一株短乳桿菌烈性噬菌體的分離鑒定與生化特性研究

短乳桿菌(Lactobacillus brevis)是乳桿菌屬的成員之一，是一種專性異型發(fā)酵乳酸的乳酸菌，產(chǎn)生乳酸、二氧化碳、乙醇和乙酸，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，pH為4～6[1]。短乳桿菌的菌株被證實(shí)具有良好的益生特性，具有促進(jìn)腸道菌群健康和用作益生菌的潛力[2-4]。在食品發(fā)酵生產(chǎn)方面，由于其生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)酸性能好，且具有分泌細(xì)菌素等抑菌成分的能力[5]，常被用作發(fā)酵食品的發(fā)酵菌株或輔助發(fā)酵劑。在果蔬發(fā)酵中，短乳桿菌是起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段主要的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)于發(fā)酵果蔬的品質(zhì)形成發(fā)揮著多重作用，如改善食品風(fēng)味、增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、抑制雜菌生長(zhǎng)等[6-7]。在發(fā)酵乳品的生產(chǎn)中，短乳桿菌對(duì)干酪成熟的過程有一定的影響，能促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的形成[8]。在酸面團(tuán)的發(fā)酵中，能促進(jìn)面團(tuán)的酸化和風(fēng)味的形成，常與傳統(tǒng)面包酵母混合作為酸面團(tuán)的發(fā)酵劑[9-10]。

噬菌體是專性以細(xì)菌為宿主的病毒，分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。烈性噬菌體是指能在短時(shí)間內(nèi)完成吸附、侵入、增殖、成熟和裂解過程而實(shí)現(xiàn)增殖的噬菌體。乳酸菌發(fā)酵食品和益生菌菌劑生產(chǎn)中時(shí)常發(fā)生噬菌體污染，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)酸變慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，污染嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成發(fā)酵菌株快速死亡，致使發(fā)酵失敗。烈性噬菌體的污染和增殖是導(dǎo)致發(fā)酵食品生產(chǎn)失敗的主要因素之一。如何防止噬菌體的污染是食品發(fā)酵生產(chǎn)過程需解決的一個(gè)重要問題。目前，發(fā)酵食品中乳酸菌噬菌體的研究主要集中在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)噬菌體[11]、植物乳桿菌(Lactococcus plantaraum)噬菌體[12]、干酪乳桿菌(Lactococcus casei)噬菌體[13]等，而短乳桿菌噬菌體的研究較少，只有少數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道了相關(guān)的研究。DEASY等[14]從發(fā)酵的蔬菜中分離出短乳桿菌噬菌體，并研究了其在控制導(dǎo)致啤酒腐敗的短乳桿菌菌株方面的應(yīng)用，結(jié)果表明其在啤酒中具有穩(wěn)定作用，能控制宿主菌的生長(zhǎng)。

鑒于短乳桿菌噬菌體對(duì)食品發(fā)酵的危害和目前短乳桿菌噬菌體的研究仍較缺乏，本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵泡菜水環(huán)境中分離純化短乳桿菌烈性噬菌體，通過電鏡形態(tài)和核酸類型進(jìn)行鑒定，并且研究了生物學(xué)特性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為生產(chǎn)中防治相關(guān)噬菌體的污染和進(jìn)一步篩選抗噬菌體菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；柱法病毒DNA抽提試劑盒，廣州美基生物科技有限公司；Marker Q、RNase A、DNase I和T4連接酶，上海生工生物有限公司；DNA限制酶和DL 15 000 DNA marker，日本Takara公司；其余試劑為均為分析純。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

1.2.1 菌種

短乳桿菌CICC 6239，來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，用作于分離噬菌體的宿主菌。

1.2.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：用于宿主菌的活化與培養(yǎng)。

MRS-Ca培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加CaCl2至終濃度為10 mmol/L，用于噬菌體的分離、純化與增殖。采用雙層平板法分離純化噬菌體時(shí)，下層平板采用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂的MRS-Ca培養(yǎng)基，上層平板采用0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂的MRS-Ca培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；4-16K高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；EM-1200透射電子顯微鏡，日本Jeol公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 噬菌體的分離與純化

