白酸湯發(fā)酵過程中微生物多樣性及有機酸動態(tài)變化研究

白酸湯是以大米、糯米為原料，由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成的傳統(tǒng)調(diào)味品，具有酸鮮純正、清涼爽口的獨特風(fēng)味，在西南地區(qū)廣受歡迎[1]，有悠久的食用歷史。白酸湯含有豐富的益生菌、有機酸、礦物質(zhì)、維生素等物質(zhì)，對降低腸道pH、促進人體利用營養(yǎng)物質(zhì)、抑制致病菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防消化道疾病等有重要作用[2-5]。然而長期以來，白酸湯大都是小作坊生產(chǎn)，為數(shù)不多的酸湯企業(yè)采用的也都是傳統(tǒng)自然發(fā)酵，生產(chǎn)規(guī)模小、發(fā)酵周期長、受環(huán)境影響大、酸湯質(zhì)量不穩(wěn)定，嚴重限制了白酸湯大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[6]。

近幾年，關(guān)于白酸湯中微生物群落和有機酸組成的研究越來越多，但對其相關(guān)性分析的文獻極少。熊瑛等[7]對貴州5個不同地區(qū)酸湯中的有機酸進行測定，發(fā)現(xiàn)乳酸占總酸70%以上，其次為乙酸、檸檬酸。石敏等[8]通過傳統(tǒng)分離、計數(shù)法發(fā)現(xiàn)凱里白酸湯中優(yōu)勢微生物有乳桿菌、明串珠菌和醋酸桿菌。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，宏基因技術(shù)越來越多的被應(yīng)用于發(fā)酵食品中，發(fā)酵食品中復(fù)雜的微生物群落組成、變化以及功能被越來越多的學(xué)者關(guān)注[9-10]。本實驗采用高通量測序技術(shù)對白酸湯發(fā)酵過程中微生物群落組成進行分析，同時通過高效液相色譜法測定其有機酸含量，并采用雙向正交偏最小二乘法(orthogonal function partial least squares，O2PLS)對微生物群落變化和有機酸含量之間的相關(guān)性進行分析，確定與有機酸含量相關(guān)性高的微生物種類。為進一步篩選、分離白酸湯中優(yōu)勢微生物菌種，為直投式發(fā)酵劑研發(fā)，實現(xiàn)白酸湯發(fā)酵過程的精準調(diào)控，提高白酸湯產(chǎn)品生產(chǎn)效率與品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老酸湯，貴州亮歡寨生物科技有限公司；安琪甜酒曲，安琪酵母股份有限公司；糯米粉，市售；甲醇，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；活性炭，重慶川東化工(集團)有限公司；磷酸、乳酸、蘋果酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司；丁二酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

LDZM-60L型立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150BⅢ型生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀、SPD-M20A型二極管陣列檢測器，日本島津公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 白酸湯制作工藝流程及操作要點

原料→煮沸→冷卻→液化→滅菌→冷卻→接種老酸湯→36 ℃恒溫培養(yǎng)→白酸湯

操作要點：原料中糯米粉和水的料液比為1∶50(g∶mL)；安琪甜酒曲添加量為0.4%；老酸湯接種量為10%；每24 h取樣，-18 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 有機酸測定

采用高效液相色譜法[7]，稱取酸湯樣品10 g，加入活性炭0.2 g，純凈水定容至50 mL，振蕩混勻，5 000 r/min離心10 min，上清液0.22 μm水系濾膜過濾，測定乳酸、乙酸、蘋果酸和丁二酸含量。

1.3.3 微生物多樣性測定

將所采集樣本送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測定處理。具體測定流程為：微生物總DNA提取，對細菌基因組V3～V4區(qū)使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)進行擴增，真菌ITS區(qū)使用正向引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、反向引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進行擴增[11-13]，將擴增產(chǎn)物進行回收純化，熒光定量處理，在Illumina MiSeq平臺上對其進行測序。

數(shù)據(jù)處理與分析：使用SMRT Link軟件，將所有的subreads進行相互比對和質(zhì)量校正，自我糾錯后得到高質(zhì)量的一致性序列CCS reads，根據(jù)雙端barcode標簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)。然后將其進行聚類，其中相似性≥97%的序列歸為1個OTU，將OTU代表序列與Silva數(shù)據(jù)庫[14]進行比對和物種注釋，最后對有效數(shù)據(jù)進行OTUs豐度、Alpha和Beta多樣性等分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

分別采用系統(tǒng)軟件SPSS和SIMCA-p進行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酸湯發(fā)酵過程中有機酸含量變化

