沃柑中4種常用殺蟲殺螨劑的殘留分析及膳食風險評估

沃柑(Citrus reticulata)果實色澤艷麗，果肉細嫩多汁，營養(yǎng)品質(zhì)和口感風味上乘[1]，其為‘坦普爾’橘橙與‘丹西’紅橘的雜交種，育成于以色列，后引入中國重慶、廣西、云南等地[2]。因貨架期長，栽培效益高，近年來成為我國發(fā)展極為迅速的晚熟雜柑品種之一。目前，僅廣西的種植面積已超10萬hm2[3]，已成為我國南方地區(qū)農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)供給側結構調(diào)整、精準扶貧和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮了重要作用。然而，沃柑生長發(fā)育周期長，易遭受多種多代病蟲害侵襲，加上生長環(huán)境高溫潮濕，果園年平均用藥次數(shù)多達26.5次，平均每次用藥3種以上[4]。在國家柑橘類水果質(zhì)量安全監(jiān)測和國家市場監(jiān)督管理總局抽檢中，沃柑等晚熟柑橘多次出現(xiàn)農(nóng)藥殘留超標情況，特別是常用殺蟲殺螨劑超標較多[5]，其質(zhì)量安全狀況受到高度關注。

沃柑生產(chǎn)中常見蟲害有紅蜘蛛、潛葉蛾、木虱、蚧殼蟲等[2]，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯等殺蟲殺螨劑長期以來被廣泛用于防治這些蟲害爆發(fā)。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的分類標準，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯分別被劃分為Ib類、II類、II類和II類毒性化合物[6]，對人體健康具有潛在危害。因此歐盟對柑橘中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱的最大殘留限量值(maximum residue limit，MRL)均規(guī)定為0.01 mg/kg，遠嚴格于我國[7]。毒死蜱是柑橘中檢出率最高的農(nóng)藥種類，三唑磷、丙溴磷和聯(lián)苯菊酯超標率較高，是影響柑橘質(zhì)量安全的主要風險因子，但丙溴磷、聯(lián)苯菊酯和毒死蜱在早熟品種溫州蜜柑上殘留水平較低，可安全使用[5,8]。然而，這些殺蟲殺螨劑在晚熟品種上殘留超標率高，其殘留消解狀況與膳食風險如何，是否與早熟品種存在較大差異還未見報道。因此，本試驗以沃柑為對象，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測技術，分析三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯在沃柑中的消解與殘留分布，并對其可能產(chǎn)生的人群膳食風險進行評估，以期為我國沃柑安全生產(chǎn)、監(jiān)測和消費引導提供重要的技術依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

三唑磷標準品(純度≥97%)、丙溴磷標準品(純度≥99%)、毒死蜱標準品(純度≥99%)、聯(lián)苯菊酯標準品(純度≥99.5%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國Sigma-Aldrich 公司；乙酸銨(色譜純)，德國Honeywell-Fluka公司；乙二胺基-N-丙基(PSA)，上海安譜科學儀器有限公司；MgSO4、NaCl(分析純)，江蘇強盛化工有限公司；試驗用甲氰·三唑磷(22%乳油，柳州市惠農(nóng)化工有限公司)、丙溴磷(50%乳油，青島中達農(nóng)業(yè)科技有限公司)、啶蟲·毒死蜱(40%微乳劑，江西眾和化工有限公司)、聯(lián)苯菊酯(100 g/L乳油，安道麥輝豐(江蘇)有限公司)，購于當?shù)剞r(nóng)資商店。

1.2 儀器與設備

LC-30AD超高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；QTRAPTM 6500三重四極桿線性離子阱復合質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超純水系統(tǒng)Milli-Q AdvantageA10，美國Millipore公司；CL31/CL31R多用途離心機，美國Thermo Fisher公司；CK 2000型高通量組織研磨儀，北京Thmorgan生物科技有限公司。

