多藥耐藥基因作用的新發(fā)現(xiàn)-醫(yī)學(xué)論文

在臨床上使用一種化療藥對(duì)腫瘤患者實(shí)施化療后，治療后的腫瘤細(xì)胞可同時(shí)對(duì)多種不同結(jié)構(gòu)的其他抗癌藥也產(chǎn)生耐藥性，這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥（multi-drugresistance，MDR）。人類腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的經(jīng)典途徑是由多藥耐藥基因（MDR1Gene）轉(zhuǎn)錄出MDR1mRNA，再由MDR1mRNA翻譯的糖蛋白（P-gp）介導(dǎo)的[1]。這種ATP酶依賴的跨膜蛋白P-gp，有將天然來(lái)源的藥物泵出細(xì)胞的功能，這可使細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低而導(dǎo)致MDR[2]。臨床上有時(shí)患者在外照射后對(duì)其后的化療不再敏感，即外照射也表現(xiàn)出了MDR表型。本文主要是觀察被照射的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系在外照射前后其總RNA、MDR1mRNA、藥物敏感性以及放射敏感性的變化，從而探討多藥耐藥基因是否還有其他未被揭示的新作用。

　　1材料與方法
　　1.1材料
　　上海科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系。該細(xì)胞系的生物學(xué)性狀參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]，其培養(yǎng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　1.2方法
　　1.2.1照射條件采用中國(guó)核動(dòng)力研究設(shè)計(jì)院實(shí)驗(yàn)工廠生產(chǎn)的GWGP80型遠(yuǎn)距離60Co治療機(jī)，照射條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。
　　1.2.2細(xì)胞的外照射當(dāng)NCI-H446細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后，用0.25%胰酶消化，并將吹勻的細(xì)胞懸液移入75ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞貼壁并匯合后進(jìn)行外照射，照射劑量為2Gy/次（戈瑞，輻射吸收劑量單位），中間恢復(fù)3d，總的外照射劑量為50Gy[5]。
　　1.2.3外照射前后NCI-H446細(xì)胞總RNA的提取分別取照射前后的NCI-H446細(xì)胞約1×107個(gè)，用PBS將NCI-H446細(xì)胞沖洗2遍，離心后棄上清液，各加1mlGibco公司生產(chǎn)的Trizol，吹打使NCI-H446細(xì)胞溶解，用氯仿液抽提后，加入異丙醇沉淀，用70%乙醇洗滌，然后涼干，最后加0.1%DEPC水溶解總RNA。提取后的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)260nm定量。
　　1.2.4RT-PCRRT-PCR的詳細(xì)過(guò)程參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。
　　1.3不同濃度的絲裂霉素（MMC）對(duì)外照射前后兩組細(xì)胞存活率的影響
　　1.3.1配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC的具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。絲裂霉素的血漿峰濃度為0.5μg/ml[7]。
　　1.3.2制備外照射前后兩組細(xì)胞相同濃度的單細(xì)胞懸液具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。
　　1.3.3細(xì)胞毒性試驗(yàn)具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。
　　1.3.4不同濃度絲裂霉素作用下兩組細(xì)胞的平均存活率細(xì)胞存活率的計(jì)算公式

　　細(xì)胞的平均存活率是每組6個(gè)樣本的細(xì)胞存活率的平均數(shù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。在相同的條件下細(xì)胞的存活率高，提示相對(duì)耐藥；反之，則相對(duì)敏感。

　　1.4加逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后不同濃度絲裂霉素（MMC）對(duì)外照射前后兩組細(xì)胞存活率的影響
　　1.4.1配制不同血漿峰濃度（PPC）的MMC方法同本文的“1.3.1”，但不用生理鹽水稀釋，而用細(xì)胞培養(yǎng)液1640溶解。
　　1.4.2逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米的配制取12.45ml的1640培養(yǎng)液加50μl的5mg/ml的維拉帕米即可制成濃度為20μg/ml的維拉帕米溶液[9]。
　　1.4.3制備外照射前后兩組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液方法同本文的“1.3.2”。
　　1.4.4細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)具體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。
　　1.4.5計(jì)算不同濃度絲裂霉素作用下和加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后兩組細(xì)胞的平均存活率見(jiàn)“1.3.4”所述。

