剛果紅法定量檢測酵母β-葡聚糖的方法研究

酵母細胞壁來源的β-葡聚糖(yeast β-glucan, Y β-Glu)分為堿溶性和堿不溶性，堿不溶性酵母β-葡聚糖具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、改善腸道菌群[3]、提高人體免疫力等作用，在疾病的預防、治療方面有著潛在的應用價值。酵母β-葡聚糖也是一種大分子物質，具有β-1,3鍵構成的主鏈，以及β-1,6鍵形成的分支，并具有獨特的三螺旋空間結構[4]，不溶于水、酸、堿。

剛果紅(Congo red，CR)是一種陰離子偶氮染料，棕紅色、粉狀，易溶于水，具有聯(lián)苯偶氮結構，能與酵母β-葡聚糖三螺旋結構發(fā)生特異性結合[5]。有研究表明，酵母β-葡聚糖中每1個3鏈6螺旋片段中可容納1分子的剛果紅，兩者之間可通過氫鍵和疏水鍵結合，形成穩(wěn)定的紅色復合物[6-7]，并使復合物在可見光區(qū)的最大吸收波長發(fā)生紅移[8-9]。根據此性質可定量檢測酵母β-葡聚糖的含量。

酵母β-葡聚糖檢測方法有苯酚-硫酸法[10]、酶法[11]等，這些方法都是將多糖分解成葡萄糖分子，然后再換算為β-葡聚糖，忽略了其他多糖雜質的影響，檢測結果特異性不好，誤差偏大，在工業(yè)生產應用中具有一定的局限性。NITSCHKE等[9]建立了剛果紅試劑用于檢測具有β-1,3-1,6結構的可溶性蘑菇多糖的方法，為具有相似結構的酵母β-葡聚糖的檢測提供了借鑒，但酵母β-葡聚糖的不溶性，卻妨礙了該方法的直接應用。王志等[12]利用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)作為酵母β-葡聚糖的助溶劑，實現了酵母β-葡聚糖溶解，剛果紅試劑得以用于酵母β-葡聚糖檢測，并建立了相應的檢測體系。但是該方法沒有對檢測的特異性進行研究，不能排除酵母細胞壁中堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾，該文報道的可完全溶解β-葡聚糖的最低DMSO濃度，也與我們的研究結果有較大差異。此外緩沖液的選擇、檢測限等也沒有明確說明，影響了其實驗的重現性。所以在此基礎之上，對剛果紅與酵母β-葡聚糖的反應體系進行進一步的優(yōu)化，明確檢測限以確定適用范圍，增設干擾物實驗確定檢測的特異性，完善剛果紅試劑-酵母β-葡聚糖的檢測方法，以期對酵母β-葡聚糖的相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑

酵母β-葡聚糖、甘露聚糖，Sigma公司，酵母堿溶性β-1,3葡聚糖，Macklin公司；剛果紅，合肥博美生物科技公司；NaH2PO4、Na2HPO4、檸檬酸、檸檬酸三鈉、醋酸、醋酸鈉、二甲基亞砜(DMSO)，天津市科密歐化學試劑有限公司。

質量分數為0.01%剛果紅溶液(用pH 7.5的0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液溶解)。

酵母β-葡聚糖備用液：準確稱量50 mg酵母β-葡聚糖，加入10 mL體積分數為90%的DMSO溶液，于70 ℃的水浴鍋中加熱3 h助溶，即得。

1.1.2 儀器與設備

UV-1750型紫外-可見分光光度計，島津實驗器材有限公司；HH-1 J型水浴鍋，常州國旺儀器制造有限公司；PHS-2F型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應體系

總反應體系為4 mL，先加入擬定量的酵母β-葡聚糖溶液，再用磷酸鹽緩沖液補足至2 mL，最后加入2 mL剛果紅試劑，以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，測定吸光度值。

1.2.2 檢測波長與吸收差譜測定

將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質量濃度為200 μg/mL，取1 mL于試管中，加磷酸鹽緩沖液1 mL，再加2 mL剛果紅試劑；以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，進行全波段光譜掃描。

1.2.3 反應條件的優(yōu)化

1.2.3.1 最適pH對反應的影響

考察pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對反應體系的影響，反應體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在25 ℃下反應15 min，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.3.2 最適溫度對反應的影響

考察不同溫度對反應的影響，設定反應溫度為20、30、40、50、60 ℃，反應體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應15 min，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.3.3 最適時間對反應的影響

反應體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg；在pH為7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中反應，反應溫度為25 ℃，考察不同反應時間對實驗結果的影響，選取反應時間為5、10、15、20、25 min，分別測定540 nm下的吸光度值。

1.2.4 緩沖液種類對反應的影響

對比pH 7.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、C6H8O7·H2O-C6H5 Na3O7·2H2O緩沖液、CH3COOH-CH3COONa·3H2O緩沖液對反應體系的影響，反應體系參照1.2.1，其中酵母β-葡聚糖的加入量為200 μg，通過全波段光譜掃描確定緩沖液種類對反應的影響。

