益生菌發(fā)酵豆乳對提高結(jié)合態(tài)大豆異黃酮轉(zhuǎn)化的效果

大豆富含維生素、異黃酮、蛋白質(zhì)、膳食纖維及不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是人類主要的植物蛋白來源之一[1]。豆乳是大豆經(jīng)過加工后獲得的一種飲料，因其具有獨特的風(fēng)味、營養(yǎng)物質(zhì)豐富且易吸收而深受大眾喜歡。對于營養(yǎng)不良的人群以及牛奶供應(yīng)不足的人群來說，豆乳蛋白的營養(yǎng)價值高且更容易被人體吸收[2]。益生菌為一類對機體有益的活性微生物，可以平衡機體腸道內(nèi)菌群，同時也可以產(chǎn)生活性物質(zhì)，促進人體健康[3]。乳酸菌是一類存在于人體胃腸道中的多效益生菌，可以降低膽固醇水平，具有抵抗低酸堿度和高膽鹽的能力，研究價值非常高[4]。發(fā)酵豆乳由滅菌豆乳經(jīng)過益生菌發(fā)酵而形成，其具有豆香味，保留了豆乳原有營養(yǎng)價值的同時減少了高脂飲食引起的高脂血癥和肝損傷[5]，可改善低聚糖的消化率[6-7]，同時減少草酸、植酸、蛋白酶抑制劑、脲酶等抗營養(yǎng)成分[8-9]。此外，通過益生菌的發(fā)酵，可將結(jié)合型的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為更易被人體消化吸收的游離型大豆異黃酮[10-11]。大豆異黃酮被稱為天然植物雌激素，雖然對機體健康有益，但主要是以結(jié)合態(tài)的大豆異黃酮存在，即為糖苷形式，難以被人體消化吸收[12]。當(dāng)人體攝入含有大豆異黃酮的食物后，游離型的大豆異黃酮可直接在小腸被吸收，而結(jié)合型的大豆異黃酮則在腸道中被β-葡萄糖苷酶水解，轉(zhuǎn)化成游離型的苷元從而被機體消化吸收，因此游離型的大豆異黃酮消化吸收率更高[13]。同時其在預(yù)防骨質(zhì)疏松、心血管疾病、神經(jīng)保護和抗腫瘤等疾病方面有一定的生理功效。并且大豆異黃酮苷元具有較高的市場價格，因此提高豆類食品中苷元類物質(zhì)的含量，增加大豆異黃酮資源的利用度，對保健食品的開發(fā)具有重要意義。

本實驗為探究益生菌在全豆乳發(fā)酵中對結(jié)合態(tài)大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化，以干酪乳桿菌(Lacticaseibacillus casei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)分別發(fā)酵全豆乳，以發(fā)酵豆乳的pH值降到4.5為發(fā)酵終點，測定發(fā)酵期間pH值、滴定酸度、活菌數(shù)、表觀黏度、游離氨基氮和大豆異黃酮含量的變化，并對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，為益生菌發(fā)酵豆乳的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(Lacticaseibacillus casei)CICC 23488、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CICC 22696，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)BNCC 185342，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素標準品均為HPLC級，西安晶博生物科技有限公司，含量≧98%。實驗所有水均為由Q-Grad?超純水系統(tǒng)制備的超純水(18.2 MΩ)；其他試劑均為分析純及以上級別，Sigma-Aldrich。

全豆乳產(chǎn)品，陜西秦豆園農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)并提供。

1.1.2 儀器設(shè)備

HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；HaierBCD-206T冰箱，青島海爾股份有限公司；VisionPlus pH6178 pH劑，安徽賽科環(huán)?？萍加邢薰荆籝UEJIN超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHIMADZU高效液相色譜，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；TGL-16 gR高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BROOKFIELD DV-E型黏度計，上海一恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化與菌懸液制備

將-80 ℃保存的L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別培養(yǎng)在MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，12 h。為了確保益生菌生長活力達到良好的狀態(tài)，按照活化培養(yǎng)液體積分數(shù)為3%的接種量連續(xù)傳代3次。每次使用前各菌株均在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2代。以上操作均在超凈工作臺中完成。取10 mL活化培養(yǎng)的種子液制成108 CFU/mL菌懸液。

