再結晶的能力最強[4],因此植物源AFPs似乎更適合添加到冷凍食品中,通過抑制冰晶重結晶,減輕食品在零點以下附近波動產生的機械損傷,從而減輕其在凍藏或凍融過程中受到的機械損傷。本文從植物源AFPs的來源、特性以及對面筋蛋白性質的影響進行闡述。

1 植物源抗凍蛋白的概述

1.1 植物源抗凍蛋白的來源

迄今為止,可以檢測到含有抗凍蛋白的植物已有60多種[5],其中有近20種已經被純化出來。經過研究統(tǒng)計發(fā)現,植物源抗凍蛋白的熱滯活性大多是<1 ℃,如苜蓿抗凍蛋白的熱滯活性為0.52~0.54 ℃,胡蘿卜抗凍蛋白的熱滯活性為0.35~0.65 ℃。某些植物源抗凍蛋白還有其他的性質,如屬于PR-10家族的樟子松的細胞中存在糖基化現象,可維持穩(wěn)定性;沙冬青抗凍蛋白中存在過敏原等。本文對不同植物源抗凍蛋白植物類型、來源、性質及同源性蛋白進行了整理,如表1所示。植物源抗凍蛋白具有一定的熱滯活性,多數是在0.1~1.0 ℃,云杉和女貞的抗凍蛋白的熱滯活性較高,分別為2.19、2 ℃;桃中發(fā)現的抗凍蛋白的熱滯活性較低,只有0.06 ℃??箖龅鞍纂m然在來源上相似,但是同源性不明顯。

表1 植物源抗凍蛋白的來源、性質及同源性蛋白
Table 1 Sources, properties and homologous proteins of plant antifreeze proteins

續(xù)表1

注:-,目前未有研究苜蓿AFPs的同源性蛋白

1.2 抗凍蛋白的特性

1.2.1 熱滯活性

像蔗糖、NaCl等一般溶液的冰點和固液兩相蒸氣壓平衡時的溫度相等同,這時熔點及冰點是相同的??箖龅鞍讓ξ锪系慕Y冰和熔化過程的影響是不一樣的,主要影響結冰過程,導致冰點比熔點低,這種差值稱為熱滯差值,抗凍蛋白能引起溶液的冰、熔點間差值的作用稱為熱滯活性,如圖1所示。在一定范圍中,抗凍蛋白的熱滯活性可以使得生物體的細胞處于不凍的狀態(tài),從而避免冰晶在形成過程中對細胞膜的破壞。

圖1 抗凍蛋白熱滯活性示意圖[30]
Fig.1 Schematic diagram of thermal hysteresis activity of antifreeze proteins[30]

1.2.2 修飾冰晶形態(tài)

抗凍蛋白能夠和冰晶直接作用,不僅能抑制冰晶的生長,還能改變冰晶形態(tài),減弱冰晶對細胞膜造成的機械損傷。根據熱滯活性的高低,可將抗凍蛋白分為高、中熱滯活性抗凍蛋白。不同熱滯活性的抗凍蛋白和冰晶的結合位點不一樣,中熱滯活性的抗凍蛋白結合在冰晶的棱柱面或者是棱錐面上,高熱滯活性的抗凍蛋白則是結合在冰晶的棱錐面之外、棱柱面之外和基面上,從而形成不同形態(tài)的冰晶。高熱滯活性的抗凍蛋白和中熱滯活性的抗凍蛋白形成的冰晶形態(tài)分別是似圓盤形狀和六棱錐形狀[31-34]。其示意圖如圖2所示。

1.2.3 抑制重結晶

在冰點溫度下,含水物料中的小冰晶會逐漸聚集成大冰晶,而大冰晶在一定程度上對物料組織的破壞程度也較大。溫度的波動會加劇冰晶的重結晶現象,使得已經形成的冰晶在生長上重新分配,導致冰晶數量減少,顆粒增大,細胞組織的破壞加劇,導致生物體受到致病傷害。添加抗凍蛋白對冰晶的再結晶有抑制作用,使得物料中的冰晶較小且分布均勻[35]。有報道稱植物源抗凍蛋白具有較強抑制冰晶重結晶能力[4]。

