基于感官評價和GC-MS分析嗜鹽芳香酵母 對速成永川豆豉香氣的影響

豆豉是我國歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，根據(jù)制曲過程中微生物的不同分為曲霉型、毛霉型、細菌型和根霉型4種豆豉[1]。傳統(tǒng)永川豆豉是毛霉型豆豉的代表，其豉香濃郁、烏黑油亮、質(zhì)地入口化渣，一直深受消費者的喜愛。但是傳統(tǒng)永川豆豉是通過接種空氣中的微生物自然發(fā)酵，受環(huán)境、季節(jié)等多種因素的影響大，發(fā)酵周期長達1年[2]，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。利用曲霉制曲和低鹽高溫發(fā)酵技術生產(chǎn)的速成永川豆豉能將后發(fā)酵時間縮短為30 d左右，大大提高了生產(chǎn)效率。但速成永川豆豉工藝縮短發(fā)酵周期的同時也會導致豆豉的香氣不足。楊洋等[3]通過Flash Profile法發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)永川豆豉和速成永川豆豉的感官性質(zhì)存在顯著差異。眾多學者發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)永川豆豉的揮發(fā)性物質(zhì)的種類與含量均高于速成永川豆豉[4-6]。因此，提高速成永川豆豉風味物質(zhì)的種類和含量對解決其香氣不足的問題具有重要意義。

與速成永川豆豉相比，傳統(tǒng)永川豆豉在制曲和后發(fā)酵過程中具有更豐富的微生物物種組成[7]，其中酵母[8-9]對傳統(tǒng)永川豆豉的風味具有重要作用。例如漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)有利于酯類和醇類化合物的產(chǎn)生[10]，是東北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的優(yōu)勢酵母[11]。魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)有利于酯類、醇類及吡嗪類化合物的產(chǎn)生，具有甜香、麥芽香等香氣特征，可用于提高醬油的香氣品質(zhì)[12]。此外，多種酵母混合發(fā)酵更有利于特征風味物質(zhì)的增加，Z. rouxii與季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)混合發(fā)酵能夠產(chǎn)生更多的醇類、呋喃酮類、酯類等特征風味物質(zhì)[13]。因此，后發(fā)酵過程中缺失酵母是速成永川豆豉香氣不足的重要原因，但目前關于酵母對豆豉香氣影響的研究還很少。

本研究基于前期對不同菌株單一發(fā)酵、混合發(fā)酵速成永川豆豉的增香效果，用魯氏接合酵母和漢遜德巴利酵母對速成永川豆豉等比例混合發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，通過感官定量描述分析(quantitative description analysis，QDA)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)技術探究嗜鹽芳香酵母在不同發(fā)酵條件下對速成永川豆豉香氣特征和風味物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

速成永川豆豉，重慶永川豆豉有限公司。

試劑：麥芽汁培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；NaCl，重慶躍翔化工有限公司；1,3-二氯苯標準品(純度99.7%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國。

菌株：魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06均由本實驗室從重慶永川豆豉有限公司傳統(tǒng)永川豆豉中分離鑒定保藏。

1.2 儀器與設備

US1709M012氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀、HP-5色譜柱，Agilent公司；57330-U手動固相微萃取進樣器、頂空固相微萃取纖維頭(50/30 DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；JJ-2BS組織搗碎機，常州崢嶸儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；AJ31002精密電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 速成永川豆豉的二次發(fā)酵

將Z. rouxii ZR21接種在含80 g/L NaCl的麥芽汁培養(yǎng)基中，D. hansenii DH06接種在含80 g/L NaCl的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d。在高、中、低溫度(35、20和10 ℃)下菌種等比例混合，以高、低2種濃度接種(105和106 CFU/kg)，二次發(fā)酵速成永川豆豉30、45 d，具體工藝見表1。

表1 永川豆豉樣品信息
Table 1 Information of Yongchuan Douchi samples

1.3.2 感官分析

1.3.2.1 樣品準備

稱取10 g豆豉樣品盛放在30 mL一次性帶蓋透明塑料杯中，3位隨機數(shù)字編碼。

1.3.2.2 感官評價過程

參考文獻[14-15]的方法，7名經(jīng)過培訓的感官評價人員通過18種市售豆豉和12種嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉建立豆豉香氣描述詞。首先感官評價人員獨立產(chǎn)生豆豉香氣描述詞。然后感官評價小組合并意思相近詞語，刪除含義模糊、帶有感情色彩詞語，形成一致的豆豉香氣描述詞及其定義。按照GB/T 29604—2013《感官分析 建立感官特性參比樣的一般導則》的方法，選擇適合中國消費者的產(chǎn)品作為參比樣，并對參比樣的強度達成共識。