在白酸湯發(fā)酵過程中，有機酸總量呈逐漸上升的趨勢，如圖1所示，6 d后有機酸含量保持不變，說明此時白酸湯發(fā)酵基本結(jié)束。其中乳酸和乙酸含量隨著發(fā)酵時間增加而穩(wěn)定增長，在第6天均達最大值，分別為5.58和1.04 mg/mL；蘋果酸含量先降后增，在第0天時為0.17 mg/mL，第3天降至0.09 mg/mL，4～6 d逐漸增長，最終含量為0.19 mg/mL；丁二酸在0～3 d時未檢出，4～6 d隨發(fā)酵時間呈直線上升，在第6天達到最高為0.33 mg/mL。乳酸和乙酸含量在白酸湯發(fā)酵過程中占有機酸總含量的95%以上，是白酸湯中主要有機酸。

圖1 白酸湯發(fā)酵過程中有機酸含量變化
Fig.1 Changes of organic acid content during fermentation of white acid soup

2.2 白酸湯發(fā)酵過程中微生物變化

2.2.1 白酸湯發(fā)酵過程中微生物的α多樣性分析

Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可以用來評價菌群豐富度[15]，如表1所示，在白酸湯發(fā)酵過程中，細菌的物種豐富度呈先升高后降低的趨勢，Ace指數(shù)在第3天時最高為111，比第0天增長了81.97%，在第8天時降至0；Chao指數(shù)在第5天時最高為129，比第0天增長了111.48%，在第8天時降低至63。真菌物種豐富度隨發(fā)酵時間增長而持續(xù)降低，在第0天時 Chao指數(shù)和Ace指數(shù)為50.07和49.75，在第8天時為38.13和37.75，分別降低了23.85%和24.12%。

菌群多樣性通過Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來評價[16]。細菌物種多樣性隨發(fā)酵時間的變化也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，Simpson指數(shù)變化不明顯，Shannon指數(shù)在第5天達到最大為4.73，后持續(xù)減小，第8天時降至3.81。Shannon指數(shù)顯示真菌物種多樣性在第0天時最高為1.77，后持續(xù)降低至0.87。Simpson指數(shù)顯示真菌物種多樣性在第4天時最高為0.46，比第0 天增長了109.09%。

細菌的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)及Shannon指數(shù)均大于真菌，說明細菌菌群豐富度和物種多樣性均大于真菌，由此可見細菌在白酸湯發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用更大。石敏等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，白酸湯在發(fā)酵1～4 d有效酸度和總酸含量持續(xù)增加，總糖含量持續(xù)降低，在第5天后趨于平緩。本實驗中，在白酸湯發(fā)酵5 d時，物種豐富度及多樣性最高，微生物大量繁殖，推測是米湯中營養(yǎng)成分被快速消耗，后續(xù)無法滿足更多菌群的生長需求，導(dǎo)致微生物生長受到抑制。

表1 發(fā)酵過程中的微生物α多樣性分析
Table 1 Analysis of microbial α diversity during fermentation

2.2.2 白酸湯發(fā)酵過程中微生物β多樣性分析

對發(fā)酵不同時間的白酸湯進行種水平上的層級聚類分析，探究發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖2所示。

a-細菌；b-真菌
圖2 白酸湯發(fā)酵過程中種水平上的層級聚類
Fig.2 Hierarchical clustering on species level in the fermentation of white sour soup

樣品之間越接近，其種水平上的結(jié)構(gòu)就越相似，3～6 d，7～8 d 和 0～2 d 的細菌菌群分為3簇，有明顯差異性。0、4、6～8 d 的真菌菌群也分為3簇且差異性顯著。由此說明，白酸湯發(fā)酵主要經(jīng)歷前(0～2 d)、中(3～6 d)、后(6～8 d)3個階段，且這3個階段微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。發(fā)酵前期，細菌優(yōu)勢菌群為維氏乳桿菌(Lactobacillus vini)和羅旺醋桿菌(Acetobacter lovaniensis)，真菌物種多樣性在此期間最高，優(yōu)勢菌群有毛榛畢赤酵母(Pichia mandshurica)、桔假絲酵母(Candida quercitrusa)和矮小假絲酵母(Kazachstania humilis)。發(fā)酵中期，細菌物種多樣性最高，優(yōu)勢菌群為法式醋酸桿菌(Acetobacter farinalis)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、類谷糠乳桿菌(Lactobacillus parafarraginis)和液化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter liquefaciens)，真菌優(yōu)勢菌群為毛榛畢赤酵母。發(fā)酵后期，細菌優(yōu)勢菌群為維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌，真菌優(yōu)勢菌群為毛榛畢赤酵母。