1.3 田間試驗與樣品采集

供試材料為沃柑，于2020年10月～2021年1月在南寧、賀州和重慶三地選擇管理水平和樹齡大體一致的結果盛期沃柑園進行。采用噴霧法對沃柑樹進行農(nóng)藥噴施。其中，消解動態(tài)試驗以所選農(nóng)藥最高推薦劑量的1.5倍液(三唑磷270 mg a.i./kg、丙溴磷375 mg a.i./kg、毒死蜱700 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯90 mg a.i./kg)為施藥劑量噴藥1次，并分別于噴藥后0(2 h)、3、7、14、21、28、35、45、60 d按隨機法進行果實樣品采集；最終殘留試驗按良好農(nóng)業(yè)規(guī)范，以所選農(nóng)藥的最高推薦劑量(三唑磷180 mg a.i./kg、丙溴磷250 mg a.i./kg、毒死蜱467 mg a.i./kg、聯(lián)苯菊酯60 mg a.i./kg)進行噴施，三唑磷和丙溴磷2次、毒死蜱1次、聯(lián)苯菊酯3次，并分別于各自的安全間隔期及安全間隔期后7或10 d各采樣1次。三唑磷的安全間隔期為30 d，丙溴磷和毒死蜱為28 d，聯(lián)苯菊酯為14 d。以4株沃柑樹為1個試驗小區(qū)，每個處理重復3次，以清水噴施為對照。每個處理采樣不少于2 kg，樣品采集標號后，置于加冰保溫盒中運至實驗室。分別處理樣品全果、果皮和果肉，用勻漿機對樣品進行勻漿，于-20 ℃冷凍保存，待測。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

采用QuEChERS方法對樣品進行提取凈化：稱取沃柑果實樣品5.00 g于50 mL離心管中，加入10.00 mL乙腈，垂直振蕩提取10 min，加入2.00 g MgSO4和0.50 g NaCl，垂直振蕩1 min后，10 000 r/min離心5 min。移取1.50 mL上清液加入裝有50 mg PSA的4 mL離心管中，渦旋1 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，上機檢測。

1.4.2 標準工作液的配制

分別準確稱取約10.0 mg農(nóng)藥標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容。取相應量的單標儲備液于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成10 mg/L的標準混合儲備液，-18 ℃避光保存?zhèn)溆?。使用時，將標準混合儲備液稀釋至質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200 和500 μg/L的系列溶劑標準溶液；同時將標準混合儲備液用處理后的沃柑果實、果皮和果肉提取液稀釋至相同質(zhì)量濃度的系列基質(zhì)匹配標準溶液用于定量，4 ℃下保存。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 2 C18(100 mm×2.1 mm，2 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：1.0 μL；流速：0.4 mL/min；流動相 A：5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相 B：甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，10% B～90% B；3～6 min，90% B；6～8 min，90% B～10% B。

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度：500 ℃；電壓5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-)；霧化氣(GS1)壓力：379.2 kPa(55 psi)；輔助氣(GS2)壓力：379.2 kPa(55 psi)；氣簾氣壓力：275.8 kPa(40 psi)。MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5 降解動態(tài)方程

按照一級反應動力學方程擬合4種殺蟲殺螨劑在沃柑中的殘留降解動態(tài)，消解系數(shù)K通過公式(1)計算，半衰期通過公式(2)計算。

CT=C0e-KT

(1)

(2)

式中：CT，T時間目標農(nóng)藥的殘留濃度，mg/kg；C0，施藥后目標農(nóng)藥的初始沉積量，mg/kg；K，消解系數(shù)；T1/2，降解半衰期，d；T，施藥后時間，d。

表1 4種殺蟲殺螨劑的質(zhì)譜條件參數(shù)和結構
Table 1 UPLC-MS/MS parameters and chemical structures for the four insecticides and acaricides

注：標*為定量離子

1.6 膳食風險評估

根據(jù)WHO規(guī)定的方法[9]，沃柑中農(nóng)藥殘留慢性膳食風險(%ADI)按公式(3)(4)計算，急性膳食風險(%ARfD)按公式(5)(6)計算，風險值<100時，健康風險在可接受范圍內(nèi)；而風險值>100時，存在不可接受的健康風險。

EDI=(STMR×F)/bw

(3)

%ADI=EDI/ADI×100

(4)

(5)

%ARfD=ESTI/ARfD×100

(6)

式中：EDI，每日估計攝入量，mg/kg bw；STMR，農(nóng)藥殘留試驗中值，mg/kg；F，柑橘人均消費量，kg；bw，人群體重，kg；ADI，每日允許攝入量，mg/kg bw，源自WHO數(shù)據(jù)庫[10]；ESTI，短期估計攝入量，mg/kg bw；Ue，單果重，kg；HR，最終殘留試驗得到的最高殘留濃度，mg/kg；v，變異因子；LP，柑橘消費大份餐，kg；ARfD，急性參考劑量，mg/kg bw，源自WHO數(shù)據(jù)庫[10]。不同人群體重與沃柑消費數(shù)據(jù)等來源于WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)[11]。

