殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復合涂膜對黃瓜冷害的影響及其機制研究

黃瓜含水量高，代謝旺盛，且外皮極薄，在貯藏過程中極易失水萎蔫。低溫在一定程度上可降低黃瓜的生理代謝，但黃瓜是冷敏性果實，低于7～10 ℃極易發(fā)生冷害[1]。我國北方冬天室外溫度長期低于7 ℃，黃瓜采收后，貯運過程中長時間處于較低溫度，容易誘發(fā)冷害[2]。冷害導致黃瓜抗病性和耐貯性下降，造成腐爛與品質劣變，嚴重制約黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，尋求抑制冷害技術是黃瓜貯運物流的關鍵。

可食性涂膜保鮮技術是將可食性高分子涂布于果蔬表面，形成一層選擇性透過薄膜，一方面可調(diào)節(jié)果蔬與外界氣體交換，抑制呼吸和蒸騰作用，減少水分散失，延緩果實衰老；另一方面可保護果皮，減少機械損傷、阻止外界病原菌的侵染，防止果實腐爛[3]。殼聚糖又稱聚氨基葡萄糖、脫乙酰甲殼素，是一種天然堿性陽離子多糖，因其具有無毒、抗菌性、抗氧化活性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)點，而廣泛應用于砂糖橘[4]、長山藥[5]、杏[6]等果蔬抑制冷害涂膜保鮮中。但單一殼聚糖涂膜在保濕性、機械強度、韌性等方面存在不足。添加納米ZnO可改善殼聚糖薄膜阻隔性、力學性能及抗菌性能，目前在甜櫻桃[7]、番石榴[8]涂膜保鮮方面均取得良好效果。褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類重要的色氨酸吲哚類化合物[9]。近年來，外源性褪黑素作為一種通用生物胺類激素和信號生物分子，在桃[10]、青椒[11]、番茄[12]果蔬保鮮中發(fā)揮抗冷害、抑制腐爛、保持感官和營養(yǎng)品質等作用。目前僅見殼聚糖[13]、褪黑素[14]對黃瓜單獨抗冷害研究，而有關殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復合涂膜尚未見報道。因此，本試驗研究殼聚糖-納米ZnO、褪黑素及殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復合涂膜處理對黃瓜冷害、品質和抗氧化酶活性的影響，探討其抗冷機理，以期為黃瓜貯運提供理論依據(jù)和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“津研四號”黃瓜采自山西省運城市鹽湖區(qū)蔬菜示范基地，采摘結束后1 h運回運城學院果蔬貯藏保鮮實驗室。

褪黑素、NaH2PO4、Na2HPO4、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、MgCl2、乙二胺四乙酸二鈉、H2O2、氧化性谷胱甘肽、三氯乙酸、NaOH、氮藍四唑等，上海源葉科技有限公司；食品級殼聚糖(脫乙酰度≥95%)，濟南海德貝生物技術有限公司；食品級納米ZnO(粒徑50 nm)，青島納卡森鋅業(yè)科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TAI604型電子天平、UV-1800型紫外-可見分光光度計、TEL-7001型紅外線CO2分析儀，上海精密儀器有限公司；GY-4數(shù)顯式水果硬度計，浙江樂清艾德堡；DDS-307A電導率儀，上海雷磁；Sigma 315高速冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.3 實驗方法

選用瓜條飽滿、順直、粗細均勻(長為15～30 cm，直徑為2.5～3.0 cm)、無機械傷和病蟲害的留有1 cm果柄黃瓜為材料。將所選黃瓜隨機分成4組(每組3個重復，每個重復150個果)，分別浸泡在蒸餾水(對照)、質量分數(shù)0.5%殼聚糖-0.05% ZnO(前期預試驗基礎上篩選)、100 μmol/L褪黑素(前期預試驗基礎上篩選)及復合涂膜溶液(0.5%殼聚糖-0.05% ZnO-100 μmol/L褪黑素)中3 min后取出，于10 ℃下風干，將黃瓜裝于0.01 mm PE保鮮袋(含3%透氣孔率，國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程中心)，每袋4個果實，平鋪于塑料筐內(nèi)，貯藏于(4±0.5) ℃，相對濕度90%～95%冷庫中。

