集成納米增強(qiáng)基底的微流控SERS芯片及其致病菌檢測(cè)

將納米金屬溶膠通過(guò)外部注入的方式引入微流控芯片，使其與待測(cè)物進(jìn)行有效混合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)SERS光譜檢測(cè)。這種外部注入模式操作簡(jiǎn)單方便，但是其靈敏度和重復(fù)性很大程度上依賴于被分析對(duì)象和金屬納米粒子間的有效接觸和混合。按照有無(wú)外界能量驅(qū)動(dòng)的方式，芯片微通道中的混合過(guò)程可分為被動(dòng)混合和主動(dòng)混合兩種。

被動(dòng)混合式芯片通過(guò)合理設(shè)計(jì)流體通道的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和幾何特性，改變流體的流動(dòng)方式，增大混合面積來(lái)提高混合效率，具有操作簡(jiǎn)單靈活的特性。Lee等^［32］研制的鋸齒形聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道，如圖1（a），可用于高效混合孔雀石綠（MG）和Ag NPs，基于SERS對(duì)水中MG進(jìn)行檢測(cè)的檢出限低至12×10^-12 mg/L。Yea等^［33］在含有類似鱷魚(yú)齒形的PDMS微流體通道內(nèi)，使用SERS光譜技術(shù)對(duì)水體污染物中的氰化物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.5×10^-4 mg/L水平，如圖1（b）。

圖1  集成混合微通道的微流控SERS芯片示意圖^{［32-33，35-36］}

Fig.1  Microfluidic SERS chip integrated with mixed microchannels^{［32-33，35-36］}

主動(dòng)混合式芯片則是通過(guò)外力（包括電場(chǎng)、磁場(chǎng)、蠕動(dòng)泵等）的作用在通道內(nèi)使液體間產(chǎn)生相互運(yùn)動(dòng)來(lái)達(dá)到混合的效果^［34］。雖然主動(dòng)混合的混合效果優(yōu)于被動(dòng)混合，但是主動(dòng)混合式芯片的制備更加復(fù)雜，因此根據(jù)需求選擇合理的混合方式是非常有必要的。

液滴微流體芯片為改善顆?；旌闲阅芴峁┝诵碌耐緩?，待測(cè)樣本在液滴內(nèi)發(fā)生對(duì)流流動(dòng)，可以直接促進(jìn)其與納米膠體溶液的混合，避免納米粒子在連續(xù)流動(dòng)狀態(tài)下沉積聚集，以及在微通道壁上造成的 “記憶效應(yīng)”等對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾。Hidi等^［35］研制的液滴SERS微流控芯片（圖1（c））被用于檢測(cè)人體尿樣中的硝基唑啉（NTX），其檢出限為0.57 mg/L，線性范圍為0.81~8.13 mg/L。該平臺(tái)不僅實(shí)現(xiàn)了高通量的多路檢測(cè)，而且避免了樣品的交叉污染。Gao等^［36］在如圖1（d）所示的液滴微流控芯片上利用SERS光譜技術(shù)對(duì)血清中前列腺特異性抗原（PSA）進(jìn)行了檢測(cè)，其檢出限低至10^-4 mg/L。

采用外部注入納米溶膠與待測(cè)組分在微流控芯片的微通道中混合的方式，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物拉曼信號(hào)的有效增強(qiáng)，但同時(shí)也存在混合均勻性難以控制、耗時(shí)較長(zhǎng)、樣品難分離、通道堵塞以及納米溶膠隨機(jī)聚集等問(wèn)題，這會(huì)導(dǎo)致SERS光譜信號(hào)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差，不利于生化樣本的高效檢測(cè)^［37］。因此，在固體表面基板上設(shè)計(jì)固定有序的微納米結(jié)構(gòu)，用于制備微流控SERS芯片引起了人們的關(guān)注。