2 結果與分析

2.1 方法驗證

如表2所示，在1～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所選農(nóng)藥的線性相關系數(shù)在0.993 7～0.999 8(r>0.99)，線性良好。以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低添加濃度為方法定量限(limit of quantitation，LOQ)，LOQs確定為10 μg/kg，低于目標農(nóng)藥的MRL。沃柑果實和果肉中按0.01、0.1、2 mg/kg，果皮中按0.01、0.1、10 mg/kg 3個濃度水平進行添加回收實驗，每個添加濃度重復6次，結果表明，在3個加標水平下，4種殺蟲殺螨劑在3種基質(zhì)中的回收率為74.1%～100.6%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)在0.5%～13.5%，該方法具有良好的準確度和精密度，根據(jù)農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則(NY/T 788—2018)，可滿足所選農(nóng)藥殘留檢測分析要求。4種殺蟲殺螨劑的 UPLC-MS/MS 色譜圖見圖1。

2.2 沃柑中4種常用殺蟲殺螨劑的降解動態(tài)曲線

三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯在晚熟柑橘沃柑中的殘留消解動態(tài)變化曲線如增強出版附件所示。按試驗劑量噴施4種殺蟲殺螨劑2 h后，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯在3個產(chǎn)地沃柑上的初始沉積量分別為435.0～726.2 μg/kg、573.7～689.2 μg/kg、817.5～1 525 μg/kg和91.8～113.2 μg/kg，消解曲線決定系數(shù)(R2)為0.874 8～0.989 2，指數(shù)關系良好，消解規(guī)律均符合一級動力學方程。施藥60 d時，三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯在沃柑上的消解率分別達到73.6%～83.6%、77.7%～85.5%、92.1%～96.2%和83.4%～88.3%，半衰期分別為21.7～30.1 d、22.4～28.9 d、13.9～15.4 d和19.8～24.8 d。與其他作物相比，4種農(nóng)藥在沃柑中的消解速度較慢[12-13]，在果實中的持久性除毒死蜱較低之外，其他3種均中等[14]。這個結果除與當?shù)丨h(huán)境條件和農(nóng)藥劑型等因素有關外[15-16]，很大程度上還與施藥時期及柑橘果皮的特殊結構有關。王思威等[17]在柑橘幼果期施用丙溴磷，半衰期為4.3～7.2 d，顯著短于本試驗結果。有些農(nóng)藥在柑橘類水果中的消解速率和半衰期比在其他作物上更慢和長[15,17-19]，柑橘表皮的蠟質(zhì)層及豐富的精油囊胞可能會使農(nóng)藥的降解受阻，使其半衰期延長[19-20]。

表2 四種殺蟲殺螨劑的線性、定量限、回收率和相對標準偏差
Table 2 The linearity, LOQs, recoveries and RSDs for the four insecticides and acaricides

a-果實；b-果皮；c-果肉
圖1 添加濃度為10 μg/kg時沃柑不同部位 中4種農(nóng)藥的總離子流色譜圖
Fig.1 Total ions chromatogram of the four pesticides in different parts of Orah mandarin at 10 μg/kg spiking concentration

2.3 沃柑中4種常用殺蟲殺螨劑的最終殘留

目前，我國柑和橘中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯的MRL分別規(guī)定為0.2、0.2、1和0.05 mg/kg，沃柑中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯的最終殘留試驗結果如表3所示。按推薦劑量施藥，3個試驗點沃柑果實中三唑磷、丙溴磷和聯(lián)苯菊酯在其安全間隔期及安全間隔期后采樣檢測的平均殘留量分別為0.451～0.773和0.410～0.659 mg/kg、0.485～0.596和0.247～0.539 mg/kg、0.155～0.259和0.123～0.274 mg/kg，均沒有降解到其MRL以下；毒死蜱在其安全間隔期及安全間隔期后7 d的平均殘留量為0.155～0.722和0.133～0.563 mg/kg，均在其MRL以下?？梢?，丙溴磷、三唑磷和聯(lián)苯菊酯在晚熟柑橘品種沃柑上降解緩慢，按推薦劑量和安全間隔期使用后在沃柑果實中殘留量容易超標，這可能是市場監(jiān)測中這些農(nóng)藥檢出超標的原因之一。毒死蜱檢出率雖高，但鮮有超標。與王思威等[17]研究結果相同，說明丙溴磷等農(nóng)藥在柑橘幼果期施用是安全的，但在10月果實轉色期之后施用容易超標。另外值得指出的是，雖然沃柑果實中丙溴磷、三唑磷和聯(lián)苯菊酯的殘留量較高，但果肉均未檢測到農(nóng)藥殘留，果皮中4種農(nóng)藥殘留量為果實中的3.1～6.5倍，殘留主要集中在果皮中，這與前人相關研究結果基本一致[17, 21]。

