吲哚-2,3-二酮（ISA）對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核和染色體的影響

吲哚-2,3-二酮（ISA）亦稱2,3-吲哚醌，又名靛紅，系天然存在的吲哚類化合物，存在于人體和中藥青黛以及大青葉中, 是目前國(guó)內(nèi)自行研制開(kāi)發(fā)的Ⅰ類抗癌新藥靛玉紅化學(xué)二聚體結(jié)構(gòu)的單體。該物質(zhì)也存在于龍蝦體內(nèi)，是龍蝦生存所必需的一種天然海洋活性物質(zhì)[1] 。通過(guò)我們的前期研究工作表明，ISA有促進(jìn)人和小鼠神經(jīng)母瘤細(xì)胞凋亡的作用[2] 。本文在此工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究ISA對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核和染色體的影響，更深入探討其作為抗癌新藥的安全性。

1、材料與方法

1.1試劑與動(dòng)物：吲哚-2,3-二酮(青島大學(xué)藥理教研室)； 秋水仙素 (PH0025, Sigma)， 甲醇(AR)，冰醋酸(AR)，0.075％KCl(AR)溶液，小牛血清、Giemsa 儲(chǔ)備液、 pH 6.8磷酸鹽緩沖液。昆明種小鼠(二級(jí)),♀、♂各半，體重18～22g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：冀醫(yī)動(dòng)字04056。

1.2方法： 

1.2.1小鼠分組方式及骨髓細(xì)胞微核染毒試驗(yàn)：選定50只小鼠，隨機(jī)分為數(shù)量均等的5組，隨機(jī)確定陰陽(yáng)對(duì)照組各一個(gè)，實(shí)驗(yàn)組三個(gè)；陽(yáng)性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺20mg.kg-1.d-1，陰性對(duì)照組給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組中分低、中、高三種ISA劑量，分別給予ISA20, 60, 180 mg.kg-1 .d-1，腹腔注射，連續(xù)4d，第5天各組分別于24h、48h和72h取樣。

1.2.2小鼠骨髓細(xì)胞微核標(biāo)本制備及分析：采用頸椎脫臼處死小鼠，速剪取其胸骨，剔去肌肉，用干凈紗布擦拭，剪去每節(jié)骨骺端，用止血鉗擠出骨髓液，點(diǎn)在載玻片一端預(yù)先滴好的小牛血清中。混勻后推片。甲醇固定15min,Giemsa應(yīng)用液染色15min，沖洗染色液，晾干。

觀察計(jì)數(shù)：依次經(jīng)低倍鏡、高倍鏡粗檢后，選擇細(xì)胞分布均勻、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域鏡檢，然后在油鏡下按一定順序進(jìn)行微核計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE均值數(shù)，并且注意200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值。

1.2.3小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)染毒模型和分組：小鼠隨機(jī)分組,染毒方法同上。腹腔注射，連續(xù)4天，并在第4天染毒結(jié)束6小時(shí)之后取材。 

1.2.4小鼠骨髓染色體標(biāo)本的制備：按2μg/g體重的劑量，經(jīng)腹腔向小鼠體內(nèi)注射秋水仙素，2.5h后用頸椎脫臼的方法將小鼠處死， 取出完整股骨并擦凈， 7ml生理鹽水沖洗股骨髓液于離心管中，反復(fù)數(shù)次至骨髓發(fā)白,以1500r/min轉(zhuǎn)速，離心分離8min。去清液后加入37℃的0.075mol/L KCl溶液6ml，混合均勻，置于37℃的恒溫水浴中保溫15min，再加固定液1.5ml左右，搖勻并靜止少許,以1000r/min轉(zhuǎn)速離心分離10min。去清液后，加入新配制固定液5ml,充分混合，室溫下靜置15min，再以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，去清液。以同樣方法重復(fù)固定一次。留約0.5ml沉淀物，加0.2ml新固定液,混合均勻,得到細(xì)胞懸浮液。取少量細(xì)胞懸液滴于干凈濕冷的玻片上，輕輕吹散并干燥，在玻片標(biāo)本上滴加Giemsa染液，染色15min，用純凈水緩緩沖去染液至干凈，晾干。在低倍鏡下按一定順序選擇背景清晰、分散良好、染色收縮適中的中期分裂相細(xì)胞，用油鏡進(jìn)行分析, 小鼠染色體數(shù)目2n=40，每個(gè)標(biāo)本觀察80個(gè)，分析其染色體結(jié)構(gòu)，確定畸變數(shù)目，計(jì)算畸變率。

1.2.5分析統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS 11.5軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2、結(jié)果

2.1吲哚-2,3-二酮對(duì)小鼠微核的影響：每組小鼠按性別不同分別計(jì)算微核PCE的均值，結(jié)果顯示無(wú)明顯的性別差異，因此可合并計(jì)算結(jié)果。從計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，三種不同劑量的ISA微核形成率分別與陰性對(duì)照組比較，其差異并不顯著（P>0.05），而與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)論是三種不同劑量的ISA，還是陰性對(duì)照組，其差異則十分顯著（P<0.001）