按1%的接種量將宿主菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期前期(OD600nm約為0.3)得到宿主菌液。分離樣品于5 000×g離心5 min后，取上清液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾后，取5 mL加入到含有5 mL兩倍濃度的MRS-Ca培養(yǎng)基中，然后加入宿主菌液100 μL；用5 mL無菌蒸餾水替代樣品濾液作為空白對(duì)照。30 ℃培養(yǎng)12～16 h，觀察樣品管是否澄清。將已澄清的增殖液離心后，上清液過0.22 μm無菌微孔濾膜過濾。取0.5 mL上述濾液加入到5 mL MRS-Ca液體培養(yǎng)基中，然后加入宿主菌液100 μL，30 ℃培養(yǎng)至完全澄清，采用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，得到增殖液。采用雙層平板法分離噬菌體，增殖液用MRS-Ca培養(yǎng)基作10倍梯度稀釋，取合適稀釋度的稀釋液0.5 mL與8 mL上層培養(yǎng)基(加熱融化后預(yù)冷至45 ℃)混合，再加入0.2 mL的對(duì)數(shù)期前期的宿主菌液，混合后傾倒于預(yù)先倒好底層培養(yǎng)基的平板上，凝固后于30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察上層平板中形成的噬菌斑。用無菌牙簽挑取上層平板中含有清晰單個(gè)噬菌斑的小瓊脂塊，轉(zhuǎn)移到0.5 mL MRS-Ca培養(yǎng)基中，渦旋振蕩后，加入0.2 mL宿主菌液，然后與8 mL上層培養(yǎng)基混合后，傾倒于底層平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h形成噬菌斑。將雙層平板分離，挑取噬菌斑純化和增殖重復(fù)操作5次，得到純化后的噬菌體。

1.4.2 噬菌體效價(jià)的測(cè)定

采用雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，待測(cè)增殖液用MRS-Ca培養(yǎng)基作10倍梯度稀釋，取合適稀釋度的稀釋液100 μL與等體積的宿主菌液混合后，加入到8 mL加熱融化后預(yù)冷至45 ℃的上層培養(yǎng)基中，混合均勻傾倒于下層平板上，凝固后于30 ℃培養(yǎng)24 h，通過平板上形成的噬菌斑數(shù)量計(jì)算噬菌體效價(jià)(pfu/mL)。

1.4.3 透射電鏡觀察

參考文獻(xiàn)[15]的方法并稍作修改后用于透射電鏡的觀察：純化后的噬菌體負(fù)染色后采用透射電子顯微鏡觀察毒粒形態(tài)。高效價(jià)(>1010 pfu/mL)的增殖液20 μL滴加到覆蓋有聚醋酸甲基乙烯脂膜的銅網(wǎng)上，靜置20 min后，用2%的醋酸鈾酰染色10 min，待干燥后用透射電子顯微鏡在120 V下觀察并拍照。

1.4.4 DNA提取與限制性酶切[16]

高效價(jià)(>1010 pfu/mL)的增殖液5 mL中加入RNase A和DNase I至終質(zhì)量濃度分別為1 μg/mL，于37 ℃保溫30 min，8 000×g離心5 min后，取上清液采用病毒DNA抽提試劑盒提取噬菌體DNA。噬菌體基因組采用RNase A、Mung Bean Nuclease、DNase I和限制酶EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物于65 ℃水浴中保溫10 min，然后用0.8%瓊脂糖電泳，GelRed染色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Quantitiy One軟件分析和估算酶切條帶的分子質(zhì)量大小。噬菌體DNA用T4連接酶處理后置于4 ℃冰箱12 h，連接產(chǎn)物用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，分析噬菌體基因組的包裝機(jī)制。

1.4.5 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

宿主菌接種到MRS-Ca中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600nm=0.5)，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。噬菌體新鮮增殖液經(jīng)稀釋后，與宿主菌液按不同比例混合，使感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為10、1、0.1、0.01、0.001，30 ℃ 100 r/min搖床上培養(yǎng)6 h后，8 000×g離心5 min后，取上清液測(cè)定效價(jià)。

