生脈注射液對創(chuàng)傷失血性休克大鼠免疫功能的影響-醫(yī)學(xué)論文

對創(chuàng)傷失血性休克的研究長期以來一直是臨床和科研工作者的熱點和難點問題。隨著人們對休克微循環(huán)理論和創(chuàng)傷急救技術(shù)的提高，創(chuàng)傷失血性休克的早期死亡率已明顯下降，而后期因感染導(dǎo)致的死亡率則相對升高。近年來，人們已經(jīng)開始密切關(guān)注創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能的變化，并且從不同角度研究創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能改變對機體的影響。目前臨床上對創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能紊亂的防治主要集中在如何抑制過度的炎癥反應(yīng)、如何提高創(chuàng)傷后機體受抑制的免疫功能等方面。在尚未找到安全有效的免疫調(diào)節(jié)藥物基礎(chǔ)上，人們把目光逐漸轉(zhuǎn)向了中醫(yī)中藥研究。與西藥相比，中藥成分多樣化，藥理作用廣泛復(fù)合，不少中藥對免疫具有雙向調(diào)節(jié)作用，且副作用小，來源廣泛，價格便宜，有很大的利用空間，故其對免疫功能的作用正日益受到人們的重視。隨著中醫(yī)藥科研方法的進(jìn)步，很多補益類中藥，無論健脾、補腎、滋陰、壯陽，只要用藥對證（指補虛藥針對虛證狀態(tài)），都可增強細(xì)胞免疫，這幾乎已成為補虛藥的共性。生脈注射液是目前研究較多的經(jīng)典方劑，本研究旨在探討大鼠創(chuàng)傷失血性休克后免疫功能的改變以及應(yīng)用生脈注射液后其免疫功能的變化情況，以期為臨床用藥及進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 實驗動物 健康SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，清潔級，雄性，體重（200±20）g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2003-0002]。分6籠飼養(yǎng)，每籠5只，標(biāo)準(zhǔn)鼠料喂養(yǎng)，自然光照，室溫22～26℃，濕度45%～65%，動物自由攝水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后正式實驗。

　　1.1.2 主要試劑 ①生脈注射液：江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；規(guī)格：20 mL/瓶，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z32021056。②小鼠抗大鼠CD3-FITC抗體：美國Invitrogen/Caltag公司提供；批號：83-MR5301。③小鼠抗大鼠CD4R-PE抗體：美國Invitrogen/Caltag公司提供：批號：83-MR5104。④小鼠抗大鼠CD8 PE-Cy5（PC5）抗體：美國Invitrogen/Caltag公司提供；批號：83-MR5206。⑤溶血素（FCMlysing Solution 100T）：美國MBA公司提供；批號：11-MBA-LS01。⑥磷酸鹽緩沖液（PBS，PH=7.2~7.4）：福州邁新公司；批號：60906006OR。⑦0.9%氯化鈉注射液、林格液、2%戊巴比妥鈉、10%中性甲醛、肝素等，均為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物實驗室提供。

　　1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀：美國BD公司；全自動生化分析儀：7600-010型，日立儀器（蘇州）有限公司；低溫高速離心機：J2、HS型，美國Bekman公司；微量移液器：德國Eppendorf公司；手術(shù)器械：眼科剪、持針器、彎鉗、醫(yī)用縫線等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 實驗動物分組 動物被隨機分為3組，即正常對照組（A組），創(chuàng)傷失血性休克組（B組），生脈注射液治療組（C組），每組各10只。C組大鼠在造模手術(shù)開始前2 d，腹腔注射生脈注射液，每日1次，每次3 mL，直至實驗開始后第3天為止，共5 d。B組在實驗開始前2 d，腹腔注射與生脈注射液治療組等體積的生理鹽水，每日1次，每次3 mL，直至實驗開始后第3天為止，共5 d。A組不予任何處理。各組大鼠分別于造實驗開始后的第3天處死，收集血液及胸腺、脾臟標(biāo)本。

　　1.2.2 動物模型建立方法 參照龐榮清[1]、張勻等[2]的創(chuàng)傷失血性休克動物模型制作方法[3]。①SD大鼠30只，實驗前12 h禁食，4 h禁水，術(shù)前稱重，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，麻醉成功后固定于手術(shù)臺上。②失血：造模大鼠麻醉成功后剪開右后肢皮膚及皮下組織，暴露股動脈，于股動脈按公式[4] [鼠重（g）×75 mL/1 000 mg×（0.2~0.3）]抽血（約5 mL），止血后無肉眼可見出血，縫合皮膚。③斷股骨：用夾鉗鉗夾大鼠雙側(cè)股骨中段，聽到咔嚓聲后，手中有骨摩擦感，即造成大鼠雙側(cè)后肢股骨骨折。④手術(shù)完成后維持大鼠創(chuàng)傷失血性休克0.5 h，于陰莖靜脈補充失血量兩倍的平衡溶液補充血容量。⑤大鼠末次給藥30 min后抽血處死，血液肝素抗凝后待檢。

　　1.2.3 血常規(guī)檢測 將肝素1∶25抗凝后的全血于采血后2 h內(nèi)用全自動生化分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測，上機前搖勻，防止血液分層。觀察血常規(guī)中白細(xì)胞（white bloodcell count，WBC）、淋巴細(xì)胞（lympholeukocyte，LY）、中性粒細(xì)胞（granulocyte，GR）比例變化。

