肢體缺血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯窟M(jìn)展-醫(yī)學(xué)論文

1模型制作

　　1.1暫時(shí)缺血模型

　暫時(shí)缺血模型包括肢體缺血再灌注損傷模型[3]以及缺血預(yù)處理模型，適用于肢體缺血再灌注損傷的防治[4]、肢體遠(yuǎn)距缺血預(yù)處理[5]和肢體遠(yuǎn)距缺血后適應(yīng)[6]的研究。暫時(shí)缺血模型制作方法分為肢體環(huán)扎法和暫時(shí)阻斷動(dòng)脈法兩種。肢體環(huán)扎法是外用繃帶、止血帶或橡皮筋等物質(zhì)環(huán)扎于動(dòng)物單側(cè)或雙側(cè)肢體根部[4，7]，一段時(shí)間后放開，以此達(dá)到暫時(shí)缺血的目的。環(huán)扎時(shí)間視研究目的而異，缺血再灌注損傷一般為4h左右，而肢體缺血后適應(yīng)或肢體遠(yuǎn)距預(yù)處理多為5min，并反復(fù)多次進(jìn)行。肢體環(huán)扎法具有無(wú)創(chuàng)性，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損傷較小。暫時(shí)阻斷動(dòng)脈法通過(guò)手術(shù)分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某側(cè)局部供血?jiǎng)用}，用血管夾暫時(shí)夾閉血流，最少3h后撤夾恢復(fù)血流灌注，其效果比肢體環(huán)扎法可靠，但對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的損傷較大[8]。Messina等[2]將兩種方法相結(jié)合使用，以加強(qiáng)肢體的急性缺血程度，其效果較單純環(huán)扎或單純夾閉血管要好。大體上看，暫時(shí)缺血模型的建立方法簡(jiǎn)便、易行，效果能夠令人滿意，基本上可以符合實(shí)驗(yàn)要求。

　　1.2永久缺血模型

　　永久缺血模型是目前國(guó)內(nèi)外肢體急、慢性缺血模型的主流，在缺血損傷、血管新生、細(xì)胞移植及基因轉(zhuǎn)染等方面研究應(yīng)用最為廣泛[9-11]，其制作方法繁多，主要有血管結(jié)扎切斷法和血管栓塞法等。

　　1.2.1血管結(jié)扎切斷法血管結(jié)扎切斷法在暫時(shí)阻斷動(dòng)脈法基礎(chǔ)上，將分離出的某支供血?jiǎng)?、靜脈主干或其分支進(jìn)行結(jié)扎或切斷以造成急性血管永久阻斷從而引起缺血，為國(guó)內(nèi)外肢體缺血模型中最常用的制作方法。根據(jù)阻斷方式和阻斷血管的不同又可細(xì)分為單純結(jié)扎血管、結(jié)扎并切斷血管、動(dòng)靜脈雙阻斷和單純動(dòng)脈阻斷幾種類型。單純結(jié)扎血管法主要用于構(gòu)建缺血時(shí)間不超過(guò)2周的急性缺血模型。而結(jié)扎并切斷血管法比單純結(jié)扎血管所產(chǎn)生的缺血現(xiàn)象嚴(yán)重，缺血時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4周左右，甚至Luo等[12]通過(guò)2次手術(shù)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物更為嚴(yán)重的缺血，持久時(shí)間約60d，適用于慢性持續(xù)性肢體缺血模型的建立。動(dòng)靜脈雙結(jié)扎切斷雖可造成較嚴(yán)重的缺血損傷，但其引起的病理改變與外周動(dòng)脈疾病存在較大差異[13]，目前主要用于缺血模型影響因素方面的研究。而單純動(dòng)脈結(jié)扎切斷因其所引起的血流變化與臨床外周動(dòng)脈疾病相似而被廣泛應(yīng)用[13]，備選切斷的血管有股動(dòng)脈[14]、股動(dòng)脈及其分支[15]、髂總動(dòng)脈[16]以及髂、股動(dòng)脈及其分支[17-18]等，所引起的缺血損傷程度大體上依該次序遞增。不同學(xué)者因采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種不同，選擇結(jié)扎切斷的動(dòng)脈也不盡相同，單純切斷股動(dòng)脈或髂總動(dòng)脈一般用于下肢血管非常細(xì)的大鼠等小型動(dòng)物；結(jié)扎切斷髂股段動(dòng)脈及其分支，可用于犬、兔等大型動(dòng)物及小鼠、大鼠等小型動(dòng)物的造模[18-20]。若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下肢血管豐富，如小鼠解剖上雖然缺乏股深動(dòng)脈，但髂股段存在大量側(cè)支血管，則需同時(shí)切斷髂股段的主要分支以防止側(cè)支血流的快速重建[20]。以此類推，結(jié)扎并切斷髂股段動(dòng)脈及其分支為最普遍采用的永久缺血模型造模方法。

