高效液相色譜法測(cè)定植物油料油脂中生育酚含量

生育酚是一類重要的脂溶性維生素，包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚，其體內(nèi)的抗氧化活性為：α-生育酚>β-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚。生育酚廣泛存在于植物油、豆類、堅(jiān)果等食品中，具有改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老和抗癌等功能。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦居民維生素E的膳食參考攝入量成年人為14 mg/d。人體缺乏生育酚會(huì)引發(fā)生育功能和免疫力下降、代謝失常、機(jī)體衰老等癥狀。ALSHIEK等[1]的研究表明生育酚可改善糖尿病患者的血管功能，RENGARAJ等[2]研究了維生素E對(duì)家禽繁殖能力的影響，結(jié)果表明家禽飲食中適量的維生素E可以顯著保護(hù)雄性禽類的精子質(zhì)量和雌性家禽產(chǎn)蛋質(zhì)量。HE等[3]研究發(fā)現(xiàn)膳食中補(bǔ)充50～100 mg/kg的維生素E能顯著改善動(dòng)物的生長(zhǎng)和腸道性能。此外，補(bǔ)充維生素E還能顯著增加腸道褶皺的高度和黏膜的厚度。LEESON等[4]研究了青壯年血漿中維生素E，總抗氧化狀態(tài)和血管功能的關(guān)系，結(jié)果顯示年輕時(shí)通過(guò)飲食攝入達(dá)到的維生素E濃度和總抗氧化狀態(tài)都與血管內(nèi)皮功能或動(dòng)脈擴(kuò)張性有關(guān)[4]。

食用植物油是居民攝入生育酚的重要來(lái)源。油料和食用油中生育酚的分析方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、比色法、電化學(xué)測(cè)定法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。彭祖茂等[5]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)植物油中生育酚、生育三烯酚、植物甾醇、β-胡蘿卜素和角鯊烯等14種營(yíng)養(yǎng)成分的方法，樣品需要經(jīng)過(guò)皂化處理，采用石油醚提取濃縮和梯度洗脫。ZHANG等[6]采用超聲輔助皂化、液液萃取，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定食用油中葉黃素、生育酚、豆甾醇、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素及番茄紅素等8種生物活性物質(zhì)的方法。FENG等[7]報(bào)告了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜生物傳感器用于檢測(cè)和定量植物油中的α-生育酚。在以上方法中，液相色譜法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用范圍最廣，主要包括正向液相色譜法和反向液相色譜法。其中，正相液相色譜法操作簡(jiǎn)單，僅需提取油脂后正己烷溶解過(guò)膜后即可上機(jī)檢測(cè)；反相液相色譜法普適性更廣，但樣品處理復(fù)雜，需皂化、提取、洗滌和濃縮，且方法穩(wěn)定性差、有機(jī)試劑用量大[8-11]。因此，建立前處理簡(jiǎn)單高效的反相高效液相色譜法以測(cè)定油料油脂中生育酚含量對(duì)提高檢測(cè)效率和結(jié)果準(zhǔn)確度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇，德國(guó)默克兩合有限公司；BHT2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(butylated hydroxytoluene，BHT)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：α-生育酚(純度≥96%)、β-生育酚(1.0 mg/mL)、γ-生育酚(純度≥96%)、δ-生育酚(純度≥90%)，Sigma aldrich。所有溶劑均為HPLC級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1200(微盤自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent1200柱溫箱 SL、Agilent1200二極管陣列檢測(cè)器 SL、Agilent1200二元泵 SL、Agilent1200高性能自動(dòng)進(jìn)樣器 SL、Poroshell 120 SB-C18液相色譜柱),美國(guó)安捷倫公司；AUY 220電子天平，日本島津公司；RephiLe PURIST UV超純水機(jī)，上海樂(lè)楓生物科技有限公司；DTC-15 J超聲波清洗機(jī)，鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司；L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Kylin-bell 旋渦混合器 VORTEX-5，其林貝爾儀器制造有限公司；15 mL具塞離心管,50 mL具塞離心管，美國(guó)Corning公司；Transferpette? S微量移液器，德國(guó)BRAND公司；1 mL無(wú)菌注射器，武漢市王冠醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；0.22 μm有機(jī)系濾膜，美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 植物油料樣品處理

稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)油料樣品，于15 mL離心管中，加5 mL異丙醇，加入0.1 g BHT，渦旋混合器渦旋10 min，50 ℃超聲提取30 min，再一次用渦旋混合器渦旋10 min，4 500 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm 有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.3.1.2 植物油樣品處理

稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)植物油樣品于15 mL離心管中，異丙醇定容至5 mL，加入0.1 g BHT，渦旋混合器渦旋10 min，0.22 μm的有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制5 mg/mL的α-生育酚、5 mg/mL的β-生育酚、5 mg/mL的γ-生育酚和5 mg/mL的δ-生育酚的異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用異丙醇稀釋并配制成1 mg/mL的4種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋至為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于棕色瓶中避光低溫保存。