感官評價小組根據(jù)建立的豆豉香氣描述詞對12種嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉和速成永川豆豉的香氣進行定量描述分析。每次試驗評價3～4個豆豉樣品，時長約為1.5 h。評價1個樣品后，評價人員通過嗅聞溫熱的濕毛巾緩解嗅覺疲勞，休息5 min后評價下一個樣品。采用0～15分值打分制，0表示無，15表示非常強[16-17]。

1.3.3 揮發(fā)性成分的測定[5-6]

1.3.3.1 頂空固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)

稱取3 g豆豉樣品，粉碎后放入15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入30 μL標準品1,3-二氯苯(10.0 μg/mL)，加蓋密封。在60 ℃水浴鍋中平衡20 min，插入CAR/DVB/PDMS萃取纖維，萃取30 min，將萃取纖維在GC進樣口250 ℃下解吸5 min，進行GC-MS分析。

1.3.3.2 揮發(fā)性成分測定

色譜條件：Hp-5非極性毛細管柱；柱初溫40 ℃，以2 ℃/min的速率升到80 ℃，保持2 min，以2.5 ℃/min的速率升溫到140 ℃，保持1 min，以8 ℃/min的速率升溫到250 ℃；進樣口溫度250 ℃，溶劑延遲5 min，不分流；載氣為氦氣；流量為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；電壓350 V；接口溫度230 ℃；掃描范圍m/z 25～400。

1.3.3.3 定性定量方法

定性分析：采用NIST library譜庫檢索比對進行定性。

定量分析：采用內(nèi)標法進行半定量分析，內(nèi)標物為1，3-二氯苯。含量按公式(1)計算：

(1)

式中：ci,未知化合物含量，ng/g；Si,未知化合物峰面積；S,內(nèi)標物峰面積；c,內(nèi)標物濃度，μg/mL；V,內(nèi)標物體積，μL；m,樣品質(zhì)量，g。

1.3.3.4 香氣活性值(odor activity value，OAV)

OAV按公式(2)計算：

(2)

式中：ci，揮發(fā)性成分的含量，ng/g；OTi，揮發(fā)性成分在參考文獻中的香氣閾值，mg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office Excel 2010對樣本所得數(shù)據(jù)進行整理計算，采用IBM SPSS Statistic 25分析軟件進行單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)；XLSTAT 2019進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價結(jié)果

2.1.1 豆豉香氣特征詞的建立

經(jīng)過15次時長1.5 h的評價單元，感官評價小組對豆豉香氣特征詞進行開發(fā)、合并、刪減，最終建立了10個香氣特征詞，見表2。

表2 豆豉香氣特征詞的定義和參比樣
Table 2 Definitions and references of aroma characteristics terms for Douchi

2.1.2 永川豆豉香氣特征方差分析

對QDA結(jié)果進行單因素方差分析和多重比較分析發(fā)現(xiàn)(表3)，與速成永川豆豉相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的豉香、酸香強度顯著增強(P<0.05)，醬香、豆味、霉味強度顯著降低(P<0.05)，而在高溫、低濃度菌種的條件下發(fā)酵30 d更有利于其香氣特征的變化。

表3 永川豆豉定量描述分析結(jié)果

Table 3 Results of quantitative descriptive analysis of Yongchuan Douchi

注：同一行不同字母表示在P<0.05水平上具有顯著差異

2.1.3 永川豆豉香氣特征PCA

對QDA法的結(jié)果進行PCA，如圖1所示，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉均與速成永川豆豉發(fā)生偏離。與高溫發(fā)酵豆豉相比，嗜鹽芳香酵母在中溫和低溫條件下發(fā)酵的豆豉香氣特征更相似，可能是由于高溫條件下細菌活性增強，酵母發(fā)酵受到一定抑制；但低溫發(fā)酵需要更高的菌種濃度，可能是由于低溫條件下酵母活性較低。與發(fā)酵30 d相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵45 d更有利于香氣特征變化。