　　1.2.2血管栓塞法血管栓塞法采用外周性血管栓塞劑注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下肢供血?jiǎng)用}引起血管栓塞進(jìn)而產(chǎn)生缺血。不同栓塞劑栓塞效果不一。碘化油和明膠海綿屬于短期血管栓塞劑，不僅無(wú)法栓塞微血管網(wǎng)，且Kobayshi等[21]報(bào)道稱，增加栓塞次數(shù)，會(huì)導(dǎo)致組織缺氧引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及Bcl-2蛋白過(guò)量表達(dá)，加速形成側(cè)支循環(huán)而降低栓塞效果，缺血持續(xù)時(shí)間約1周，無(wú)法滿足慢性缺血的特性。而白及膠因其直徑小至3.5mm，可栓塞末梢小動(dòng)脈，維持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5周，隨后被降解吸收，可允許重復(fù)栓塞治療。而且堵塞在較大口徑血管內(nèi)的白及膠在血流的沖擊和溶解下，產(chǎn)生“遷徙”現(xiàn)象，到達(dá)更細(xì)的分支內(nèi)造成更均勻、徹底的栓塞，同時(shí)，白及可抑制革蘭陽(yáng)性菌而減少被栓塞器官的感染[22]。為進(jìn)一步提高栓塞效果，可將白及膠進(jìn)行乳化、凍凝、化學(xué)交聯(lián)后制備出白及膠微球，其不僅具有白及膠的特性，還能在血液中緩慢膨脹機(jī)械性阻塞血管，粗糙的表面可促使血小板解體，導(dǎo)致繼發(fā)性血栓形成，并可持續(xù)至少一個(gè)月不被溶解。因白及膠微球直徑僅為幾十微米，能更均勻、徹底地栓塞后肢小血管分支，達(dá)到完全性栓塞的效果，栓塞作用時(shí)間持久，效果穩(wěn)定，重復(fù)性好，是一種理想的肢體缺血模型制作方法[23]。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者多將其應(yīng)用于大鼠慢性肢體缺血模型的制作，國(guó)外還未見相關(guān)報(bào)道。

1.2.3其他方法采用不同手段使動(dòng)脈管腔縮窄或閉塞，適用于犬、兔等大型動(dòng)物造模。馬中等[24]、邊杰芳等[25]通過(guò)結(jié)扎包括股深動(dòng)脈在內(nèi)的所有分支，縱形切開股動(dòng)脈前壁0.5cm，自切開處向動(dòng)脈腔遠(yuǎn)端并列插入2根長(zhǎng)25~30cm，直徑1.5mm的螺旋狀金屬絲，插入后以無(wú)創(chuàng)血管縫線縫合動(dòng)脈切口，并使股動(dòng)脈管腔縮窄約1/2，逐層縫合皮下組織及皮膚的方法制作犬后肢缺血模型。其原理是通過(guò)置入的異物使血管內(nèi)皮受損，膠原成分暴露，激活外源性凝血機(jī)制，逐漸形成管腔內(nèi)血栓；同時(shí)金屬絲的機(jī)械栓堵人為將股動(dòng)脈管腔縮窄約1/2，迫使動(dòng)脈血流銳減，側(cè)支代償相對(duì)不足，而造成顯著的肢體慢性缺血癥狀。Grigorios等[26]通過(guò)將3-F導(dǎo)管插入新西蘭大白兔左股淺動(dòng)脈，并置入5個(gè)鉑金線圈的方法使動(dòng)物血管閉塞，成功制作肢體缺血模型。另外，Gale等[27]報(bào)道一種含有吸濕性酪蛋白的縮窄器，可吸收血管腔內(nèi)水分并逐漸膨脹，進(jìn)而阻塞整個(gè)血管腔，亦可用于制作慢性下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