1.2.4 原生質體的過冷狀態(tài)

添加抗凍蛋白可通過調節(jié)原生質體過冷狀態(tài)、降低物料過冷點及增加冰晶成核率,來形成大量的小冰晶[36]

2 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白性質的影響

為了方便面團的運輸和儲藏,常將其預制成半成品并進行冷凍儲藏,對冷凍面團進行解凍后,即可進行后續(xù)的加工熟制環(huán)節(jié)[37]。冷凍面團很大程度上解決了傳統(tǒng)面團加工儲藏中貨架期短和易老化的難題,

a-未添加抗凍蛋白;b-添加高熱滯活性抗凍蛋白;c-添加中熱滯活性抗凍蛋白[31-34]
圖2 冰晶形態(tài)示意圖
Fig.2 Diagram of ice crystal morphology

市場對冷凍面團的需求不斷增加。面團經過冷凍后抗凍性差、酵母的持氣能力降低[38],面團容易出現萎縮、硬化、變色以及開裂等現象。面筋蛋白是冷凍面團的重要組分之一,影響著冷凍面團的品質發(fā)展。植物源抗凍蛋白作為一種冷凍保護劑,可添加到面筋蛋白中,用以改善面團在冷凍儲藏中品質的劣變。

2.1 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白結構性質影響

2.1.1 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白二硫鍵含量的影響

二硫鍵是由2個巰基氧化反應生成的—S—S—鍵,對形成和維持蛋白質分子結構起到重要的作用,二硫鍵的存在加速了氨基酸殘基之間的結合,肽鍵之間相互靠攏,疏水性氨基酸殘基會圍繞著二硫鍵形成疏水中心,使得蛋白質的高級結構更加穩(wěn)定[39]。

石媛媛[40]研究發(fā)現隨著凍藏時間延長,面筋蛋白中二硫鍵含量呈下降趨勢,可能是面筋蛋白在凍藏過程中二硫鍵被破壞,但是添加抗凍蛋白組和對照組相比,下降趨勢降低,這和抗凍蛋白保護二硫鍵,維持面筋蛋白特性有關。同樣,凍融處理過程中,二硫鍵含量變化與凍藏處理趨勢一致,但變化幅度遠高于凍藏,這與凍融處理對面筋蛋白破壞更加嚴重有關。楊震[41]研究發(fā)現與新鮮的面團相比,凍融循環(huán)后自由巰基含量顯著性增加,這可能是因為凍融過程中溫度的波動引起冰晶重結晶和水分遷移,加速了分子間相互作用,引起二硫鍵弱化和斷裂,自由巰基含量上升。而添加黑麥菜抗凍蛋白面團的自由巰基含量比對照組顯著降低,說明黑麥菜抗凍蛋白抑制重結晶的特性減緩了蛋白分子的物理破壞,延緩了自由巰基含量增加的趨勢。

2.1.2 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白微觀結構的影響

新鮮面筋蛋白有三維網絡結構,孔洞致密均勻,隨著凍藏時間延長和凍融次數增加,面筋蛋白致密的空間網絡結構會受到破壞,出現不連續(xù)、開裂及孔洞的增加,主要原因是在凍藏和凍融過程中面筋蛋白脫水,使得冰晶數量增加和重結晶[42]。冷凍干燥過程是冰晶在原位上直接升華,孔洞的大小在一定程度上可用來表征凍藏和凍融過程中冰晶聚集和大小情況。

