RP-HPLC同時測定克銀顆粒中的靛藍(lán)和靛玉紅-醫(yī)學(xué)論文

　　克銀顆粒是由青黛、苦參、白花蛇舌草等九味藥組成的復(fù)方制劑，該藥具有清熱解毒、涼血活血、祛風(fēng)止癢的功效，是第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科治療銀屑病的經(jīng)驗方。處方中君藥青黛具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚的功能，用于溫毒發(fā)斑、血熱吐衄、胸痛咳血、口瘡、痄腮、喉痹、小兒驚癇[1-2]。青黛的主要有效成分是靛藍(lán)和靛玉紅，為了有效控制該制劑質(zhì)量，本文采用反相高效液相色譜法同時測定克銀顆粒中青黛主要藥效成分靛藍(lán)和靛玉紅的含量，結(jié)果顯示，所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，為克銀顆粒質(zhì)量控制研究提供了實驗依據(jù)。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器

　　美國Agilent 1100高效液相色譜儀（Agilent 1100泵，Agilent 1100 DAD檢測器，Agilent 2100色譜工作站）；BP211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-32000DB型數(shù)控超聲波儀（昆山超聲儀器有限公司）。

　　1.2 試藥

　　靛藍(lán)對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110716-200610）、靛玉紅對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110717-200204）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純；克銀顆粒（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科制備，批號：20100111、20100118、20100125）。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 溶液的配制

　　2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱量靛藍(lán)對照品3.29 mg，加N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解并稀釋成164.5 μg/mL的靛藍(lán)對照品儲備溶液。另精密稱取3.90 mg靛玉紅對照品，加DMF溶解并稀釋成195.0 μg/mL的靛玉紅對照品儲備溶液。

　　2.1.2 供試品溶液的制備 取克銀顆粒樣品研磨成細(xì)粉，精密稱量1.0 g，加50 mL DMF，超聲處理（250 W，33 kHz）30 min，轉(zhuǎn)入100 mL量瓶中并定容；精密吸取1.0 mL續(xù)濾液，用甲醇稀釋至10 mL的量瓶中，用于靛藍(lán)的含量測定；另取續(xù)濾液5 mL，用甲醇稀釋至10 mL的量瓶中，用于靛玉紅的含量測定。

　　2.1.3 陰性對照溶液的制備 取缺青黛的克銀顆粒處方制備陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

　　2.2 色譜條件

　　色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（80∶20，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃；靛藍(lán)的檢測波長為287 nm，靛玉紅的檢測波長為292 nm。理論板數(shù)分別按靛藍(lán)峰和靛玉紅峰計算均應(yīng)不低于3 000。

　　2.3 系統(tǒng)適用性試驗

　　取供試品溶液、陰性供試品溶液及適當(dāng)濃度的靛藍(lán)、靛玉紅對照品溶液，于不同波長的色譜條件進(jìn)樣。在靛藍(lán)、靛玉紅對照品相應(yīng)色譜峰位置處無其他色譜峰出現(xiàn)，靛藍(lán)的保留時間為5.8 min（287 nm），靛玉紅的保留時間為7.9 min（292 nm）。見圖1～2。

　A.靛玉紅對照品；B.陰性對照樣品；C.克銀顆粒樣品；a.靛藍(lán)峰；b.靛玉紅峰

　　圖2 靛玉紅對照品、陰性對照樣品、克銀顆粒樣品HPLC色譜 

　　2.4 線性關(guān)系考察

　　取“2.1”項下靛藍(lán)對照品儲備液，用甲醇逐步稀釋成0.329、1.650、3.290、8.225、16.450、24.680、32.900 μg/mL，取適量靛玉紅對照品儲備液逐步稀釋成0.390、1.850、3.900、9.250、18.500、28.750、39.000 μg/mL系列濃度的對照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以對照品濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得到靛藍(lán)和靛玉紅靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y = 56.94C-1.749（r = 0.999 8）；Y = 119.1C+19.71（r = 0.999 9）。結(jié)果表明靛藍(lán)在0.329～32.900 μg/mL范圍內(nèi)，靛玉紅在0.390～39.000 μg/mL范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

　　2.5 穩(wěn)定性試驗

　　取供試品溶液，在配制后0、4、8、12、24 h于靛藍(lán)和靛玉紅的色譜條件下分別進(jìn)樣，靛藍(lán)、靛玉紅峰面積的RSD分別為0.86%和0.79%。結(jié)果表明樣品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.6 精密度考察

　　取靛藍(lán)和靛玉紅對照品溶液（靛藍(lán)濃度為16.45 μg/mL、靛玉紅濃度為18.50 μg/mL），于各自色譜條件下同一天連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算靛藍(lán)和靛玉紅日內(nèi)RSD分別為0.78%和0.88%；連續(xù)3 d進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算靛藍(lán)和靛玉紅日間RSD分別為1.03%和1.12%。結(jié)果表明儀器與色譜條件具有良好的精密度。

　　2.7 重復(fù)性試驗

　　取同一批樣品6份，分別按樣品測定方法測定。每10 g克銀顆粒中靛藍(lán)的平均含量為69.850 mg，RSD = 0.92％；靛玉紅的平均含量為2.622 mg，RSD=1.01% 。

　　2.8 加樣回收率試驗

　　精密稱量已知靛藍(lán)和靛玉紅含量的克銀顆粒（每克顆粒劑含靛藍(lán)6.985 0 mg，含靛玉紅0.262 2 mg）1.103 g，加DMF 50 mL，超聲30 min用甲醇定容至100 mL量瓶中，過濾，平行取6份續(xù)濾液各1 mL，分成3組，每組2份，分別加入靛藍(lán)對照品溶液（82.25 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。另平行取6份續(xù)濾液各5.0 mL，分成3組，每組2份，分別加入靛玉紅對照品溶液（97.50 μg/mL）0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。分別于不同波長的色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算靛藍(lán)和靛玉紅的含量，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。 

　　表1 靛藍(lán)和靛玉紅的加樣回收率試驗結(jié)果

　　2.9 樣品含量測定

　　取3批樣品，分別按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，按上述色譜條件分別測定其含量，按外標(biāo)法計算靛藍(lán)與靛玉紅的含量，結(jié)果3批樣品中每袋含靛藍(lán)平均值為68.82 mg，靛玉紅平均值為2.54 mg。結(jié)果見表2。

　　3 討論

　　《中國藥典》2010年版采用液相色譜測定青黛中的靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行控制質(zhì)量。靛藍(lán)和靛玉紅為同分異構(gòu)體，脂溶性均較強(qiáng)，在很多試劑中溶解性較差，《中國藥典》2010年版測定青黛中靛藍(lán)的含量時，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液作為溶劑進(jìn)行超聲處理，以606 nm作為檢測波長，筆者發(fā)現(xiàn)很多液相的紫外-可見檢測器無606 nm的設(shè)置。采用600 nm測定靛藍(lán)的含量，靈敏度低，重復(fù)性差且誤差大，與文獻(xiàn)[3]報道一致。故本文采用檢測波長為287 nm和292 nm分別來測定靛藍(lán)和靛玉紅含量，效果較好。

　　有文獻(xiàn)先用三氯甲烷回流溶解后再用異丙醇和甲醇逐步稀釋的方法配制對照品，本文先以DMF為溶劑，超聲30 min溶解后再用甲醇逐步稀釋，可確保靛藍(lán)與靛玉紅溶解完全，配制過程中無沉淀析出，最終溶劑與流動相相接近。