ISA對(duì)小鼠微核（PCE）的影響（x±s‰）

組別            受檢細(xì)胞數(shù)	劑量（mg·kg-1）	24h	48h	72h
鹽水陰性對(duì)照         1000		1.65±0.5	2.13±0.8	2.91±0.7
環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照     1000	20	8.33±2.1*＃	14.5±3.0*＃	23.0±6.0*＃
ISA小劑量            1000	20	1.78±0.8	2.3±0.9	3.2±1.1
ISA中劑量            1000	60	1.8±0.6	2.5±0.9	3.7±1.2
ISA大劑量            1000	180	2.2±0.9	3.0±1.0	3.8±1.3

* 與陰性對(duì)照組比較P<0.001，＃與ISA劑量組比較P<0.001，

2.2 200個(gè)細(xì)胞中PCE與NCE的比值：三個(gè)ISA劑量組PCE/NCE比值均在0.71±0.2范圍內(nèi)，與陰性對(duì)照比較差異無(wú)顯著性（P>0.05）。而與陽(yáng)性對(duì)照組的0.082±0.01均值比較，則差異有顯著性（P<0.01）。

2.3 ISA對(duì)小鼠染色體畸變的影響：見(jiàn)表2所示：

表2  ISA誘導(dǎo)鼠細(xì)胞染色體畸變情況

實(shí)驗(yàn) 分組	細(xì)胞總數(shù)	數(shù)目畸變 細(xì)胞數(shù)	結(jié)構(gòu)畸變 細(xì)胞數(shù)	染色體畸 變總數(shù)	畸變率 （%）
鹽水對(duì)照組	80	3	2	5 25 6	6.2±1.7 31.3±3.8*＃ 7.5±1.9
環(huán)磷酰胺組	80	18	7
ISA組	80	5	1

*與陰性對(duì)照組比較P<0.01，＃與ISA劑量組比較P<0.01

3、討論

近年來(lái)已建立許多測(cè)定細(xì)胞遺傳損傷的短期試驗(yàn)，微核試驗(yàn)(Micro-nucleus Test)就是其中之一。一切進(jìn)行分裂的細(xì)胞，在染色體斷裂劑或能影響紡錘體的毒物作用下均產(chǎn)生微核。故利用微核試驗(yàn)可對(duì)藥物導(dǎo)致染色體損傷的情況進(jìn)行測(cè)定。

微核可出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，且在有核細(xì)胞中較難與正常核的分支相區(qū)別，由于紅細(xì)胞在成熟前最后一次分離后數(shù)小時(shí)可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此，計(jì)數(shù)PCE細(xì)胞中的微核數(shù)，便能檢測(cè)因化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變，以及檢測(cè)染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。

紅細(xì)胞的細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)顯示，其排核成為PCE后，通常在骨髓中停留約2～24h之后而入血[3] 。由于染毒次數(shù)及取樣時(shí)間不同，化學(xué)毒物誘發(fā)微核出現(xiàn)的高峰時(shí)間也不盡相同，波動(dòng)范圍往往可以達(dá)到24h～72h，所以要求在接觸化學(xué)毒物后設(shè)立不同的采樣時(shí)間點(diǎn)。本次微核試驗(yàn)采用了不同時(shí)間段取樣三次，結(jié)果顯示各組的微核形成率均表現(xiàn)為：72h>48h>24h，這與微核形成時(shí)相變化過(guò)程相符。而環(huán)磷酰胺組的微核形成率明顯高于陰性對(duì)照和ISA劑量組（P<0.001），表明其較強(qiáng)的遺傳毒性作用。高、中、低三種ISA劑量的微核率與陰性對(duì)照無(wú)明顯差異（P>0.05），同時(shí)PCE與NCE的比值均在正常范圍內(nèi)，提示ISA無(wú)毒性。

基因突變和染色體畸變的檢測(cè)直接反應(yīng)了化學(xué)毒物的致突變性，是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物致突變性唯一可靠的方法。當(dāng)染色體發(fā)生畸變時(shí)， 則會(huì)導(dǎo)致基因在位置及數(shù)量上發(fā)生改變,基因間的平衡性即被打亂[4] 。本文在進(jìn)行微核試驗(yàn)的同時(shí)亦進(jìn)行了染色體核型分析，旨在比較兩種試驗(yàn)結(jié)果的一致性。結(jié)果顯示環(huán)磷酞胺能誘發(fā)小鼠染色體畸變， 染色體畸變以數(shù)目異常占多數(shù)，主要表現(xiàn)為單價(jià)單體，結(jié)構(gòu)畸變表現(xiàn)為斷裂和易位現(xiàn)象，而陰性組和ISA組少有畸變，說(shuō)明環(huán)磷酞胺致染色體損傷的遺傳效應(yīng)[4] 。環(huán)磷酞胺組畸變率與ISA不同劑量組以及陰性對(duì)照組相比有顯著性差異，而ISA不同劑量組組與陰性對(duì)照組比較則無(wú)顯著差異（P>0.05）。

總之， ISA對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核和染色體的影響研究未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本文的結(jié)果表明ISA的無(wú)遺傳誘導(dǎo)毒性，為ISA藥物安全性提供了參考。