2.2.3 群落結(jié)構(gòu)組分分析

如圖3所示，白酸湯中細菌組成在種水平上主要有維氏乳桿菌(Lactobacillus vini)、法式醋酸桿菌(Acetobacter farinalis)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、羅旺醋桿菌(Acetobacter lovaniensis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、解淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylolyticus)等12種菌種。發(fā)酵前期優(yōu)勢菌群為維氏乳桿菌和羅旺醋桿菌，其豐度分別為41.66%、23.53%，維氏乳桿菌比第0天增長了314.11%。法式醋酸桿菌和布氏乳桿菌是發(fā)酵中期的優(yōu)勢菌群，其豐度分別達到25.08%和32.16%，類谷糠乳桿菌(Lactobacillus parafarraginis)和液化葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter liquefaciens)在此期間豐度也達到最大分別為10.8%和10.5%。發(fā)酵后期維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌的豐度達到80%，說明在發(fā)酵后期維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌起主導(dǎo)作用。

白酸湯中真菌的物種多樣性比細菌少，在種水平上主要有毛榛畢赤酵母(Pichia mandshurica)、桔假絲酵母(Candida quercitrusa)、矮小假絲酵母(Kazachstania humilis)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranifaciens)、Zygoascus meyerae、三角酵母(Trigonopsis variabilis)。白酸湯第0天優(yōu)勢菌群為毛榛畢赤酵母、桔假絲酵母、矮小假絲酵母，其占比分別為12.4%、20.2%、14.8%，發(fā)酵過程中，毛榛畢赤酵母迅速繁殖成為發(fā)酵中后期優(yōu)勢菌群，在第8天時豐度達到77.9%。三角酵母相對豐度也由0.04%增長至1.08%。其他酵母生長均被抑制。

a-細菌；b-真菌
圖3 白酸湯發(fā)酵過程中種水平細菌及真菌相對豐度變化
Fig.3 Changes of relative abundance of bacteria and fungi at species level during fermentation of white sour soup

王琪琪等[17]研究結(jié)果表明：白酸湯中優(yōu)勢細菌為哈氏乳桿菌(Lactobacillus harbinensis,43.46%)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri,31.25%)等，優(yōu)勢真菌為膜璞畢赤酵母(Pichia membranifaciens,88.31%)和博伊丁假絲酵母(Candida boidinii,6.39%)。與本實驗結(jié)果相比，在屬水平上一致，在種水平上有明顯差異，可見白酸湯發(fā)酵菌種的多樣性。白酸湯是以大米、糯米為原料，由醋酸菌、乳酸菌、酵母菌等微生物發(fā)酵而成，但是不同公司的白酸湯主要發(fā)酵菌種不一致，這可能是導(dǎo)致市售白酸湯風(fēng)味不統(tǒng)一的重要原因。

2.2.4 有機酸及優(yōu)勢菌群相關(guān)性分析

2.2.4.1 白酸湯發(fā)酵過程與有機酸相關(guān)的微生物重要性指標分析

利用O2PLS[18]模型對細菌和真菌相對豐度與有機酸含量進行相關(guān)性分析，獲得菌群豐度與有機酸含量相關(guān)性的自變量重要性指標[變量投影重要性(variable importance projection，VIP)(pred)]。如圖4所示，細菌和真菌的VIP(pred)均在0.5～1.5。大于1.4的有2個種，在1.3～1.4的有4個種，在1.2～1.3的有2個種，在1.0～1.2的有7個種。其中法式醋酸桿菌、維氏乳酸桿菌與有機酸相關(guān)重要性最高，選VIP(pred)值>1的15個種進行與有機酸相關(guān)的分析。

圖4 與有機酸相關(guān)的微生物VIP分析
Fig.4 Microbial VIP analysis related to organic acids

圖5 微生物與有機酸相關(guān)性系數(shù)熱圖
Fig.5 Correlation coefficient heatmap of microorganisms and organic acids 注：*代表微生物與有機酸之間差異顯著(P<0.05)； **代表差異極顯著(P<0.01)

2.2.4.2 白酸湯發(fā)酵過程與有機酸相關(guān)微生物分析

選取VIP(pred)值>1的細菌和真菌(種)與有機酸進行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示。