　　1.5外照射前后NCI-H446細(xì)胞放射敏感性的變化
　　1.5.1外照射前后NCI-H446細(xì)胞存活率（S）的變化實(shí)驗(yàn)分Sc組和Rc組，每組各取3.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿18個(gè)。每個(gè)培養(yǎng)皿加入細(xì)胞300個(gè)，再加入1640應(yīng)用液1.5~2.0ml，每組細(xì)胞的18個(gè)培養(yǎng)皿再分成6小組，每組3個(gè)皿。分別給予0、2、4、6、8和10Gy6個(gè)不同劑量的外照射。1周后計(jì)算兩組細(xì)胞的集落形成率（PE）和每小組細(xì)胞的存活率（S），并比較兩組細(xì)胞的PE和在相同劑量外照射條件下的存活率。同時(shí)取原本細(xì)胞組的存活率最接近50%的外照射劑量作為下一步實(shí)驗(yàn)的外照射劑量。
1.5.2兩組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞死亡率的差別[10-11]取Sc和Rc各5組，每組3個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)皿中加入指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×104個(gè)，培養(yǎng)2~3d，使其貼壁并進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，按步驟“1.5.1”確定的2Gy放射劑量作為測(cè)試兩組細(xì)胞放射敏感性的外照射劑量。使用這個(gè)外照射劑量同時(shí)一次性照射兩組共30個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞。照射后分別于第2、4、6、8和10天各取1組共6個(gè)皿進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取每組3個(gè)皿細(xì)胞的平均數(shù)作為最后結(jié)果。每次將做完細(xì)胞計(jì)數(shù)的剩余單細(xì)胞懸液加入離心管，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后棄上清液，加入0.5%臺(tái)酚藍(lán)2~3滴將細(xì)胞染色，染色后的細(xì)胞點(diǎn)滴在血球計(jì)數(shù)板上，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞（白色）和死亡細(xì)胞（藍(lán)色），算出細(xì)胞死亡率（P）。細(xì)胞死亡率的計(jì)算公式如下：
　　
　　
　　1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2結(jié)果

　　2.1外照射前后NCI-H446細(xì)胞的總RNA濃度
　　在相同細(xì)胞數(shù)和相同體積的前提下，照射前后NCI-H446細(xì)胞總RNA的濃度分別為25.9mg/L和16.6mg/L。

　　2.2外照射前后NCI-H446細(xì)胞MDR1mRNA的RT-PCR結(jié)果

　　外照射前后NCI-H446細(xì)胞MDR1mRNA的RT-PCR的結(jié)果見(jiàn)圖1。除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見(jiàn)四條帶，它們依次為未照射細(xì)胞的β-actincDNA（簡(jiǎn)寫為β-actincDNA）、照射細(xì)胞的β-actincDNA（簡(jiǎn)寫為P-β-actincDNA）、未照射細(xì)胞的MDR1cDNA（簡(jiǎn)寫為MDR1cDNA）和照射細(xì)胞的MDR1cDNA（簡(jiǎn)寫為P-MDR1cDNA）。這四條帶經(jīng)Gelbase電腦軟件進(jìn)行光密度掃描所得的平均光密度（OD）值分別為59.49、49.76、64.14和66.60。這樣P-MDR1cDNA/P-β-actincDNA為1.388，而MDR1cDNA/β-actincDNA為1.078。
2.3外照射前后兩組細(xì)胞在不同濃度絲裂霉素作用下其存活率的變化
2.4外照射前后兩組細(xì)胞在加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后，其不同濃度絲裂霉素作用下存活率的變化
2.5兩組細(xì)胞在不同劑量外照射下的集落形成數(shù)、集落形成率和存活率的結(jié)果

3討論

　　在臨床上，化療和放療是治療腫瘤患者常用的兩種方法，但存在的主要問(wèn)題是化療后耐藥。在臨床工作中筆者也發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)現(xiàn)象，即放療后患者有時(shí)也會(huì)對(duì)其后的化療和再放療產(chǎn)生耐受，這個(gè)現(xiàn)象引起了筆者的關(guān)注，繼而探討放療是否也會(huì)對(duì)被照射細(xì)胞的MDR1gene有影響，并進(jìn)而影響其后的藥物敏感性和放射敏感性?；谏鲜鲈?，筆者設(shè)計(jì)了本課題，希望通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系實(shí)施分次外照射，來(lái)觀察其對(duì)被照射細(xì)胞的總RNA和MDR1mRNA的表達(dá)變化以及其對(duì)被照射細(xì)胞的藥物敏感性和放射敏感性所產(chǎn)生的影響，為今后的臨床工作提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的根據(jù)。