張艷杰[18]研究凍結處理的面筋蛋白微觀結構時,發(fā)現對照組的面筋蛋白網絡疏松,孔洞大、不均勻,添加燕麥抗凍蛋白的面筋蛋白網絡結構較緊密,孔洞相對小且均勻。在凍藏中水分發(fā)生結晶及重結晶形成大冰晶對面筋蛋白造成不可逆轉的破壞,冰晶融化或是升華后面筋蛋白網絡結構中會出現大孔洞。說明燕麥抗凍蛋白可修飾冰晶形態(tài),抑制冰晶重結晶,預防出現大冰晶。為期一個月的凍藏過程中,添加燕麥抗凍蛋白會使孔洞變少變小,降低面筋蛋白被破壞的程度,說明燕麥抗凍蛋白在一定程度上可以保護面筋蛋白在凍融及凍藏過程中免受機械損傷。

2.1.3 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白相對分子質量的影響

小麥淀粉中蛋白質含量在12%左右,但其對面筋蛋白性質及面制品加工和食用意義非凡。在凝膠電泳中,蛋白質亞基的遷移速度和蛋白質亞基的相對分子質量呈負相關,即相對分子質量越大,遷移速度越慢[43]。其中面筋蛋白中的高分子亞基對面制品的加工品質具有一定的影響。

石媛媛[40]研究發(fā)現在凍藏和凍融中,面筋蛋白在100 kDa上下出現3條比較清晰的條帶,這部分屬于高分子亞基,30~70kDa之間圖譜顏色較深,含量高,分子質量小,屬于低分子亞基和醇溶蛋白,且電容條帶數目和遷移率之間不存在明顯變化,說明面筋蛋白凍藏和凍融中對面筋蛋白的蛋白質亞基之間沒有顯著影響,且添加抗凍蛋白后也不會對面筋蛋白亞基產生影響。楊震[41]研究發(fā)現,無論是空白還是添加黑麥菜抗凍蛋白組凍融前后亞基和遷移率均沒有明顯變化,這說明凍藏環(huán)境對面筋蛋白的蛋白質亞基沒有顯著影響。

2.2 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白功能性質的影響

2.2.1 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白持水率的影響

面筋蛋白的持水率是面筋蛋白重要功能性質之一,是指其吸收水并保留在組織中的能力,這部分水包括物理截留水、自由水和結合水,其中對食品體系貢獻最大的是物理截留水,影響著蛋白質和食品體系中水分的相互作用。兩者之間的相互結合,決定與維持著蛋白質結構,甚至是物理化學性質[44]

曲敏等[45]研究發(fā)現在-18和-40 ℃低溫條件下,添加不同濃度苜蓿冰結構蛋白的冷凍面筋蛋白和空白組相比,持水率均是上升,但是在-18 ℃的條件下面筋蛋白的持水率上升幅度較小,在-40 ℃超低溫環(huán)境下苜蓿冰結構蛋白對面筋蛋白持水率的影響效果顯著。在-40 ℃超低溫下,隨著冷凍時間延長,凍藏和凍融后濕面筋蛋白持水率均下降且凍融比凍藏下降幅度大,說明凍藏及凍融后,對面筋蛋白的破壞作用顯著。添加不同濃度苜蓿冰結構蛋白,面筋蛋白持水率出現不同程度的下降趨勢,總體以1%苜蓿冰結構蛋白添加量最佳。所以,添加苜蓿冰結構蛋白對冷凍濕面筋蛋白持水性有一定的保護作用,且不同濃度苜蓿冰結構蛋白的添加量及冷凍溫度對面筋蛋白的持水率均有顯著影響。

2.2.2 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

面筋蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性是面筋蛋白重要的功能性質之一。面筋蛋白乳化性質和體系中的溶解度相關性很強,其次是蛋白質表面分布的親水基團和疏水基團等,這主要是因為在油水界面上蛋白膜的穩(wěn)定性取決于蛋白質同水油之間的相互作用。

張艷杰等[46]研究發(fā)現,小麥面筋蛋白凍融后乳化性變差,主要是小麥面筋蛋白在凍融處理后變性,溶解度降低,導致乳化性降低;變性后的小麥面筋蛋白親水-親油平衡性增強,導致乳化穩(wěn)定性增強。和對照組相比,添加燕麥抗凍蛋白的面筋蛋白乳化性顯著提高,主要是燕麥抗凍蛋白可以抑制冰晶再結晶,使體系溶解度提高,乳化性得到改善,而添加燕麥抗凍蛋白會抑制面筋蛋白的變性,導致乳化穩(wěn)定性下降。