1.2.5 DMSO對酵母β-葡聚糖溶解的影響

準確稱取酵母β-葡聚糖10 mg，加入10 mL不同體積分數(選擇為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的DMSO溶液，在70 ℃水浴鍋中處理3 h，根據酵母β-葡聚糖與剛果紅的反應結果考察酵母β-葡聚糖在DMSO中的溶解情況。

1.2.6 剛果紅的檢測限測定

最低檢測限：將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質量濃度20 μg/mL，反應體系參照1.2.1，在試管中分別加入0、2、4、6、8、10、12 μg的酵母β-葡聚糖，測定540 nm下的吸光度值。

最大檢測限：將酵母β-葡聚糖備用液用蒸餾水稀釋至終質量濃度1 mg/mL，反應體系參照1.2.1，在試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg的酵母β-葡聚糖，測定540 nm下的吸光度值。

1.2.7 酵母β-葡聚糖的標準曲線

將酵母β-葡聚糖用蒸餾水稀釋至終質量濃度200 μg/mL，按照表1加樣，考察不同酵母β-葡聚糖濃度與吸光度的對應關系。

表1 剛果紅法染色酵母β-葡聚糖實驗組 單位：mL

Table 1 Congo red staining yeast β-glucan experimental group

1.2.8 精密度實驗

將酵母β-葡聚糖備用液配制質量濃度為200 μg/mL。反應體系參照1.2.1，分別在5組試管中加入酵母β-葡聚糖160 μg，測定吸光度。代入標準方程，計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.2.9 回收率實驗

配制質量濃度為200 μg/mL的酵母β-葡聚糖備用液。反應體系參照1.2.1。每次加入酵母β-葡聚糖的量為200 μg，測定5次。計算回收率和RSD。

1.2.10 干擾物實驗

以200 μg/mL酵母β-葡聚糖為對照品，配制200 μg/mL堿溶性β-1,3葡聚糖和甘露聚糖為干擾物，將干擾物加入反應體系，測定吸光度3次并取平均值，以評價干擾效果和檢測方法準確性。

2 結果與分析

2.1 吸收波長和吸收差譜的確定

將酵母β-葡聚糖和剛果紅反應的復合物進行全波段光譜掃描，以不加酵母β-葡聚糖的情況為對照，如圖1所示。

a-吸收波譜；b-吸收差譜
圖1 反應復合物的全波段光譜掃描
Fig.1 Full-band spectral scanning of the reaction complex

在剛果紅體系中加入酵母β-葡聚糖后吸收光譜發(fā)生了紅移現象。由吸收差譜可得最大檢測吸收波長為540 nm，故此后反應體系均采用540 nm作為測定波長。

2.2 不同因素對反應的影響

2.2.1 pH對反應的影響

剛果紅是一種酸堿指示劑，其pH變色范圍為3.5～5.2，與β-葡聚糖反應時應在剛果紅的非變色范圍內進行測定，反應pH與吸光度的關系如圖2-a所示：在pH 6.5～8.5內，檢測結果差異不大，F=2.455，P=0.114>0.05，pH條件為反應的非顯著性因素。因pH 7.5時吸光度值最大，故選擇緩沖液pH為7.5。

2.2.2 溫度對反應的影響

在不同溫度下(20～60 ℃)反應，測定吸光度，測定結果如圖2-b所示，在20～30 ℃時吸光度變化較為平緩，之后吸光度隨著溫度的升高迅速下降。溫度升高時，可能會引起1,3-β-葡聚糖鏈發(fā)生構象變化，導致其結合位點容納的剛果紅分子的數量減少[13]，故實驗選擇20 ℃為反應溫度。

2.2.3 時間對反應的影響

時間與吸光度的關系如圖2-c所示，隨著反應時間增長，反應的吸光度逐漸升高后趨于平緩。當反應時間為15 min時，吸光度達到最大值為0.231，故選擇反應時間為15 min。β-葡聚糖與剛果紅結合后的吸收光譜是平衡時游離染料和復合物的吸收光譜之和，這是一個動態(tài)可逆反應過程，隨著時間的變化，其反應會逐漸趨于平衡[14]。

a-pH；b-溫度；c-時間
圖2 不同因素對反應的影響
Fig.2 The influence of different factors on the reaction

2.3 不同種類緩沖液的選擇結果

在540 nm處，吸光度值由上至下依次為，磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、剛果紅對照液。如圖3所示。

圖3 不同緩沖液對吸光度的影響
Fig.3 The influence of different buffers on absorbance

實驗結果顯示，鹽溶液可能會導致β-葡聚糖無序的空間結構向有序轉變，而有序的能更好地與剛果紅結合[14]。而在磷酸緩沖液中酵母β-葡聚糖與剛果紅結合更為靈敏，其結合度要高于其他幾種緩沖液。