　　2模型評(píng)價(jià)

　　2.1暫時(shí)缺血模型

　　骨骼肌缺血損傷是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，目前主要圍繞下述幾方面機(jī)制的指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行相應(yīng)評(píng)估：①能量代謝障礙。當(dāng)組織缺血時(shí)，有氧代謝途徑受阻而變?yōu)闊o(wú)氧代謝，乳酸、乳酸鹽大量增加對(duì)細(xì)胞造成損害，細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)酶及蛋白質(zhì)外漏，而致血中肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的含量明顯升高[4]。②氧自由基損傷。肢體缺血或再灌注時(shí)，肌體產(chǎn)生大量氧自由基使組織內(nèi)過(guò)多消耗超氧化物歧化酶（SOD），同時(shí)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化形成丙二醛（MDA）不斷損傷組織，并引起鈣超載，進(jìn)一步加重組織的損傷，故血清和骨骼肌SOD、MDA含量可反映組織氧自由基含量及氧化損傷程度[4]。③骨骼肌鈣離子超載和黃嘌呤氧化酶（XOD）[28]水平。骨骼肌缺血和再灌注后不斷產(chǎn)生的氧自由基損傷了細(xì)胞膜和線粒體膜，使Ca2+-ATP酶活性不斷降低，不能將胞內(nèi)的Ca2+泵出胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度明顯增加；同時(shí)，再灌注時(shí)鈣離子交換受阻，線粒體及溶酶體內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+與胞漿受體鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，激活蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)閄OD而大量堆積。④炎癥反應(yīng)。血清髓過(guò)氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，可反映中性粒細(xì)胞聚積的程度，下肢腓腸肌病理學(xué)檢測(cè)可觀察中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況[4]，通過(guò)檢測(cè)MPO含量及骨骼肌病理學(xué)觀察以明確炎癥反應(yīng)的程度。⑤血管內(nèi)皮損傷。其可通過(guò)腓腸肌濕重干重比測(cè)定[4]和病理學(xué)觀察加以確定。前者反映骨骼肌組織水腫程度，與再灌注損傷時(shí)組織微血管床損傷有關(guān)；后者可直觀形象地反映肢體骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況。此外，結(jié)合機(jī)體骨骼肌缺血損傷的臨床綜合表現(xiàn)，還需進(jìn)行肢體顏色、皮溫、活動(dòng)狀態(tài)等一般狀態(tài)觀察[16]。