1.4.6 一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600nm=0.5)的宿主菌液10 mL，8 000×g離心5 min棄上清液，用1 mL MRS-Ca培養(yǎng)基重懸菌體，按感染復(fù)數(shù)0.5加入相應(yīng)效價(jià)的噬菌體增殖液1 mL，于30 ℃吸附30 min，8 000×g離心5 min收集菌體細(xì)胞，重懸于100 mL MRS-Ca培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣測(cè)定上清液中的效價(jià)。一步生長(zhǎng)曲線以時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制。

1.4.7 物理與化學(xué)因素對(duì)噬菌體的影響

1.4.7.1 溫度對(duì)噬菌體存活的影響

噬菌體增殖液(108 pfu/mL)各取2 mL裝入到離心管中，分別在不同溫度條件下處理，在0.5、1、2、5、10、20、30 min時(shí)取樣測(cè)定效價(jià)，結(jié)果以效價(jià)隨時(shí)間變化的曲線表示。

1.4.7.2 pH對(duì)噬菌體存活的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)整噬菌體增殖液(108pfu/mL)的pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，30 ℃靜置30 min后，取樣測(cè)定效價(jià)，結(jié)果以效價(jià)隨pH變化的曲線表示。

1.4.7.3 化學(xué)消毒劑對(duì)噬菌體存活的影響

噬菌體增殖液(108 pfu/mL)中分別加入無水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、75%，分別加入1%的次氯酸鈉溶液至終質(zhì)量濃度為100、250、500 mg/L，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定效價(jià)，結(jié)果以效價(jià)隨時(shí)間變化的曲線表示。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定重復(fù)3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20進(jìn)行，不同處理件的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行，P<0.05表示有顯著性差異。采用OriginPro 8.5.1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離與鑒定

將經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的發(fā)酵泡菜水樣品與對(duì)數(shù)期的宿主菌菌液混合后，培養(yǎng)至澄清，培養(yǎng)液以10倍比例稀釋后，采用雙層平板法檢測(cè)，可見噬菌斑的形成。挑取單個(gè)噬菌斑經(jīng)過雙層平板反復(fù)純化5次后，可在雙層平板上觀察到清晰透明的圓形噬菌斑，直徑約為1～2 mm。該純化后的噬菌體命名為φB23。經(jīng)負(fù)染色后的φB23在透射電鏡下觀察其形態(tài)，如圖1所示。噬菌體φB23無包膜，由頭部和尾部組成，全長(zhǎng)(380.2±2.3) nm。頭部可觀察到典型的多面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑(106.7±8.1) nm；尾部觀察到可彎曲的長(zhǎng)尾，尾部長(zhǎng)(216.7±2.7) nm，寬(24.7±1.2) nm，未觀察到尾部的長(zhǎng)度可收縮。根據(jù)以上形態(tài)特征，按照國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的分類標(biāo)準(zhǔn)[17]，噬菌體φB23屬于尾噬菌體目(Caudovirales)、長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。

圖1 噬菌體φB23的負(fù)染色透射電鏡形態(tài)
Fig.1 Transmission electron micrograph of phage φB23 with negative staining

2.2 噬菌體基因組的核酸類型與限制性酶切

如圖2-a所示，噬菌體φB23的基因組經(jīng)RNase A處理后瓊脂糖電泳未發(fā)現(xiàn)有明顯的降解，而φB23基因組可以被DNase降解，表明噬菌體φB23基因組的核酸類型是DNA而不是RNA，φB23基因組不能被Mung Bean nuclease降解，表明不是單鏈核酸。綜合以上結(jié)果可知其基因組為雙鏈DNA。噬菌體φB23的基因組和經(jīng)T4連接酶過夜處理后的基因組用BamH I和EcoR I酶切后的瓊脂糖電泳圖譜如圖2-b所示。噬菌體φB23的基因組能被限制性內(nèi)切酶切開，經(jīng)BamH I酶切可產(chǎn)生8條條帶，EcoR I酶切可產(chǎn)生10條條帶，根據(jù)酶切片段大小估算噬菌體φB23的基因組大小約為52.4 kb(圖2-c)?；蚪M經(jīng)T4連接酶處理后，BamH I酶切后的條帶數(shù)比未連接基因組的酶切條帶有減少，表明噬菌體φB23基因組的包裝機(jī)制是黏末端連接。