1.2.2 全豆乳的制作工藝

選料篩選(精選非轉(zhuǎn)基因大豆，顆粒飽滿)→浸泡、煮豆→制漿→均質(zhì)→罐裝→殺菌(超高溫、短時連續(xù)殺菌)→冷卻→4 ℃保藏

1.2.3 發(fā)酵全豆乳的制備

取300 mL按1.2.2制作的全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，按照3%(體積分數(shù)，下同)接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃條件下發(fā)酵至終點，將發(fā)酵好的全豆乳于4 ℃冷藏備用。

1.2.4 益生菌在全豆乳中的發(fā)酵特性及活性物質(zhì)的含量變化

取300 mL全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，以3%接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定其pH值、滴定酸度、表觀黏度直至發(fā)酵結(jié)束(pH 4.5)，測定發(fā)酵豆乳活菌數(shù)、游離氨基氮、大豆異黃酮含量。

1.2.4.1 主要理化指標的測定

水分的測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，以直接干燥法進行測定；灰分的測定參考 GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》，以灼燒重量法進行測定；脂肪含量的測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》，以索氏抽提法進行測定；蛋白質(zhì)含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》，以凱氏定氮法進行測定。

pH值用pH計在室溫下檢測；滴定酸度：準確稱取發(fā)酵全豆乳樣品5 g于100 mL錐形瓶中，加入40 mL超純水，用玻璃棒攪拌均勻，加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色且30 s內(nèi)顏色不消失。滴定酸度(吉爾涅爾度°T)為100 mL發(fā)酵豆乳消耗 0.1 mol/L NaOH的體積(mL)。消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH相當(dāng)于1 °T。

表觀黏度使用BROOKFIELD DV-E型黏度計測定發(fā)酵全豆乳黏度；游離氨基氮參考CHURCH等[14]的方法，用鄰苯二甲醛衍生比色法測定。

1.2.4.2 活菌計數(shù)

取一定量的發(fā)酵全豆乳，用無菌水進行梯度稀釋，然后選取稀釋10-5、10-6、10-7倍的發(fā)酵全豆乳用平板傾注法測定活菌數(shù)。37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，記錄菌落總數(shù)，用CFU/mL表示。

1.2.4.3 感官評定

參照文獻[15]的方法，邀請從事食品研究的人員男女各5名進行感官評定，每次品嘗需在口中細細品味5 s以上并用舌頭攪動發(fā)酵全豆乳。分別從組織狀態(tài)、氣味、口感和質(zhì)地打分，每次品嘗前需充分漱口，評分標準見表1。

表1 感官評分表
Table 1 Sensory evaluation standard

1.2.4.4 發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮含量的測定

參照 GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法》。

樣品預(yù)處理：取發(fā)酵豆乳5 mL于50 mL容量瓶，加入80%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液至接近刻度線，然后以100 W功率超聲振蕩40 min。超聲結(jié)束后用80%甲醇定容，搖勻。取適量樣品溶液以8 160 r/min離心15 min。將上清液過0.45 μm濾膜后備用。

HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAXSB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.5%甲酸超純水。流速1 mL/min；波長260 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序
Table 2 Gradient elution procedures

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±SD”表示。采用SPSS 15.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，Origin 7.0軟件繪圖。文中上標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全豆乳主要理化指標的測定結(jié)果

本實驗制備的全豆乳水分含量為81.49%，灰分、脂肪和蛋白質(zhì)含量分別為1.15%、2.78%和4.35%。

2.2 三株益生菌對全豆乳的發(fā)酵特性

2.2.1 全豆乳發(fā)酵過程中pH值的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，每隔2 h測定發(fā)酵期間的pH值至發(fā)酵終點，結(jié)果如圖1所示。

圖1 三株益生菌發(fā)酵全豆乳pH值的變化
Fig.1 Changes in pH value of whole soymilk fermented by three probiotics

L.casei和L.plantarum發(fā)酵全豆乳pH值下降的速度較快，而L.acidophilus發(fā)酵全豆乳在0～7 h時pH值下降緩慢，7～14 h時呈快速下降趨勢。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳到達終點(pH 4.5)用時最短，為7 h；而L.acidophilus發(fā)酵全豆乳到達終點用時最長，為20 h，這可能是由于其蛋白水解能力較弱造成的。CHURCH等[14]用單一益生菌發(fā)酵豆乳，結(jié)果顯示達到發(fā)酵終點用時較長，與本研究所得結(jié)論基本一致。