　　MDR1mRNA是細(xì)胞總RNA的組成部分，筆者很關(guān)注對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞在外照射后其總RNA的變化。外照射后對(duì)細(xì)胞總RNA的生物合成是有影響的，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為外照射后細(xì)胞總RNA的生物合成下降；相反的意見(jiàn)也同樣存在。研究者考慮這可能是由于細(xì)胞的代謝狀況、生長(zhǎng)周期和取樣時(shí)間不同所造成的[12]。本實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞受50Gy的外照射后，其總RNA的濃度由25.9mg/L下降到了16.6mg/L，生物合成受到明顯抑制。

　　MDR1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)是導(dǎo)致MDR的主要原因，因此，探討細(xì)胞受外照射后是否導(dǎo)致其后的化療呈MDR表型也應(yīng)該首先觀察外照射后其MDR1mRNA的表達(dá)變化。本研究通過(guò)對(duì)小細(xì)胞肺癌NCI-H466細(xì)胞系實(shí)施分次外照射建立了完成根治性外照射劑量的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系模型。從結(jié)果中圖1可見(jiàn)，除最上面的條帶Mr（DL2000）外，從上至下可見(jiàn)四條帶，它們依次為未照射細(xì)胞的β-actincDNA（簡(jiǎn)寫為β-actincDNA）、照射細(xì)胞的β-actincDNA（簡(jiǎn)寫為P-β-actincDNA）、未照射細(xì)胞的MDR1cDNA（簡(jiǎn)寫為MDR1cDNA）和照射細(xì)胞的MDR1cDNA（簡(jiǎn)寫為P-MDR1cDNA）。這四條帶經(jīng)Gelbase電腦軟件進(jìn)行光密度掃描所得的平均OD值分別為：59.49、49.76、64.14和66.60。這樣P-MDR1cDNA/P-β-actincDNA為1.388，而MDR1cDNA/β-actincDNA為1.078。這兩個(gè)比值反映了細(xì)胞照射以后和未照射前其MDR1mRNA的相對(duì)含量。比值大則反映其MDR1mRNA的表達(dá)強(qiáng)。這樣，從結(jié)果中可以看出照射后的比值1.388比照射前的比值1.078明顯增大，表明NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞經(jīng)體外總劑量為50Gy的外照射后其MDR1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。這意味著此種細(xì)胞很有可能對(duì)其后的化療耐藥。

　　上面探討了外照射對(duì)NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系MDR1mRNA的影響，結(jié)果表明其表達(dá)增強(qiáng)，但該細(xì)胞是否對(duì)其后的化療耐藥尚需做藥敏方面的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。本文采用了噻唑藍(lán)（MTT）法[6]，實(shí)測(cè)了兩組細(xì)胞在不同濃度化療藥物的干擾下，其各自不同的存活率，從而判斷其不同的藥物敏感性。1983年Mosman[13]首先將MTT法用于細(xì)胞毒試驗(yàn)的檢驗(yàn)，目前該法廣泛用于體外抗癌藥物敏感試驗(yàn)?；罴?xì)胞（紅細(xì)胞除外）中線粒體脫氫酶對(duì)可溶性MTT分解、轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生一種藍(lán)紫色結(jié)晶物——甲臜。甲臜溶解于二甲基亞砜（DMSO）中變成紫紅色溶液，在600nm左右波長(zhǎng)中測(cè)定其顏色的強(qiáng)度，它的顏色和活細(xì)胞成正比，因此根據(jù)其顏色的強(qiáng)弱可反映活細(xì)胞的多少，從而推算出腫瘤細(xì)胞在抗癌藥物中的存活率。腫瘤細(xì)胞的存活率越低，說(shuō)明此種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力越強(qiáng)，即敏感性越高，反之則敏感性越低[14]。

　　從本結(jié)果中表1和圖2可見(jiàn)，外照射后的體外細(xì)胞，在不同濃度的絲裂霉素作用下，照射后細(xì)胞的存活率均明顯高于未照射細(xì)胞。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外照射后NCI-H446細(xì)胞的體外化療藥物敏感性已經(jīng)降低，換句話說(shuō)即體外耐藥性提高。日本富田騰朗和美國(guó)Salmon等均研究過(guò)體外藥物試驗(yàn)和體內(nèi)臨床用藥的關(guān)系。他們的研究結(jié)果是兩者的相符合率為90%左右[8]。這個(gè)結(jié)論表明體外和體內(nèi)細(xì)胞的耐藥性關(guān)聯(lián)性很高。從表1和圖2的結(jié)果還可以看到，隨著干擾藥物濃度的提高，兩組細(xì)胞的存活率平穩(wěn)地下降，這說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的干擾藥物濃度較為合適。