2.4 沃柑中4種常用殺蟲殺螨劑的膳食風險

開展膳食風險評估是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全評價的有效手段。沃柑為皮不可食水果，但國際上通常是監(jiān)測整個產(chǎn)品中危害物含量結合膳食攝入數(shù)據(jù)進行風險評估。近年來，加工因子引入用于風險評估研究使得評估結果更切合實際[18,22-23]。本研究針對沃柑整個果實和去皮后果肉中農(nóng)藥殘留狀況，分別評估一般人群和兒童的膳食風險。按照WHO規(guī)定，風險評估中低于LOQ的數(shù)據(jù)按1/2 LOQ進行處理[9]。沃柑果實中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯殘留對我國消費者的潛在膳食風險見表4。4種殺蟲殺螨劑對我國兒童和一般人群的慢性膳食風險在0.55～46.0，表現(xiàn)為三唑磷>毒死蜱>丙溴磷>聯(lián)苯菊酯，均在可接受范圍內(nèi)；急性膳食風險為1.57～4 439，表現(xiàn)為三唑磷>聯(lián)苯菊酯>毒死蜱>丙溴磷，其中三唑磷殘留量對兒童和一般人群以及聯(lián)苯菊酯殘留量對兒童的風險值超出了可接受范圍，有潛在急性健康風險。

表3 四種殺蟲殺螨劑在沃柑上的最終殘留量
Table 3 Final residues of four insecticide and acaricides in Orah mandarin

表5展示了沃柑果肉中三唑磷、丙溴磷、毒死蜱和聯(lián)苯菊酯殘留對我國消費者的實際膳食風險。去皮能夠顯著降低農(nóng)藥殘留膳食風險[18, 24]，4種殺蟲殺螨劑的慢性和急性風險分別為0.005～0.50和0.013～28.6，均遠遠低于安全界限100。因此，沃柑作為鮮食水果去皮食用時，4種農(nóng)藥殘留對人體的健康風險可忽略不計。若考慮加工食用整個果實或果皮產(chǎn)品時，具有一定的急性膳食攝入風險，且對兒童風險更高，不建議進行消費[21,24]，皮渣利用時也應結合產(chǎn)品用途考慮農(nóng)藥殘留的影響。

表4 沃柑果實中4種殺蟲殺螨劑殘留對我國消費者的潛在膳食風險
Table 4 Potential dietary risks of insecticides and acaricides in Orah fruits for Chinese consumers

表5 沃柑果肉中4種殺蟲殺螨劑殘留對我國消費者的膳食風險
Table 5 Dietary risks of insecticides and acaricides in Orah pulp for Chinese consumers

3 結論

采用QuEChERS結合UPLC-MS/MS方法對沃柑中4種常用殺蟲殺螨劑進行檢測，結果表明該方法具有良好的準確度和精密度，可滿足試驗農(nóng)藥殘留檢測分析要求。4種殺蟲殺螨劑在沃柑上的消解規(guī)律符合一級動力學方程，但降解速率較慢，在果實中的最終殘留只有毒死蜱可降解到其MRL以下，三唑磷、丙溴磷和聯(lián)苯菊酯均超出其各自的MRL。4種農(nóng)藥殘留主要集中在果皮中，果皮中的殘留量為果實中的3.1～6.5倍。沃柑果肉中4種農(nóng)藥殘留對人體的健康風險可忽略不計，但整個果實中殘留的三唑磷對兒童和一般人群以及聯(lián)苯菊酯對兒童的急性膳食攝入風險值超出了可接受范圍，存在急性健康風險。果實轉色期后應停止使用三唑磷、丙溴磷和聯(lián)苯菊酯，同時，不建議對沃柑整個果實或果皮產(chǎn)品進行加工食用。