2.2.2 全豆乳發(fā)酵過程中滴定酸度值的變化

由圖2可知，L.acidophilus發(fā)酵全豆乳在0～6 h時滴定酸度值變化緩慢，然后呈現(xiàn)快速上升趨勢。L.plantarum發(fā)酵全豆乳在發(fā)酵結(jié)束時滴定酸度值最高，為66.17 °T，與L.acidophilus發(fā)酵全豆乳滴定酸度值沒有顯著差異。而L.casei發(fā)酵全豆乳在發(fā)酵結(jié)束時滴定酸度值顯著低于其他益生菌發(fā)酵的樣品(P<0.05)，為32.83 °T。

圖2 三株益生菌發(fā)酵全豆乳滴定酸度值的變化
Fig.2 Changes in titration acidity of whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.3 全豆乳發(fā)酵過程中表觀黏度的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，每隔2 h測定發(fā)酵期間的黏度值至發(fā)酵終點，結(jié)果如圖3所示。

圖3 三株益生菌發(fā)酵全豆乳黏度的變化
Fig.3 Changes in viscosity of whole soymilk fermented by three probiotics

3株益生菌發(fā)酵全豆乳黏度呈現(xiàn)快速上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時均在1.0～1.4 Pa·s，其中L.casei發(fā)酵全豆乳黏度略微高于其他益生菌，為1.397 Pa·s。L.casei發(fā)酵全豆乳表觀黏度在短時間內(nèi)快速上升，這可能是由于益生菌的快速增殖使得乳酸含量升高，大豆蛋白凝固形成酸凝膠，導(dǎo)致黏度迅速增加[16]。其他2種菌發(fā)酵全豆乳的表觀黏度變化比較平緩，這與它們較長的發(fā)酵時間相吻合，表明這2種菌增殖速度相對較慢，相應(yīng)的乳酸含量增加也較慢，表觀黏度也因此呈現(xiàn)平緩上升的趨勢。

2.2.4 全豆乳發(fā)酵起始和結(jié)束時的活菌數(shù)

發(fā)酵乳制品中活菌數(shù)須在106 CFU/mL以上且能在腸道中存活才能發(fā)揮其益生特性[17]。由表3可知，發(fā)酵結(jié)束時，3株益生菌發(fā)酵全豆乳活菌數(shù)均顯著升高(P<0.05)，均>108 CFU/mL。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳到達發(fā)酵終點時活菌數(shù)最高為2.03×109 CFU/mL。這可能是因為發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些碳源如水蘇糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖等，這些物質(zhì)可作為發(fā)酵菌的能量來源，加速了發(fā)酵菌的生長增殖。

表3 發(fā)酵起始和結(jié)束時的活菌數(shù) 單位：lg CFU/mL

Table 3 Number of viable bacteria at the beginning and the end of fermentation

注：同行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 全豆乳發(fā)酵過程中游離氨基氮的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，測定發(fā)酵結(jié)束時的游離氨基氮的含量，結(jié)果如圖4所示。發(fā)酵結(jié)束時，L.acidophilus的蛋白質(zhì)水解能力最強，其發(fā)酵結(jié)束時游離氨基氮的含量為3.09 mmol/L。而L.casei的蛋白質(zhì)水解能力較其他2株菌弱，發(fā)酵結(jié)束時游離氨基氮的含量為2.39 mmol/L。其可能原因是發(fā)酵時間越長，全豆乳中大豆蛋白水解越徹底。菌株的類型和發(fā)酵時間可能影響蛋白水解的活性[18]。此結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致。

圖4 三株益生菌發(fā)酵全豆乳游離氨基氮的變化
Fig.4 Changes of free amino nitrogen in whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.6 感官評定

圖5為發(fā)酵結(jié)束后于4 ℃冰箱貯藏12 h后全豆乳的感官評價結(jié)果。由圖5可知，L.casei發(fā)酵全豆乳感官評分最高，L.plantarum次之，L.acidophilus最低。L.casei發(fā)酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產(chǎn)品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜、口感細膩、無豆腥味、味道可口，符合大眾口味。因此，L.casei更適合發(fā)酵有良好口感的豆乳，開發(fā)出暢銷大眾的新產(chǎn)品。