2.4 不同體積分數DMSO處理酵母β-葡聚糖的結果分析

用不同體積分數的DMSO處理酵母β-葡聚糖，其濃度與吸光度的關系如圖4所示。隨著DMSO體積分數增加，溶解的酵母β-葡聚糖逐漸增多，直接觀測法可明顯看出從50%～90%懸浮物逐漸減少，吸光度與DMSO體積分數接近線性關系，說明此濃度范圍的DMSO溶液對酵母β-葡聚糖的空間結構沒有破壞或破壞程度極?。辉?0%～100%時，溶液呈澄清透明狀，說明酵母β-葡聚糖被完全溶解，但吸光度有所降低，可能與酵母β-葡聚糖結構被破壞有關。本實驗結果與其他文獻報道[15]的DMSO能破壞酵母β-葡聚糖結構說法有所不同，可能是實驗所使用的酵母β-葡聚糖的分子質量不同所致，其具體原因有待進一步探究。

圖4 不同含量DMSO與吸光度的關系
Fig.4 Relationship between different DMSO and absorbance

2.5 剛果紅檢測限結果分析

對酵母β-葡聚糖的最大檢測限和最小檢測限進行了實驗分析，酵母β-葡聚糖的含量與吸光度關系如圖5所示。酵母β-葡聚糖的含量為0～4 μg時，其顏色反應不足于檢測出來；當含量大于4 μg，吸光度隨著含量增加而接近線性關系。當含量達到1 600 μg時，吸光度逐漸趨于平穩(wěn)，其中線性較好的范圍是4～200 μg。2 mL的0.1 mg/mL剛果紅試液即為0.2 mg，可與4～1 600 μg內酵母β-葡聚糖的發(fā)生反應。說明酵母β-葡聚糖的三螺旋結構片段與剛果紅分子結合有上限，并不是無限結合，其結合度與氫鍵和疏水鍵有關。

圖5 剛果紅檢測限
Fig.5 Limit of detection of Congo red

2.6 標準曲線

按照1.2.7步驟進行實驗，通過Origin Pro 8.5軟件擬合回歸方程，酵母β-葡聚糖在4～200 μg內有良好的線性關系，回歸方程為：Y=0.001 15X-0.001 14，R2=0.998 6。

2.7 精密度實驗結果

對同一批樣品進行重復實驗，對該方法進行精密度驗證。分別在5組試管中加入相同量的酵母β-葡聚糖，測定吸光度，結果見表2，實驗結果RSD為1.154%，表明檢測方法重復性良好，可作為酵母β-葡聚糖檢測方法使用。

表2 精密度實驗結果
Table 2 Precision test results

2.8 回收率實驗結果

在酵母β-葡聚糖樣品中加入不同量的標準品，測定回收率，實驗結果如表3所示，其平均回收率為100.32%，RSD為1.11%。準確度高，可滿足一般檢測的需要。

表3 回收實驗結果
Table 3 Experimental results of sampling recovery

2.9 干擾物實驗結果

以酵母β-葡聚糖為對照組，在干擾組中分別加入β-1,3葡聚糖和甘露聚糖，測定干擾率，實驗結果如表4所示。

表4 干擾物實驗結果
Table 4 Experimental results of interference

結果顯示，β-1,3葡聚糖干擾率(0.587%)<精密度(RSD=1.154%)，說明β-1,3葡聚糖對檢測的結果影響較??；而甘露聚糖對反應有較大的影響，但是在實際樣品的檢測中，經過預處理后的甘露聚糖已經被去除，并不影響測定結果。

3 討論與結論

實驗利用剛果紅與酵母β-葡聚糖特異性結合的性質，對酵母β-葡聚糖進行定量檢測，避免了傳統(tǒng)檢測方法間接、多步測定和誤差偏大的缺點，顯示出一定的優(yōu)越性。對剛果紅和酵母β-葡聚糖的反應體系和反應條件進行優(yōu)化，結果顯示，0.1 mol/L，pH 7.5磷酸緩沖液使反應靈敏度提高，最低檢出限提高為4 μg；溫度影響剛果紅和酵母β-葡聚糖兩者的結合度，在20 ℃下，結合度最大。15 min時，反應可以達到平衡。在此優(yōu)化條件下進行驗證實驗。精密度RSD為1.160%，平均回收率為100.32%，相比優(yōu)化前具有更好的精密度和更高的回收率，測定結果準確、穩(wěn)定；干擾性實驗顯示，反應不受堿溶性β-1,3葡聚糖的干擾，而受甘露聚糖影響較大。酵母β-葡聚糖為不溶性物質，經過預處理以及中間的制備過程，可溶性的甘露聚糖幾乎被完全去除，幾乎無法檢出。因此，按照制備過程得到的酵母β-葡聚糖樣品可以忽略甘露聚糖對反應的影響。但是對于市售的酵母細胞壁產品而言，其中存在較多的甘露聚糖，檢測前的預處理極為必要，須去除甘露聚糖才可以確保檢測的準確性。

DMSO溶解實驗說明，有效溶解酵母β-葡聚糖需要較高濃度的DMSO，酵母β-葡聚糖溶解度與DMSO作助溶劑時濃度間存在近似的線性關系，由此推測高濃度的DMSO并沒有對酵母β-葡聚糖的結構造成破壞或者破壞極小，這與其他文獻報道[15]的結果存在一定的差異，所以還需進行更深一步探討。

本實驗完善了剛果紅與酵母β-葡聚糖反應的具體條件，使之更具可操作性，對酵母細胞壁產品中的β-葡聚糖的檢測具有參考價值。