2.3 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

將噬菌體φB23和宿主菌按不同的比例混合后，用雙層平板法檢測(cè)上清液中子代噬菌體的效價(jià)，結(jié)果如表1所示。當(dāng)感染復(fù)數(shù)從10降至0.001時(shí)，子代噬菌體的效價(jià)逐漸增加，到0.001時(shí)達(dá)到最大，為(8.97±0.13) lgpfu/mL；而感染復(fù)數(shù)從0.001到0.000 1 變化時(shí)，效價(jià)出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。因此，噬菌體φB23的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001。

a-RNase A、Mung Bean nuclease和DNase I酶切后的電泳圖(1-噬菌體φB23基因組；2-基因組經(jīng)RNase A酶切；3-基因組經(jīng)Mung Bean nuclease酶切； 4-基因組經(jīng)DNase I酶切)；b-限制性酶切后的電泳圖(M1-marker Q；5-基因組BamH I 酶切；6-基因組經(jīng)T4連接酶處理后再用BamH I酶切； M2-DL 15 000 DNA marker；7-基因組EcoR I 酶切；8-基因組經(jīng)T4連接酶處理后再用EcoR I 酶切)；c-基因組分子質(zhì)量大小分析
圖2 噬菌體基因組的酶切電泳圖及分子質(zhì)量分析
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of phage φB23 genome and analysis of its molecular weight

表1 噬菌體φB23最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
Table 1 Determination of multiplicity of infection

注：小寫字母表示不同MOI得到的效價(jià)有顯著性差異(P<0.05)

2.4 一步生長(zhǎng)曲線

噬菌體φB23的一步生長(zhǎng)曲線如圖3所示。從0～0.5 h時(shí)，噬菌體效價(jià)無明顯的變化，而從0.5～2 h時(shí)，噬菌體效價(jià)迅速增加，2 h以后效價(jià)基本不出現(xiàn)較大的變化進(jìn)入平臺(tái)期。從以上的效價(jià)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)可知，噬菌體φB23的潛伏期為30 min，裂解期為90 min，每個(gè)宿主細(xì)胞產(chǎn)生的子代噬菌體，即裂解量為(103.2±9.0) pfu/cell。

圖3 噬菌體φB23的一步生長(zhǎng)曲線
Fig.3 One-step growth curve of phage φB23

2.5 物理與化學(xué)因素對(duì)噬菌體的影響

溫度對(duì)噬菌體存活的影響如圖4所示，試驗(yàn)選擇了巴氏滅菌常用的63 ℃和72 ℃，以及50 ℃條件下，檢測(cè)噬菌體效價(jià)隨時(shí)間的變化。當(dāng)溫度為72 ℃時(shí)，噬菌體效價(jià)下降很快，處理1 min后，效價(jià)損失了將近60%，2 min后，存活率為未處理時(shí)的14.6%，5 min 后效價(jià)接近于0，活性基本喪失。當(dāng)溫度為63 ℃時(shí)，效價(jià)隨時(shí)間的下降過程較72 ℃平緩，2 min后效價(jià)下降至5.48 lgpfu/mL，5 min后為3.12 lgpfu/mL，10 min后的處理上清液在雙層平板上培養(yǎng)后觀察不到有噬菌斑的出現(xiàn)。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，噬菌體滅活的速度較慢，處理10 min后，效價(jià)下降至5.62 lgpfu/mL，30 min 后效價(jià)接近為0，表明噬菌體被滅活。

圖4 溫度對(duì)噬菌體φB23存活的影響
Fig.4 Effect of temperature on viability of phage φB23

圖5顯示了pH值對(duì)噬菌體存活的影響。在pH 3.0～8.0，噬菌體效價(jià)穩(wěn)定，與初始效價(jià)相比無顯著性差異，表明噬菌體φB23的耐酸性較好，在酸性和中性環(huán)境中維持了良好的裂解活性，符合其宿主短乳桿菌的生境特點(diǎn)。當(dāng)pH高于8.0時(shí)，噬菌體的效價(jià)下降明顯，pH 10.0時(shí)效價(jià)僅為初始效價(jià)的一半，表明噬菌體的耐堿性環(huán)境能力較弱。