與乳酸呈正相關(guān)的有9個種，負相關(guān)9個種，維氏乳桿菌與乳酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)；與乙酸正相關(guān)的有10個種，負相關(guān)有8個種，法式醋酸桿菌與乙酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)；與蘋果酸正相關(guān)的有9個種，負相關(guān)9個種，解淀粉乳桿菌與蘋果酸含量顯著負相關(guān)(P<0.05)；與丁二酸正相關(guān)的有8個種，負相關(guān)10個種，三角酵母與丁二酸含量顯著正相關(guān)(P<0.05)。本實驗采用靜置發(fā)酵，因此：發(fā)酵初期，發(fā)酵液中可能積累了米湯液化后的糖類物質(zhì)，維氏乳桿菌經(jīng)過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，因此維氏乳桿菌和乳酸極顯著正相關(guān)。隨著發(fā)酵的進行，布氏乳桿菌經(jīng)過異型發(fā)酵將乳酸轉(zhuǎn)化乙酸和乙醇[19]，因此布氏乳桿菌和乳酸顯著負相關(guān)，與乙酸正相關(guān)。發(fā)酵中后期，由于乙醇的產(chǎn)生和發(fā)酵液酸度的降低等原因維氏乳桿菌、布氏乳桿菌等乳桿菌生長受到抑制，法式醋酸桿菌、羅旺醋酸桿菌大量繁殖，乙酸累積，因此醋酸桿菌與乙酸顯著正相關(guān)。蘋果酸和丁二酸為三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物，在產(chǎn)生的同時又作為其他代謝途徑的原料被消耗，所以沒有大量累積。酵母菌在發(fā)酵過程中能代謝產(chǎn)生氨基酸、酶、乙醇等物質(zhì)，為其他微生物的生長提供碳源和氮源[20]，毛榛畢赤酵母含量和乳酸、乙酸含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，三角酵母和丁二酸含量也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

白酸湯產(chǎn)品在西南地區(qū)廣受歡迎，但其發(fā)酵機理和發(fā)酵工藝尚不明確，生產(chǎn)模式也尚未統(tǒng)一。因此，探索白酸湯發(fā)酵過程中微生物的多樣性及有機酸含量動態(tài)變化規(guī)律、分離優(yōu)勢菌株、開發(fā)人工可控發(fā)酵白酸湯，具有十分重要的理論意義和實踐應(yīng)用價值。

通過高通量測序技術(shù)和高效液相色譜法對白酸湯發(fā)酵不同時期樣品的微生物多樣性和有機酸含量進行測定，并利用雙向正交偏最小二乘法(O2PLS)對微生物相對豐度與有機酸含量相關(guān)性進行分析。結(jié)果表明，白酸湯發(fā)酵過程中微生物種類豐富，細菌的生物多樣性遠遠大于真菌生物多樣性。通過在種水平分析細菌和真菌在發(fā)酵過程中的種類和豐度，并與有機酸含量相關(guān)性進行分析推測，發(fā)酵前期，維氏乳桿菌能迅速適應(yīng)新環(huán)境，大量繁殖，豐度達到41.66%，主要發(fā)酵產(chǎn)物乳酸降低了酸湯中pH，同時還參與發(fā)酵過程中氨基酸代謝[21-22]，豐富了產(chǎn)品風(fēng)味。毛榛畢赤酵母和桔假絲酵母生長良好，它們能夠參與碳水化合物代謝和酯類物質(zhì)形成，對產(chǎn)品的香氣和風(fēng)味有重要作用[23]，桔假絲酵母可以通過Ehrlich途徑代謝產(chǎn)生氨基酸小分子，比其他酵母產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)更多[24]。發(fā)酵中期，經(jīng)過前期乳酸發(fā)酵和乙醇發(fā)酵后，酸度的降低和乙醇、乳酸的積累為法式醋酸桿菌和布氏乳桿菌的生長提供了適宜的碳源和環(huán)境，其豐度分別達到 25.08%和32.16%，積累一定量的乙酸。類谷糠乳桿菌和液化葡糖酸醋酸桿菌在此期間豐度達到最大分別為10.8%和10.5%，類谷糠乳桿菌的代謝產(chǎn)物能夠抑制致病菌和腐敗酵母菌的生長[25]，液化葡糖酸醋酸桿菌有多種酶類，可產(chǎn)生多種影響發(fā)酵過程中抗氧化性能變化的重要化合物[26]。發(fā)酵后期，隨著發(fā)酵的進行，白酸湯中營養(yǎng)成分消耗以及pH值持續(xù)下降，許多不耐酸細菌和真菌受到抑制，經(jīng)過白酸湯環(huán)境的多重選擇，白酸湯中微生物趨于穩(wěn)定，維氏乳桿菌和法式醋酸桿菌的豐度達到80%，毛榛畢赤酵母豐度達到77.9%，說明在白酸湯發(fā)酵后期維氏乳桿菌、法式醋酸桿菌和毛榛畢赤酵母起主導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究揭示了白酸湯發(fā)酵過程中與有機酸含量相關(guān)性較高的功能微生物為維氏乳桿菌、法式醋酸桿菌和毛榛畢赤酵母，為進一步篩選、分離白酸湯中優(yōu)勢微生物菌種，研發(fā)直投式發(fā)酵劑，為實現(xiàn)白酸湯發(fā)酵過程的精準調(diào)控，提升白酸湯品質(zhì)穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。