2.2.3 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白二級結構的影響

面筋蛋白二級結構可以分為α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲。α-螺旋和β-折疊通過氫鍵形成穩(wěn)定的二級結構,增加了蛋白質的剛性和彈性,和面團的硬度和彈性有密切的關系;同時α-螺旋還可以參與形成疏水相互作用;無規(guī)則卷曲和β-轉角構型會使肽鏈發(fā)生轉變時阻力比較小,其中β-轉角大多分布在蛋白質分子表面,賦予蛋白質較高的柔性和自由度,這和面團的黏性和延伸性有關[47-48]。

石媛媛[40]研究發(fā)現凍藏和凍融后,面筋蛋白二級結構中的β-轉角減少、β-折疊增多,凍融循環(huán)后,α-螺旋構型有所下降。添加抗凍蛋白后,二級結構的變化幅度減小,說明添加抗凍蛋白對面團中的氫鍵破裂有減緩作用,可保護蛋白質的二級結構。楊震[41]研究發(fā)現,面筋蛋白二級結構以β-折疊為主,占比50%左右,其次是α-螺旋、β-轉角。在凍藏過程中,面筋蛋白二級結構發(fā)生了顯著變化,α-螺旋顯著下降,β-折疊顯著增加,β-轉角無顯著變化。添加黑麥菜抗凍蛋白凍藏后α-螺旋構型減少幅度變小,β-折疊增加幅度同樣變小,主要是黑麥菜抗凍蛋白抑制了冰晶的形成和重結晶,從而減緩在凍藏中蛋白質分子二級結構變化。

2.2.4 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白水分分布的影響

面筋蛋白中的水分可分為結合水、不易流動水和自由水,在核磁共振分析儀上通過弛豫時間T2來表示,如圖3所示。弛豫時間T2和水的流動性有很大關聯,T21在面團中的占比為20%左右,與蛋白質結合最為緊密;T22是和面團中的淀粉和其他可溶性的物質相結合的那部分水,為不易流動水或者弱結合水,占比在70%以上;T23是自由流動的水,稱為自由水,占比在6%左右[49-50]。

圖3 弛豫時間T2分布示意圖[51]
Fig.3 Schematic diagram of relaxation time T2 distribution[51]

賈春利[52]研究發(fā)現在凍藏條件下,空白組濕面筋蛋白體系中的T21T22會顯著增大,添加熱穩(wěn)定抗凍蛋白后,T21T22仍隨著凍藏時間的延長而不斷增加,但是增加的幅度有所降低,說明在凍藏過程中和蛋白質分子結合緊密的那部分水分會逐漸減少,轉變?yōu)槿踅Y合水或者是游離水,面筋蛋白分子發(fā)生脫水。

2.2.5 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白旋轉流變的影響

面筋蛋白旋轉流變是由彈性模量、黏性模量、黏性模量與彈性模量的比值這3部分組成。彈性模量是發(fā)生形變恢復原始形狀的能力,表征物料的彈性;黏性模量是損耗變形的能力,表征物料黏性;正切值反映物料的黏彈性,并且正切值還可表征物料的狀態(tài),正切值>1時,物料具有類似于流體的狀態(tài),正切值<1時,物料具有類似于固態(tài)的狀態(tài)。

楊震[41]研究發(fā)現在頻率0.1~40 Hz添加黑麥菜抗凍蛋白組和空白組彈性模量和黏性模量均和頻率成正相關且彈性模量始終大于黏性模量。新鮮面團凍融后彈性模量和黏性模量均下降,添加黑麥菜抗凍蛋白后,兩者均高于空白組,說明黑麥菜抗凍蛋白能有效保護面團,減緩冰晶生長對面團的機械破壞和面團弱化。