貯藏過程中，每隔3 d取5個果實用于呼吸速率、硬度、抗壞血酸含量和細胞膜透性測定，并取樣保存于-80 ℃的超低溫冰箱中，用于·O2-、H2O2、抗氧化酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定。另有10個果實置于20 ℃ 3 d條件下用于冷害指數(shù)測定。貯藏結束時30個果實用于失重率、腐爛率和冷害率的計算。每個處理重復3次，整個試驗重復2次。

1.4 測定指標

1.4.1 冷害指數(shù)和冷害率

冷害指數(shù)和冷害率均參考文獻[15]方法，根據(jù)果實水漬狀斑點和凹陷斑的面積，將冷害程度分為5級。0級，無冷害；1級(<25%)；2級(26%～50%)；3級(51%～75%)；4級(>75%)。

冷害指數(shù)和冷害率分別按公式(1)(2)計算：

冷害指數(shù)

(1)

冷害率

(2)

1.4.2 失重率和腐爛率測定

失重率參考文獻[16]的方法，腐爛率參考陳镠等[7]的方法，失重率和腐爛率均以%表示，分別按公式(3)(4)計算。

失重率

(3)

腐爛率

(4)

1.4.3 呼吸速率測定

呼吸速率測定參照文獻[17]方法測定，以CO2 mg/(kg·h)表示。

1.4.4 硬度和抗壞血酸含量測定

硬度測定參考文獻[2]方法，采用GY-4數(shù)顯式硬度計(探頭直徑10 mm，測定深度10 mm)測定，選果實中部去皮測果肉硬度，取平均值，以N表示。抗壞血酸含量測定采用文獻[18]的方法，單位以mg/g表示。

1.4.5 MDA含量和細胞膜相對透性測定

MDA含量和細胞膜相對透性測定參照文獻[19]方法，MDA含量以μmol/g表示，細胞膜相對透性以%表示。

1.4.6 ·O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量測定

·O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量參照文獻[17]方法測定，·O2-產(chǎn)生速率以[NO2·-] μmol/(g FW·min)表示，H2O2含量以μmol/g FW表示。

1.4.7 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性測定參照文獻[20]的方法。

SOD活性以每小時抑制氮藍四唑光化還原50%為1個酶活力單位，以U/(g·h)表示。APX活性以每克黃瓜肉290 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。CAT活性以每克黃瓜肉240 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。GR活性以每克黃瓜肉340 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件，結果用平均值±標準誤(SE)表示，差異顯著性檢驗采用最小顯著極差法，差異顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 涂膜處理對黃瓜冷害指數(shù)和冷害率的影響

冷害指數(shù)是反映果蔬冷害發(fā)生嚴重程度的指標，而冷害率是反映果蔬冷害發(fā)生數(shù)量的指標。黃瓜主要冷害癥狀表現(xiàn)為表皮出現(xiàn)大小不一的凹陷斑，隨后會出現(xiàn)水浸狀斑點并逐漸增多，進而致病菌侵染冷害斑而出現(xiàn)腐爛，部分果實發(fā)出異味。由圖1-a可知，黃瓜的冷害指數(shù)呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均延緩了黃瓜冷害指數(shù)的上升，從冷藏第6天開始至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時冷害指數(shù)分別比對照降低8.1%、22.4%、22.9%。由圖1-b可知，貯藏15 d時對照黃瓜的冷害率高達73.3%，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜分別比對照顯著降低19.9%、27.3%、33.9%(P<0.05)。其中復合涂膜處理冷害指數(shù)和冷害率最低，抑制黃瓜冷害效果最好。

a-冷害指數(shù)；b-冷害率
圖1 不同涂膜處理對黃瓜冷害指數(shù)和冷害率的影響
Fig.1 Effect of different coating treatment on chilling injury of cucumber during storage

2.2 涂膜處理對黃瓜失重率和腐爛率的影響

由圖2-a可知，貯藏15 d時對照黃瓜的失重率高達7.33%，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜分別比對照顯著降低36.8%、25.9%、44.3%(P<0.05)。

果蔬發(fā)生冷害后，其冷害部位容易遭受微生物侵染而導致腐爛。由圖2-b可知，貯藏15 d時對照黃瓜的腐爛率高達51.3%，貯藏15 d時殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理分別比對照顯著降低30.4%、29.3%、44.5%(P<0.05)。其中復合涂膜處理失重率和腐爛率最低。

a-失重率；b-腐爛率
圖2 不同涂膜處理對黃瓜失重率和腐爛率的影響
Fig.2 Effect of different coating treatment on weight loss rate and decay rate of cucumber during storage