圖1 永川豆豉PCA圖
Fig.1 Principal component analysis of Yongchuan Douchi

2.2 永川豆豉揮發(fā)性成分分析[17]

揮發(fā)性成分是評價豆豉香氣的重要指標。本實驗通過SPME-GC-MS共檢測出64種揮發(fā)性成分(見附錄)，包括9種酸類、9種醛類、12種酯類、5種酮類、3種醇類、4種酚類、9種吡嗪類、2種呋喃類、9種烴類和2種其他物質(zhì)。由此看出，豆豉揮發(fā)性成分主要由酸類、醛類、酯類、吡嗪類和烴類物質(zhì)構成。與速成永川豆豉相比，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的酸類、醛類、酯類、酮類、醇類、吡嗪類、呋喃類及其他揮發(fā)性成分含量整體呈增加趨勢，大多烴類物質(zhì)含量呈減少趨勢。

2.3 永川豆豉香氣活性物質(zhì)分析

一般認定，當揮發(fā)性化合物的OAV≥1時對食品香氣具有一定貢獻作用，且OAV越大，其貢獻作用越大。速成永川豆豉共有6種OAV≥1的揮發(fā)性成分，而嗜鹽芳香酵母發(fā)酵的豆豉則有7～12種。由表4可知，嗜鹽芳香酵母提高了速成永川豆豉中異戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、異戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈創(chuàng)木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7種OAV≥1的揮發(fā)性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異己酸乙酯、辛酸乙酯、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。

異戊酸和3-甲基戊酸被認為是豆類發(fā)酵品中香氣的重要貢獻物質(zhì)，提供酸味和哈喇味[22]。2-甲基丁醛、異戊醛和苯乙醛提供麥芽香和蜂蜜味[23]，可能為豆豉香氣提供積極影響。乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異己酸乙酯、辛酸乙酯等酯類物質(zhì)被描述為果香或者花香味[24]，酯類物質(zhì)與酵母發(fā)酵作用有密切聯(lián)系，酵母降解脂質(zhì)發(fā)生酯化反應。同時乙酸乙酯也是傳統(tǒng)永川豆豉特有的主要風味物質(zhì)[6]。2-十一酮提供水果香[25]，可能為豆豉提供甜香。愈創(chuàng)木酚是煙熏味、熏烤味香氣化合物的典型代表[14]，為醬油提供煙熏味[12]，因此，愈創(chuàng)木酚可能與豆豉中煙味有關。2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)提供堅果香[26]；2-戊基呋喃具有綠豆、黃油味[27]，在與其他香氣活性物質(zhì)的共同作用下對豆豉香氣產(chǎn)生積極影響。二甲基三硫具有硫味或洋蔥味，多次在醬油、豆瓣醬等發(fā)酵食品中檢測到[22]，表明該物質(zhì)為發(fā)酵豆制品中的關鍵香氣物質(zhì)。因此，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵的豆豉能有效增加速成永川豆豉中風味物質(zhì)的種類和含量。

表4 永川豆豉中揮發(fā)性成分的閾值和OAV
Table 4 Threshold and OAV of volatile components in Yongchuan Douchi

注：“-”表示未檢測出

3 結(jié)論

通過對不同條件下嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的感官定量描述分析可知，嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的豉香、酸香強度顯著增強(P<0.05)，醬香、豆味、霉味強度顯著降低(P<0.05)，且最佳發(fā)酵條件為35 ℃，接種量105 CFU/kg，發(fā)酵時間30 d。

通過對不同條件下嗜鹽芳香酵母發(fā)酵豆豉的揮發(fā)性成分分析可知，嗜鹽芳香酵母提高了速成永川豆豉中異戊酸、苯甲醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、3-甲基戊酸、異戊醛、苯乙醛、2-十一酮、愈創(chuàng)木酚、2-戊基呋喃的含量，并新增了7種OAV≥1的揮發(fā)性成分，包括2-甲基丁醛、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異己酸乙酯、辛酸乙酯、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪和二甲基三硫。因此，嗜鹽芳香酵母增加了對豆豉香氣具有貢獻作用的揮發(fā)性成分的含量及組成。

綜上所述，通過添加魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)ZR21和漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)DH06進行二次發(fā)酵是實現(xiàn)速成永川豆豉増香的有效途徑。