1.3.3 色譜條件

Poroshell 120 SB-C18液相色譜柱(安捷倫公司)：柱溫30 ℃，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=90∶10,等度洗脫，流速0.75 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 料液比的優(yōu)化

采用傳統(tǒng)方法測(cè)定食品中的生育酚的反相液相色譜法，一般要經(jīng)過(guò)皂化、提取、洗滌、濃縮等步驟，過(guò)程繁瑣、耗時(shí)久。正相液相色譜方法直接正己烷提取即可檢測(cè)[12]，但正相液相色譜系統(tǒng)不如反相液相色譜系統(tǒng)使用普遍。如反相液相色譜法，也能將樣品提取溶劑溶解后直接檢測(cè)，樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單快速。

常見的提取生育酚的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、正己烷、正庚烷、丙酮、甲醇-丙酮、叔丁基甲基醚等，考慮到提取效率高、綠色環(huán)保、不易揮發(fā)穩(wěn)定等因素。異丙醇可以與植物油互溶，提高提取效率，避免損失[13]。對(duì)于固體物料，先進(jìn)行渦旋超聲提取，再離心處理，最后取上清液上機(jī)。甲醇和乙醇雖然也可以作為生育酚的提取溶劑，但是甲醇與乙醇和植物油不互溶，造成提取效率低下，而且與甲醇、乙醇相比，異丙醇較穩(wěn)定不易揮發(fā)。因此，選取異丙醇作為提取溶劑。

異丙醇溶液可以溶解食用油，也常用作油脂行業(yè)中棉籽油的萃取劑。稱取0.5 g樣品于離心管內(nèi)，用異丙醇溶解，定容至1、2、5、8、10 mL。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)提取劑定容體積小于5 mL時(shí)，稀釋體積不足，提取效率低，4種生育酚的回收率均低于80%。當(dāng)定容體積為5 mL 時(shí)，4種生育酚的回收率最高。繼續(xù)加大稀釋倍數(shù)，提取劑定容體積增大到8 mL和10 mL時(shí)，4種生育酚的回收率下降。因此，選擇異丙醇定容至5 mL。

圖1 料液比對(duì)生育酚提取效率的影響
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of tocopherol

2.1.2 超聲溫度

由于提取速率快、溶劑消耗低，超聲輔助提取已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取[14]。利用超聲振動(dòng)的方法，打破植物細(xì)胞壁，使溶劑快速地進(jìn)入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含有的有機(jī)成分盡可能地完全溶于有機(jī)溶劑中，得到多成分混合提取液，超聲波已被用于從包括食品中抗氧化劑的提取。本研究對(duì)超聲溫度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置了20、30、40、50、60 ℃ 5個(gè)溫度梯度進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，超聲有利于固體油料中生育酚的提取，當(dāng)溫度達(dá)到40、50、60 ℃時(shí)，4種生育酚的提取率較高，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，4種生育酚的回收率最大。因此，選擇超聲溫度為50 ℃。

圖2 超聲溫度對(duì)生育酚提取效率的影響
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction efficiency of tocopherol

2.1.2 抗氧化劑用量

維生素E油料油脂中主要的抗氧化劑之一，在空氣中易氧化。為了避免在提取過(guò)程中生育酚的氧化損失，參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26635—2011加入抗氧化劑BHT。BHT是食品工業(yè)常用的合成抗氧化劑，用作食品添加劑、制藥、石油產(chǎn)品、橡膠工業(yè)。大量研究表明，含有二叔丁基苯酚基團(tuán)的化合物具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種活性。通過(guò)將過(guò)氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫來(lái)進(jìn)行自動(dòng)氧化反應(yīng)[15-19]。本研究對(duì)BHT用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入BHT可提高檢測(cè)方法的回收率，且抗氧化劑BHT用量為0.1 g時(shí)4種生育酚的回收率最高。因此，選擇BHT加入量為0.1 g。

圖3 抗氧化劑的用量對(duì)生育酚提取效率的影響
Fig.3 Effect of antioxidant quality on tocopherol extraction efficiency

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

在高效液相色譜分析中，分離效果很大程度上取決于色譜柱的填料。4種生育酚結(jié)構(gòu)相似、極性接近，傳統(tǒng)的C18色譜柱難以實(shí)現(xiàn)β-生育酚和γ-生育酚基線分離。Poroshell 120色譜柱具有高柱效、高分離度的特點(diǎn)，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的樣品具有穩(wěn)定的高性能。本研究采用的Poroshell 120色譜柱粒徑為2.7 μm，由1.7 μm直徑的實(shí)心核和0.5 μm厚的多孔外層構(gòu)成。這種多孔層和實(shí)心核限制了擴(kuò)散距離，提高了分離速度，窄粒徑分布提高了柱效和分離度，可有效分開β-生育酚和γ-生育酚。