2.3 涂膜處理對黃瓜呼吸速率的影響

由圖3可知，黃瓜呼吸速率在貯藏前期有個下降過程，可能是貯藏低溫抑制呼吸代謝酶所致。在貯藏中期黃瓜呼吸速率迅速上升，后期呼吸速率變化則較為平緩。在貯藏中后期，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均抑制了黃瓜呼吸速率上升，從冷藏第6天開始至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

圖3 不同涂膜處理對黃瓜呼吸速率的影響
Fig.3 Effect of different coating treatment on respiration rate of cucumber during storage

2.4 涂膜處理對黃瓜硬度和抗壞血酸含量的影響

硬度和抗壞血酸含量是反映果蔬品質重要指標之一。由圖4-a可知，黃瓜的硬度呈下降趨勢，前期下降緩慢，中后期下降迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均延緩了黃瓜硬度的下降，從冷藏第6天開始至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時硬度分別比對照提高5.3%、14.9%、22.1%。

a-硬度；b-抗壞血酸含量
圖4 不同涂膜處理對黃瓜硬度和抗壞血酸含量的影響
Fig.4 Effect of different coating treatment on firmness and ascorbic acid content of cucumber during storage

由圖4-b可知，黃瓜的抗壞血酸含量呈下降趨勢，前期下降緩慢，中后期下降迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均延緩了黃瓜抗壞血酸含量的下降，從冷藏第9天開始至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時抗壞血酸含量分別比對照提高3.9%、8%、13.5%。

2.5 涂膜處理對黃瓜抗氧化酶活性的影響

SOD是果蔬體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠將·O2-歧化成H2O2，進而APX、CAT和GR將H2O2清除出去，維護活性氧代謝平衡，防止對細胞膜造成傷害。

由圖5-a可知，黃瓜果實內(nèi)的SOD活性初期呈上升趨勢，隨后呈下降趨勢，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理促進SOD活性上升并抑制其下降，保持較高的活性。第3天至貯藏結束其酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。

由圖5-b可知，黃瓜果實的APX活性在貯藏過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理促進APX活性上升并抑制其下降，第6天至貯藏結束其活性顯著高于對照(P<0.05)。

由圖5-c可知，黃瓜果實隨著貯藏時間的延長CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理保持較高CAT活性，第3天至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

由圖5-d可知，黃瓜果實在貯藏期間隨時間的延長GR活性呈先上升后下降趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理保持較高的酶活性，第6天至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

a-SOD活性；b-APX活性；c-CAT活性；d-GR活性
圖5 不同涂膜處理對黃瓜抗氧化酶活性的影響
Fig.5 Effect of different coating treatment on antioxidant enzymes activity of cucumber during storage

2.6 涂膜處理對黃瓜·O2-生成速率和H2O2含量的影響

在正常條件下，果蔬活性氧的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，不會傷害細胞。但當遭受低溫冷害時，這種平衡就會被打破，活性氧濃度超過了傷害“闕值”，從而使細胞的正常代謝不能順利進行。由圖6-a可知，黃瓜果實的·O2-生成速率呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理抑制·O2-的上升，第6天至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

由圖6-b可知，黃瓜果實的H2O2含量呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理抑制H2O2含量上升，第6天至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

a-·O2-生產(chǎn)速率；b-H2O2含量
圖6 不同涂膜處理對黃瓜·O2-和H2O2的影響
Fig.6 Effect of different coating treatment on ·O2- and H2O2 of cucumber during storage

2.7 涂膜處理對黃瓜MDA含量和相對膜透性的影響

MDA是細胞膜脂過氧化主要產(chǎn)物，其水平變化反映果蔬遭受低溫冷害膜脂過氧化程度。由圖7-a可知，黃瓜果實的MDA含量呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理抑制MDA含量上升，第6天至貯藏結束與對照差異達顯著水平(P<0.05)。

相對膜透性是反映果蔬細胞膜完整性重要指標。由圖7-b可知，在貯藏期間，黃瓜的相對膜透性呈現(xiàn)上升趨勢，前后期上升緩慢，中期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理抑制了相對膜透性的上升，第6天至貯藏結束與對照差異顯著(P<0.05)。

a-MDA含量；b-相對細胞膜透性
圖7 不同涂膜處理對黃瓜MDA含量和相對膜透性的影響
Fig.7 Effect of different coating treatment on MDA content, and cell membrane relative permeability of cucumber during storage