圖5 pH對(duì)噬菌體φB23存活的影響
Fig.5 Effect of pH on viability of phage φB23

常用消毒劑乙醇和次氯酸鈉對(duì)噬菌體φB23的滅活作用如圖6所示。用75%的乙醇處理，噬菌體活性迅速下降，作用5 min，噬菌體效價(jià)跌至0.46 lgpfu/mL，10 min時(shí)完全喪失活性。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，噬菌體效價(jià)下降較慢，處理5 min效價(jià)為5.11 lgpfu/mL，10 min時(shí)為2.17 lgpfu/mL，20 min后完全滅活。而當(dāng)采用30%的乙醇處理，在測(cè)定的30 min范圍內(nèi)，噬菌體效價(jià)下降程度有限，處理30 min后，效價(jià)還能維持在4.54 lgpfu/mL，表明噬菌體能耐受該濃度的乙醇。采用次氯酸鈉作為消毒劑的試驗(yàn)中，500 mg/L的次氯酸鈉能迅速滅活，處理2 min 效價(jià)降至0.68 lgpfu/mL，5 min后完全滅活。采用250 mg/L也有較好的滅活效果，處理5 min效價(jià)為1.58 lgpfu/mL，10 min后完全滅活。當(dāng)次氯酸鈉質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)仍能有一定的滅活作用，處理20 min效價(jià)為3.24 lgpfu/mL，30 min后，殘存的效價(jià)為0.82 lgpfu/mL，表明實(shí)現(xiàn)了基本滅活。

a-乙醇；b-洗氯酸鈉
圖6 消毒劑對(duì)噬菌體φB23的滅活作用
Fig.6 Inactivation of phage φB23 by disinfectant

3 討論

噬菌體廣泛存在于食品發(fā)酵生產(chǎn)過程的環(huán)境中，噬菌體污染是導(dǎo)致發(fā)酵失敗的重要原因之一。與溫和噬菌體相比，烈性噬菌體由于能快速裂解發(fā)酵菌株細(xì)胞，造成菌株在短時(shí)間內(nèi)大量死亡，使得發(fā)酵變慢甚至停滯，對(duì)發(fā)酵的危害更大。本研究以短乳桿菌為宿主菌，從發(fā)酵泡菜水中分離和純化烈性噬菌體。由于樣品中天然存在的噬菌體濃度很低，如果對(duì)樣品直接采用雙層平板法分離，培養(yǎng)后常常無法觀察到清晰的噬菌斑，造成分離失敗。本實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期中前期的宿主菌與過濾后的樣品共培養(yǎng)，與不加樣品的空白對(duì)照相比，通過觀察培養(yǎng)液是否變澄清，來判定樣品中是否有該宿主菌的噬菌體，同時(shí)也對(duì)樣品中的目標(biāo)噬菌體進(jìn)行了富集，提高了分離的成功率。本文對(duì)短乳桿菌烈性的分離和生物學(xué)特性研究，為篩選抗噬菌體發(fā)酵菌株，建立防御噬菌體的方法和手段，開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