2.2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

本研究采用檢測(cè)最常用的反相高效液相色譜系統(tǒng)，分別用V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶50、V(甲醇)∶V(水)=95∶5、V甲(醇)∶V(水)=90∶10、V(甲醇)∶V(水)=85∶15、V(甲醇)∶V(水)=80∶20做流動(dòng)相進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的上機(jī)檢測(cè)。甲醇是強(qiáng)洗脫劑，其含量越高，流動(dòng)相的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)，可縮短檢測(cè)時(shí)間，但甲醇相比例高會(huì)導(dǎo)致β-生育酚與γ-生育酚或γ-生育酚與α-生育酚無(wú)法基線分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在流動(dòng)相為V甲(醇)∶V(水)=90∶10，流速0.75 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，等度洗脫10 min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm條件下，4種生育酚能夠得到基線分離，4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的峰圖如圖4所示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的質(zhì)量濃度都是20 μg/mL。

圖4 四種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
Fig.4 Chromatogram of four tocopherols

2.3 線性關(guān)系與方法檢出限

精確配制5、10、20、50、100 μg/g 5個(gè)濃度梯度的4種生育酚混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)前面優(yōu)化好的液相方法，在流動(dòng)相為V甲(醇)∶V(水)=90∶10，流速為0.75 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，等度洗脫10 min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm條件下將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析。4種生育酚的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。根據(jù)3倍和10倍信噪比確定4種生育酚化合物的檢測(cè)限和定量限。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的檢出限分別是0.16、0.21、0.20、0.22 μg/g。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的定量限分別是0.53、0.68、0.66、0.72 μg/g，均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 5009.82—2016)。分析結(jié)果表明這4種生育酚化合物的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 2、0.999 4、0.999 3和0.999 8，說(shuō)明這4種化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系好。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Table 1 Linear equation，linear ranges，correlation coefficients (R2), limit of detections (LODs) and limit of quantifications (LOQs) of target compounds

2.4 方法重現(xiàn)性、回收率與精密度

本研究分別在菜籽油樣品中加入1、10、100 μg/g 3種不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，算得的濃度減去空白樣品中生育酚的濃度計(jì)算方法的回收率。α-生育酚的回收率為92%～95%，β-生育酚的回收率為87%～101%，γ-生育酚的回收率為99%～109%，δ-生育酚的回收率為95%～98%。進(jìn)而，對(duì)方法精密度進(jìn)行考察，包括日內(nèi)精密度和日間精密度。精密度是對(duì)同一個(gè)菜籽油提取和測(cè)定3次，并連續(xù)做3 d，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，日內(nèi)和日間檢測(cè)結(jié)果方法RSD均小于15%，本方法具有較好的準(zhǔn)確性與精密度。

2.5 方法應(yīng)用

將該方法應(yīng)用于大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、棕櫚油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油、亞麻籽油、山茶油等10種主要植物油和油菜籽、芝麻、紫蘇等油料中的生育酚含量測(cè)定。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，大豆油的總生育酚含量最高，為971.86 mg/kg，葵花籽油中α-生育酚含量最高；而棕櫚油、橄欖油、葡萄籽油中生育酚的含量較低。以上結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道植物油中生育酚含量相符[7,20-21]。YANG等[22]綜述了不同形式的生育酚在營(yíng)養(yǎng)和藥理水平上的人類和實(shí)驗(yàn)室防癌活性的最新研究結(jié)果，α-生育酚是動(dòng)物體內(nèi)維生素E的主要形式, 在實(shí)現(xiàn)維生素E的基本抗氧化功能方面具有最高的活性, 由于氧化應(yīng)激參與腫瘤的發(fā)生, α-生育酚的防癌活性已被廣泛研究。

表2 方法的回收率和精密度(n=3)
Table 2 Recoveries and precision of the method(n=3)

表3 實(shí)際樣品中生育酚的含量及組成 單位：mg/kg

Table 3 Content and composition of tocopherol in actual samples

注：ND代表未檢出

3 結(jié)論

本文建立了油料中生育酚的反相高效液相色譜的檢測(cè)方法。用異丙醇做提取溶劑直接溶解植物油或油料樣品，采用超聲方法提高油料中生育酚，與國(guó)標(biāo)方法比較，減少了皂化、提取、洗滌和濃度等步驟，方法操作簡(jiǎn)單；相比正己烷、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑相比，本方法采用異丙醇提取效率更高，提高了提取效率和回收率。同時(shí)，減少了有機(jī)試劑的用量，更加綠色環(huán)保。方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，本方法可在10 min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)4種生育酚的完全基線分離，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的檢出限分別是0.16、0.21、0.20、0.22 μg/g，定量限分別是0.53、0.68、0.66、0.72 μg/g，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 2，回收率為87%～109%，精密度為1.88%～9.89%。該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確，為油料油脂中生育酚檢測(cè)提供重要技術(shù)支撐。