3 討論

低溫貯運是黃瓜采后有效的保鮮方法之一，但不適宜低溫容易誘發(fā)冷害。冷害導致黃瓜品質裂變，貯藏中或出庫后腐爛嚴重，造成巨大的經(jīng)濟損失。本試驗結果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理顯著抑制了黃瓜果實冷害的發(fā)生(圖1)，降低了腐爛率(圖2-b)，并保持較高的硬度和抗壞血酸品質指標(圖4)，且復合涂膜處理的效果最為顯著。殼聚糖-ZnO-褪黑素復合涂膜可在黃瓜表面形成一層選擇性透過膜，一方面防止機械損傷，起到保護作用；另一方面對青霉、灰霉菌等有較強的殺菌作用，減輕果實腐爛；第三方面減輕果實冷害。殼聚糖-ZnO-褪黑素復合涂膜處理操作簡單、價格便宜、無毒副作用，因而在黃瓜果實冷鏈貯運中具有較好的應用前景。

采后果蔬失重主要是由蒸騰失水和呼吸作用對營養(yǎng)物質消耗引起。當果蔬遭受冷害后呼吸強度會大幅增加，營養(yǎng)物質消耗增多，導致果蔬失重率增高。本試驗結果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理顯著降低了黃瓜失重率(圖2-a)，延緩呼吸速度上升(圖3)。褪黑素處理降低黃瓜失重率與抑制呼吸作用有關。一方面褪黑素可通過調(diào)節(jié)呼吸通路比例和電子傳遞鏈代謝途徑，降低營養(yǎng)物質的呼吸消耗水平；另一方面褪黑素可維持較高的ATP和能荷水平，高水平的ATP和能荷通過對糖酵解酶的變構調(diào)節(jié)和線粒體電子傳遞的反饋調(diào)節(jié)，降低營養(yǎng)物質的呼吸消耗水平。相似的抑制果蔬呼吸作用減少營養(yǎng)物質消耗的褪黑素處理已在青花菜[9]、菜苔[16]等果蔬中得以證實，但在黃瓜上的深層機理尚需進一步研究。而殼聚糖-ZnO和復合涂膜處理降低黃瓜失重率可能與黃瓜表面涂膜形成阻隔膜有關。一方面阻隔膜可抑制果實水分蒸騰，另一方面可延緩果實內(nèi)外氣體交換，形成低氧高二氧化碳的環(huán)境，進而抑制果實呼吸作用，減少營養(yǎng)物質消耗。相似的抑制呼吸和蒸騰作用減少果蔬失重的殼聚糖復合涂膜處理已在沙糖桔[3]、番石榴[8]等果實中證實。

正常情況下果蔬體內(nèi)活性氧產(chǎn)生速率與清除速率基本相等，細胞內(nèi)活性氧不會對膜產(chǎn)生傷害。當果蔬處于低溫逆境，活性氧產(chǎn)生速率大于清除速率，造成活性氧積累，過多的活性氧攻擊細胞膜，引起膜脂過氧化作用，進而毒害細胞，導致果蔬發(fā)生冷害。大量采后處理如甜菜堿[21]、γ-氨基丁酸[22]、1-MCP[23]等可通過提高抗氧化酶活性減輕果蔬冷害。本試驗結果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均提高SOD、APX、CAT、GR抗氧化酶活性(圖5)，有利于清除·O2-和H2O2(圖6)，使其保持在較低水平，進而延緩膜脂化進程，使MDA含量和相對膜透性處于較低水平(圖7)，最終減輕黃瓜冷害。相似的提高抗氧化酶活性減輕果蔬冷害的殼聚糖復合涂膜處理已在石榴[24]、荔枝[25]等果實中得以證實。

4 結論

殼聚糖-ZnO、褪黑素和復合涂膜處理均可抑制黃瓜果實冷害發(fā)生，降低失重率和腐爛率，延緩呼吸速率上升，保持較高的硬度和抗壞血酸含量，并提高SOD、APX、CAT、GR抗氧化酶活性，抑制·O2-生成速率和H2O2含量的上升，延緩MDA積累和相對膜透性上升，最終抑制了黃瓜冷害的發(fā)生。其中殼聚糖-ZnO-褪黑素復合涂膜處理效果最為顯著，而且無毒副作用、操作簡單、價格低廉，因而在黃瓜抑制冷害方面具有廣闊的應用前景。