圖5 三株益生菌發(fā)酵全豆乳感官評分
Fig.5 Sensory scores of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3 三株益生菌發(fā)酵全豆乳中大豆異黃酮的含量

2.3.1 原全豆乳中大豆異黃酮含量的測定

大豆異黃酮類物質(zhì)中主要包括大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素等活性成分。通過益生菌發(fā)酵將大豆中糖苷形式的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元形式的大豆異黃酮，可極大增加其消化吸收率。

如圖6所示，原全豆乳主要含大豆苷和染料木苷，含量分別為67.30、104.6 μg/mL，苷元和染料木素的含量較少，分別為3.13、2.43 μg/mL。這與大豆異黃酮中，苷元占2%～3%，糖苷占97%～98%的結(jié)果一致[12]。

圖6 原全豆乳中大豆異黃酮含量
Fig.6 Soy isoflavone content in original whole soymilk

2.3.2 大豆苷和大豆苷元在全豆乳發(fā)酵期間的變化

由圖7-a可知，L.casei和L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中大豆苷含量在發(fā)酵結(jié)束時顯著下降(P<0.05)，L.plantarum發(fā)酵全豆乳中大豆苷含量在發(fā)酵前后沒有顯著差異(P>0.05)。而圖7-b顯示3株益生菌發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量在發(fā)酵前后均顯著上升(P<0.05)。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量為6.23 μg/mL，是原全豆乳的2.0倍；L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量為5.73 μg/mL，是原全豆乳的1.8倍；L.plantarum發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量最高，為9.59 μg/mL，是原全豆乳的3.1倍。說明L.plantarum能夠很好地分解糖苷型大豆苷，生成游離型的大豆苷元。

a-大豆苷含量；b-大豆苷元含量
圖7 三株益生菌發(fā)酵全豆乳大豆苷和大豆苷元的變化
Fig.7 Changes of daidzin and daidzein of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3.3 染料木苷和染料木素在全豆乳發(fā)酵期的變化

由圖8-a可知，3株益生菌發(fā)酵全豆乳中染料木苷含量在發(fā)酵結(jié)束時均有下降，其中L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中染料木苷含量下降最明顯，下降了13.1%。而圖8-b顯示，3株益生菌發(fā)酵全豆乳中染料木素的含量經(jīng)發(fā)酵后顯著上升(P<0.05)，其含量分別增加到12.97、8.57、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的5.3、3.5、7.7倍。其中，L.plantarum發(fā)酵全豆乳中染料木素含量最高。這與發(fā)酵過程苷類物質(zhì)水解為對應(yīng)苷元物質(zhì)的結(jié)論一致[19]。

a-染料木苷含量；b-染料木素含量
圖8 三株益生菌發(fā)酵全豆乳染料木苷和染料木素的變化
Fig.8 Changes of genistein and genistein of whole soymilk fermented by three probiotics

3 結(jié)論

本研究以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別發(fā)酵全豆乳，以pH值降到4.5為發(fā)酵終點。發(fā)酵期間，3株益生菌發(fā)酵全豆乳pH值顯著下降，而滴定酸度和表觀黏度均顯著升高(P<0.05)。L.acidophilus發(fā)酵全豆豆乳到發(fā)酵終點用時最長，為20 h，大豆蛋白水解徹底，所以游離氨基氮含量最高，為3.09 mmol/L。發(fā)酵結(jié)束時，3株益生菌發(fā)酵全豆豆乳的活菌數(shù)均>108 CFU/mL。

L.casei發(fā)酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產(chǎn)品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜，無豆腥味，味道可口，符合大眾口味，適合用于發(fā)酵出具有良好口感的豆乳。

發(fā)酵全豆乳大豆苷元、染料木素含量較原全豆乳中有顯著升高(P<0.05)。其中，L.plantarum發(fā)酵全豆豆乳中大豆苷元和染料木素含量最高，為9.59、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的3.1、7.7倍。因此L.plantarum發(fā)酵豆乳可顯著提高結(jié)合態(tài)大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化效率，提高了游離態(tài)大豆異黃酮的含量，從而增加人體對大豆異黃酮的消化吸收率，具有更高的營養(yǎng)保健價值。