　　1.2.4 T淋巴細(xì)胞亞群含量測定 將肝素1∶25抗凝后的全血于24 h內(nèi)進(jìn)行T細(xì)胞亞群含量測定。①取大鼠全血100 μL，放在分別標(biāo)有A、B、C的試管中。②A管分別放入CD3 FITC（為熒光素5-異硫酸鹽異構(gòu)體-Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和CD4 PE（熒光巰基化藻紅蛋白-Phycoerythrin，PE）熒光標(biāo)記抗體，各20 μL；B管分別放入CD 3FITC和CD8 PC5（熒光藻紅蛋白染料-Phycoerythrin-Cy5，PC5）熒光標(biāo)記抗體，各20 μL；C管分別放入CD8 PC5和CD4 PE熒光標(biāo)記抗體，各20 μL。③混勻后，室溫避光孵育30 min。④于A、B、C試管中分別加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min。⑤于離心機1 500 r/min離心5 min，去上清。⑥將10%PBS（磷酸鹽緩沖液-Phosphate Buffered Saline，PBS）溶液1 mL分別加入A、B、C試管中，充分混勻，于離心機1 500 r/min離心5 min，去上清。⑦再次重復(fù)步驟“⑥”后，上機利用CELL Quest軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，獲取數(shù)據(jù)。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

　　統(tǒng)計軟件SPSS 15.0處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間均數(shù)差異經(jīng)方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 三組大鼠治療后血常規(guī)變化比較

　　創(chuàng)傷失血性休克后，B組與A組比較，大鼠白細(xì)胞明顯升高（P = 0< 0.05），其中淋巴細(xì)胞所占比例明顯下降（P = 0.001< 0.05），中性粒細(xì)胞占比例明顯升高（P = 0< 0.05）。說明創(chuàng)傷失血性休克后，大鼠機體炎癥反應(yīng)較強，機體的免疫功能受到抑制。

　　生脈注射液治療后，C組白細(xì)胞總數(shù)較B組大鼠明顯下降（P =0< 0.05），淋巴細(xì)胞所占比例明顯上升（P = 0.007< 0.05），中性粒細(xì)胞占比例有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.001< 0.05）。這一結(jié)果表明，生脈注射液可以減輕創(chuàng)傷失血性休克后過度的炎癥反應(yīng)，提高受抑制的免疫功能。

2.2 三組治療后T淋巴細(xì)胞亞群變化比較

　　統(tǒng)計結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克造成大鼠外周血中CD3+T淋巴細(xì)胞亞群含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；予以生脈注射液治療后，C組大鼠外周血中CD3+T細(xì)胞總數(shù)較創(chuàng)傷失血性休克組大鼠明顯上升，且統(tǒng)計學(xué)意義顯著（P = 0.001< 0.05）。

　　同時，創(chuàng)傷失血性休克造成大鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.003 < 0.05）；相反，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.997 ＞ 0.05）；予以生脈注射液治療后，C組大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞總數(shù)較創(chuàng)傷失血性休克組大鼠明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.008 < 0.05）。

　　創(chuàng)傷失血性休克導(dǎo)致大鼠細(xì)胞免疫功能紊亂，CD4+/CD8+比值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.000 < 0.05）；與B組大鼠相比，C組大鼠機體免疫功能相對平衡，CD4+/CD8+比值有所上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.001 < 0.05）。

　　3 討論

　　本實驗的對照組實驗結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克后大鼠的免疫功能處于紊亂狀態(tài)，機體處于過度的炎癥反應(yīng)（白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顯著升高）和免疫防御機能受抑制的狀態(tài)。主要表現(xiàn)為：淋巴細(xì)胞含量降低，CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比值降低等。

　　為了使實驗效果更加顯著，本實驗在造模前2 d給予C組大鼠生脈注射液腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，在造模結(jié)束后的第3天筆者觀察到：C組大鼠的體重、精神狀態(tài)等均較A、B組良好。血常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)，C組大鼠白細(xì)胞含量有所下降，淋巴細(xì)胞所占比例相對升高，中性粒細(xì)胞所占比例相應(yīng)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明與對照組相比，實驗組大鼠的免疫功能有所升高，機體的炎癥反應(yīng)有所減輕。這與以往對生脈注射液的研究結(jié)果一致。有人將生脈注射液應(yīng)用于慢性、頑固性心衰的治療后得出結(jié)論，生脈注射液可以使心衰患者血液中白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的活性明顯降低[5-6]。廖澤云等[3]發(fā)現(xiàn)，生脈注射液可以調(diào)節(jié)骨髓造血系統(tǒng)、升高白細(xì)胞、刺激機體的造血能力，其作用和鯊肝醇相當(dāng)。本實驗推測，創(chuàng)傷失血性休克大鼠應(yīng)用生脈注射液治療后，其白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞含量增高的可能機制與生脈注射液可以提高血液中IgG抗體含量，提高T淋巴細(xì)胞數(shù)目和增強巨噬細(xì)胞吞噬能力有關(guān)，其減輕炎癥反應(yīng)的作用同樣是因為T淋巴細(xì)胞及吞噬細(xì)胞的數(shù)目增加，促炎性細(xì)胞因子釋放減少而實現(xiàn)的[8]。另外，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因還可能與生脈注射液與皮質(zhì)酮具有一定的量效關(guān)系有關(guān)[7]。

　　本研究還發(fā)現(xiàn)，生脈注射液對大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化亦可產(chǎn)生作用。應(yīng)用生脈注射液進(jìn)行治療后，創(chuàng)傷失血性休克大鼠外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞含量顯著增加，CD4+/CD8+比值有所升高，并與對照組差異顯著。本實驗得出結(jié)果印證了以上的研究報道。推測其作用機制可能與生脈注射液可以刺激大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加大鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力[8]以及生脈注射液可以使胸腺T細(xì)胞數(shù)量增加，使脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)性升高[9]；同時還刺激人體皮質(zhì)酮的分泌[10]有關(guān)。