　　上面的結(jié)果表明外照射后被照射細(xì)胞對(duì)其后的化療產(chǎn)生了耐藥性。那么這種耐藥性是否也可以被增敏劑所逆轉(zhuǎn)呢？為此，筆者做了如下的實(shí)驗(yàn)，即給已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥的細(xì)胞加入了一種常用的化療增敏劑維拉帕米，來(lái)觀察其耐藥性是否可以被逆轉(zhuǎn)。從表2可以看到，兩組細(xì)胞在加入逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米后，在化療藥絲裂霉素的濃度分別為0.1、10和20PPC時(shí)，存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明Rc組細(xì)胞的耐藥已被逆轉(zhuǎn)；而在絲裂霉素的濃度為1PPC時(shí)，Rc組細(xì)胞的存活率反而明顯低于未照射的Sc組細(xì)胞（P<0.01），這表明Rc組細(xì)胞的耐藥表現(xiàn)不僅被逆轉(zhuǎn)，且在這種情況下比Sc組細(xì)胞更敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明今后在肺癌化療時(shí)可以考慮同時(shí)應(yīng)用化療逆轉(zhuǎn)藥物。但有的逆轉(zhuǎn)藥劑量小時(shí)不起太多的作用，而劑量大時(shí)其帶來(lái)的副作用患者又難以忍受，因此，使用受到限制[15]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，臨床上曾使用兩種逆轉(zhuǎn)藥物聯(lián)用的辦法，取得了良好的逆轉(zhuǎn)效果[9]。

　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外照射不僅可以使被照射細(xì)胞的MDR1mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而且被照射細(xì)胞還對(duì)其后的化療藥產(chǎn)生了耐藥性，并且這種耐藥性可以被常規(guī)使用的化療增敏劑所逆轉(zhuǎn)。對(duì)外照射后被照射細(xì)胞對(duì)其后的放療反應(yīng)的問(wèn)題，筆者對(duì)Sc和Rc再給予相同劑量的外照射，來(lái)觀察這兩種細(xì)胞對(duì)相同條件的外照射的反應(yīng)。從表3結(jié)果可知，首先，Sc與Rc的集落形成率（PE）分別為（44.67±17.11）%和（13.11±0.15）%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明NCI-H446細(xì)胞經(jīng)50Gy的外照射后，其集落形成能力下降明顯；其次，在分別給予2Gy和4Gy的外照射后，Rc系的存活率（S）分別為（79.67±34.48）%和（23.73±8.62）%，而Sc系的存活率（S）分別為（51.24±11.88）%和（19.40±5.59）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明在2~4Gy范圍內(nèi)，Rc系較Sc系對(duì)外照射的抵御能力增強(qiáng)明顯。提示經(jīng)過(guò)外照射后，腫瘤細(xì)胞耐外照射的能力增強(qiáng)。臨床上也有這個(gè)現(xiàn)象，即在放療過(guò)的部位再放療時(shí)，效果明顯降低。Fertil等[16]認(rèn)為測(cè)定體外細(xì)胞的放射敏感性是判定腫瘤放療反應(yīng)的一個(gè)非常有用的指標(biāo)。Williams等[17]也認(rèn)為測(cè)定細(xì)胞放射敏感性可預(yù)測(cè)臨床放療效果；第三，本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)放療劑量達(dá)8Gy/次或以上時(shí)，兩組細(xì)胞的存活率（S）均為0。這提示臨床上如果單次放射劑量很大時(shí)，照射野內(nèi)的腫瘤細(xì)胞有可能被全部殺死，但同時(shí)正常細(xì)胞可能也難逃厄運(yùn)。

綜上所述，筆者可以得出如下結(jié)論：外放射可以使體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的MDR1mRNA表達(dá)增強(qiáng)；這種被照射細(xì)胞由于其MDR1mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，它對(duì)其后的化療藥產(chǎn)生了耐藥性，并且這種耐藥性還可以被化療增敏劑所逆轉(zhuǎn)；不僅如此，被照射的細(xì)胞對(duì)其后的放療也產(chǎn)生了耐受。表明化療藥以外的損傷因素也可以使多藥耐藥基因表達(dá)增強(qiáng)，而這些損傷因素所引起的多藥耐藥基因的高表達(dá)均可以使細(xì)胞對(duì)后來(lái)的其他損傷因素（如放療等）產(chǎn)生耐受。因此，多藥耐藥基因應(yīng)改稱耐多種損傷基因似乎更能體現(xiàn)其內(nèi)涵。