2.3 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白熱力學性質的影響

2.3.1 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白凍融特性的影響

純水在冰點溫度時仍可以保持液態(tài)而不結冰,在低于冰點溫度后,樣品還沒有出現凍結的現象稱之為過冷現象,這是凍融特性的表征之一。

張艷杰[18]研究發(fā)現不同凍藏周期下對照組面筋蛋白熔融曲線的溫度波動較添加燕麥抗凍蛋白組明顯。對各個曲線進行積分得面筋蛋白相關熔融參數,表明隨著凍藏時間的延長,對照組熔融過程中起始溫度Tmδ均會顯著性的提高,而添加燕麥抗凍蛋白組整體會比對照組向高溫遷移的幅度小。凍融曲線向高溫區(qū)移動這一現象代表著水分會從不易凍結的水向可凍結水的方向轉變[53],所以對照組的面筋蛋白熔融特性的起始溫度向高溫區(qū)發(fā)生位移的現象,說明水分流動性發(fā)生了較大的變化,容易發(fā)生冰晶的重結晶,形成大冰晶。隨凍藏期延長,對照組和添加燕麥抗凍蛋白組的Tm,δ會逐漸減小,且經過4周凍藏后,2組Tm,δ沒有顯著性差異。但經過凍藏后,2個組的熔融焓和Fw均升高,因為凍藏過程中形成冰晶及重結晶破壞面筋蛋白網絡結構,引起疏水性基團的暴露,使一部分結合水分離開,增加水分流動性。即使添加燕麥抗凍蛋白并不能完全遏制住熔融焓和Fw升高,但在一定程度上起到了延緩作用。

2.3.2 植物源抗凍蛋白對面筋蛋白可凍結水的影響

冷凍面筋蛋白的品質與體系中可凍結水含量相關。在凍結過程中,可凍結水形成冰晶,冰晶在融化過程會產生熔融焓,可間接反應面團中可凍結水的含量。

曲敏等[45]研究發(fā)現隨著冷凍時間延長,在凍藏和凍融過程中,面筋蛋白的可凍結水含量均逐漸增加。添加不同濃度的苜蓿冰結構蛋白后,可凍結水含量上升趨勢得到不同程度減緩,以添加0.5%的苜蓿冰結構蛋白對緩解面筋蛋白在凍藏及凍融中可凍結水的效果最好。說明在凍藏和凍融過程中,濕面筋蛋白中的水分會發(fā)生結晶,部分的弱結合水會因為和高分子物質之間結合不緊密而發(fā)生遷移,導致小冰晶聚集形成大冰晶,破壞網絡結構,引起水分流失,增加可凍結水的含量。添加苜蓿冰結構蛋白使得面筋蛋白中的可凍結水含量上升,這主要是因為苜蓿冰結構蛋白可以降低溶液的凝固點,抑制在凍結過程中冰晶的生長及再結晶,從而減少冰晶對網絡結構的破壞,阻止面筋蛋白中水分的解離。

3 結論與展望

將植物源抗凍蛋白運用到面筋蛋白中,可有效地抑制面筋蛋白結構、功能和熱力學性質的劣變。植物源抗凍蛋白不同于其他蛋白的特征是抑制冰晶重結晶的能力強。添加植物源抗凍蛋白后,其和體系中的冰晶直接結合,抑制重結晶,降低冰晶對面筋蛋白網絡結構的破壞程度。

目前大多數報道都是將面筋蛋白作為一個整體來研究。面筋蛋白中含有一些其他的關鍵成分,比如麥谷蛋白,其作為面筋蛋白的重要組成成分,可以賦予面團持水性、黏彈性等,對面筋蛋白加工及后期的焙烤起著決定性作用??梢試L試將植物源抗凍蛋白添加到面筋蛋白中,再提取其關鍵成分并進一步研究,來深入探究植物源抗凍蛋白對面筋蛋白品質的影響機理,為植物源抗凍蛋白改良冷凍食品品質提供理論參考。


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