噬菌體的分類鑒定一般按照ICTV制定的方案[17-18]，依據(jù)為噬菌體的電鏡形態(tài)和核酸類型。目前已報(bào)道的短乳桿菌噬菌體[14,19-20]分屬于尾病毒目(Caudovirales)下的兩個(gè)不同的科，分別是肌尾噬菌體科(Myoviridae)和長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)，其中屬于肌尾噬菌體科(Myoviridae)的短乳桿菌噬菌體較為多見。本研究中分離純化的噬菌體φB23電鏡形態(tài)無包膜，由多面體結(jié)構(gòu)的頭部和可彎曲的長(zhǎng)尾構(gòu)成，φB23的核酸為雙鏈DNA，以上特征符合尾病毒目(Caudovirales)的描述。此外，由于在電鏡形態(tài)中未觀察到尾部的長(zhǎng)度可收縮，表明其屬于長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。具有雙鏈DNA的噬菌體其染色體呈線狀，在DNA復(fù)制過程中先形成多連體，然后在DNA包裝過程中切成所需要的長(zhǎng)度，切出的末端可能為平末端，也可能為黏性末端[21]。黏性末端經(jīng)連接酶處理后，堿基通過互補(bǔ)配對(duì)原則連接在一起，加熱處理后仍保持穩(wěn)定，再經(jīng)過限制性酶切，會(huì)導(dǎo)致條帶數(shù)目減少；如末端為平末端，經(jīng)連接酶處理后不穩(wěn)定，在較高溫度下連接會(huì)被加熱破壞而斷開，經(jīng)限制酶切后條帶數(shù)與未連接時(shí)沒有變化[22]。本實(shí)驗(yàn)分離的噬菌體φB23的基因組經(jīng)T4連接酶處理后，BamH I酶切后的條帶數(shù)減少，表明其包裝機(jī)制為黏末端連接。

噬菌體侵染宿主細(xì)胞后，先經(jīng)歷一段潛伏期，然后再進(jìn)入裂解期。潛伏期長(zhǎng)短和裂解量是衡量烈性噬菌體裂解能力的指標(biāo)之一。目前關(guān)于短乳桿菌烈性噬菌體裂解性質(zhì)的報(bào)道較少，尚缺乏可比較的數(shù)據(jù)。與已報(bào)道的其他乳桿菌噬菌體相比：類干酪乳桿菌(L.paracasei)噬菌體潛伏期30～85 min，裂解量28～69 pfu/cell[23]；干酪乳桿菌(L.casei)噬菌體潛伏期140～220 min，裂解量6～150 pfu/cell[13,24]；植物乳桿菌(L.plantarum)噬菌體潛伏期19～100 min，裂解量74～200 pfu/cell[24-25]。噬菌體φB23潛伏期和裂解期在這些乳桿菌噬菌體的范圍內(nèi)，屬于裂解性較強(qiáng)的噬菌體。噬菌體φB23具有較寬的pH適應(yīng)范圍，在pH 3.0～8.0的酸性和中性條件下能保持穩(wěn)定。φB23對(duì)溫度的耐受性較差，在巴氏滅菌條件下處理一段時(shí)間即可滅活。表明在日常生產(chǎn)中防止φB23污染可利用堿性溶液清洗環(huán)境和設(shè)備器皿，采用巴氏滅菌條件加熱處理物料和配料。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明φB23對(duì)高濃度的乙醇敏感，次氯酸鈉對(duì)其有很好的殺滅作用，采取上述消毒劑對(duì)環(huán)境定期消毒，能有效地去除發(fā)酵系統(tǒng)中可能存在的噬菌體。

4 結(jié)論

本研究從發(fā)酵泡菜水中分離到1株短乳桿菌烈性噬菌體φB23，采用雙層平板檢測(cè)時(shí)，該噬菌體能形成直徑1～2 mm、清晰透明的圓形噬菌斑。負(fù)染色后采用投射電鏡觀察，噬菌體由典型多面體結(jié)構(gòu)的頭部和可彎曲的長(zhǎng)尾組成，鑒定屬于尾噬菌體目(Caudovirales)長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。噬菌體φB23基因組由雙鏈DNA構(gòu)成，大小約為52.4 kb，包裝機(jī)制為黏末端連接。最佳感染復(fù)數(shù)為0.001，潛伏期為30 min，裂解期為90 min，裂解量為(103.2±9.0) pfu/cell。常用的巴氏滅菌溫度63 ℃和72 ℃，分別處理10 min和5 min能較好地滅活。噬菌體φB23在pH 3.0～8.0保持穩(wěn)定，pH>8.0時(shí)穩(wěn)定性受到較大的影響。φB23對(duì)體積分?jǐn)?shù)>50%的乙醇較敏感，75%乙醇處理10 min即喪失活性，次氯酸鈉能有效殺滅該噬菌體，500 mg/L處理5 min即能完全滅活。