　　2.2永久缺血模型

　　要想建立與嚴(yán)重慢性肢體缺血患者具有相似性的動(dòng)物模型，必須利用現(xiàn)有的技術(shù)手段，其中，微血管密度為判斷側(cè)支循環(huán)生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”[29]，血管造影和血流灌注測(cè)定是必備的監(jiān)測(cè)方法，從而客觀、具體地評(píng)價(jià)缺血的程度和時(shí)間。國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍以健側(cè)肢體作為對(duì)照，從形態(tài)和功能兩方面同時(shí)對(duì)下肢永久缺血模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[30]。①形態(tài)方面：通過(guò)各種血管造影等技術(shù)手段分析后肢側(cè)支血管數(shù)和微血管密度，最常用的血管造影術(shù)為動(dòng)脈注射數(shù)字減影法[15]，但其空間分辨率不高，細(xì)小血管顯示欠清晰，可采用CT血管造影[30]更逼真地顯示血管立體形態(tài)及其與周圍結(jié)構(gòu)關(guān)系。除此以外，還可結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察缺血組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行多方面評(píng)價(jià)模型缺血效果。②功能方面：采用功能等級(jí)評(píng)分表[31]（目前已形成的有鼠后肢缺血等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表[32]）結(jié)合動(dòng)物缺血損傷的一般臨床表現(xiàn)對(duì)肢體功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用激光多普勒灌注系統(tǒng)[17]測(cè)定下肢血流量、血壓和皮溫評(píng)價(jià)肢體血流灌注情況。近年越來(lái)越多的先進(jìn)技術(shù)被應(yīng)用于側(cè)支循環(huán)功能的評(píng)價(jià)，并各具特點(diǎn)，其中，放射性同位素灌注掃描簡(jiǎn)便易行，能準(zhǔn)確地定量、定位，但顯影所需時(shí)間較長(zhǎng)[20]；CT灌注成像能快速、無(wú)創(chuàng)、定量或半定量地反映組織血管生成及血流灌注，較準(zhǔn)確地評(píng)估動(dòng)物后肢缺血模型隨時(shí)間推移發(fā)生的肌肉組織灌注變化，但存在運(yùn)動(dòng)偽影、溶劑效應(yīng)等問(wèn)題[29]；核磁共振成像不需注射造影劑，是一種非介入探測(cè)技術(shù)，但掃描時(shí)間長(zhǎng)，空間分辨率不及CT，且價(jià)格較昂貴。

　　3問(wèn)題及展望

　　鑒于肢體缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹苽浞椒ā?shí)驗(yàn)條件控制等方面都取得了很大進(jìn)展，且CT、核磁共振成像等新技術(shù)在模型評(píng)價(jià)中的推廣應(yīng)用，很大程度促進(jìn)了肢體缺血模型的研究。但還有一些突出問(wèn)題尚待解決，主要體現(xiàn)在永久缺血模型的穩(wěn)定性和擬人性方面欠佳。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有極強(qiáng)的血管重建能力，并且急性缺血后局部產(chǎn)生的剪切力、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞的局部浸入以及動(dòng)物豐富的側(cè)支循環(huán)，使患肢能在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)血管新生，進(jìn)而恢復(fù)血流。許多研究發(fā)現(xiàn)，即使結(jié)扎并切斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢供血?jiǎng)用}，引起遠(yuǎn)端肢體缺血壞死的情況并不持久[16，28]，且不同的造模方法導(dǎo)致的缺血程度和持續(xù)時(shí)間差異較大，使得模型的穩(wěn)定性急待進(jìn)一步提高。另外，雙側(cè)下肢缺血造模死亡率高[20]，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般為單側(cè)造模，患肢由初期急性嚴(yán)重缺血可逐漸恢復(fù)到穩(wěn)定的輕度缺血狀態(tài)，而人的下肢慢性缺血往往發(fā)生在雙側(cè)，是一個(gè)緩慢的逐漸加重的過(guò)程。因此，如何建立一個(gè)擬人性較好、可行性高、重復(fù)性好的動(dòng)物慢性肢體缺血模型仍有待進(jìn)一步探索研究?？上驳氖且延袑W(xué)者開始對(duì)不同年齡[31]、不同品系[33]、不同性別[34]以及不同缺血效果[27]的動(dòng)物模型特點(diǎn)進(jìn)行比較研究，為關(guān)鍵問(wèn)題的解決提供了基本條件。同時(shí)，隨著不同實(shí)驗(yàn)方法的整合和各種新技術(shù)的發(fā)明應(yīng)用，必將進(jìn)一步推進(jìn)肢體缺血模型制作體系的完善。