近年來(lái)，在微流控芯片的微通道或微腔室中集成SERS增強(qiáng)納米基底的研究備受關(guān)注。由于固定納米基底的有序結(jié)構(gòu)，其信號(hào)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性比基于混合模式的納米溶膠的SERS增強(qiáng)效應(yīng)更好。目前用于制備固定有序納米增強(qiáng)SERS基底的方法較多，包括：電化學(xué)沉積法、電子束光刻法、濺射法、自組裝法等。我們課題組^［38-40］在微流控芯片上制作了多種有序納米結(jié)構(gòu)的SERS增強(qiáng)基底，其中采用電化學(xué)沉積法制備的ITO-rGO/Ag和Ag-Au增強(qiáng)基底，分別對(duì)羅丹明6G和4-巰基苯甲酸進(jìn)行了SERS檢測(cè)，最低檢出限分別為10^-11 mol/L和10^-10 mol/L。Chen等^［41］以超薄陽(yáng)極氧化鋁（AAO）薄膜為模板，在石英玻璃片上沉積有序Ag納米點(diǎn)陣作為增強(qiáng)基底，如圖2（a），檢測(cè)了濃度為5.0×10^-7 mol/L的腺嘌呤和福美雙。Viehrig等^［42］使用離子蝕刻技術(shù)，在硅片上制備納米柱，通過(guò)電子束光刻法在柱上形成了厚度為160 nm的Au帽，如圖2（b），實(shí)現(xiàn)了牛奶中三聚氰胺的SERS檢測(cè)。Zhao等^［43］通過(guò)FDTD模擬設(shè)計(jì)陣列Si的尺寸，利用光刻和納米光刻技術(shù)相結(jié)合方法，在微流控 SERS芯片內(nèi)制備了高度有序的Ag/Si納米柱陣列，如圖2（c），用于大型生物分子如DNA的檢測(cè)，可獲得高度可重復(fù)的SERS信號(hào)。Galarreta等^［44］采用自上而下納米制造技術(shù)，在玻璃表面通過(guò)電子束光刻法制備Au三角形納米結(jié)構(gòu)，將其嵌入PDMS制成的微流控通道中，如圖2（d），經(jīng)過(guò)適配體序列修飾后，用于對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行選擇性識(shí)別和SERS檢測(cè)。Wang等^［45］采用自組裝法制備的NaYF₄∶Yb，Er@SiO₂@Au復(fù)合SERS基底集成到“三明治”結(jié)構(gòu)的微流控芯片（圖2（e））上，在近紅外激發(fā)下對(duì)R6G和大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，具有良好的靈敏度和重現(xiàn)性。

圖2  微通道中集成有序納米基底的微流控SERS芯片^［41-45］

Fig.2  Microfluidic SERS chip based on fixed ordered nano-substrate in microchannel^［41-45］

采用“原位制造”方式獲得的微流控SERS芯片，是指直接在微流控通道中進(jìn)行SERS增強(qiáng)基底的制備，并可在固定的微納米結(jié)構(gòu)處同步實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣本的SERS光譜檢測(cè)，常用的制備方法有化學(xué)法和飛秒激光技術(shù)等^［46］。

我們課題組^［47-49］通過(guò)自組裝-化學(xué)鍍法在微流控通道中原位制備了多種SERS基底，其中制備的Au@Ag/TIO₂ NTs基底對(duì)羅丹明6G的最低檢出限為10^-10 mol/L，增強(qiáng)因子為1.15×10⁸。Parisi等^［50］首先通過(guò)原位電沉積Cu核/C鞘納米墻，隨后采用置換法原位合成Ag納米顆粒從而制備了新型納米墻結(jié)構(gòu)的微流控SERS芯片（圖3（a））用于結(jié)晶紫檢測(cè)，檢出限達(dá)5×10^-11 mol/L，SESR增強(qiáng)因子達(dá)1.16×10⁹。Wang等^［51］采用化學(xué)置換方法，在微通道內(nèi)制備三維Ag枝晶（圖3（b））用于阿莫西林的SERS檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到10^-3 mg/L。Lawanstiend等^［52］通過(guò)化學(xué)還原法將AgCl還原為Ag，在微通道中原位制備了具有SERS活性的介孔Ag結(jié)構(gòu)，對(duì)唾液中的硫氰酸鹽的檢測(cè)限達(dá)到了10^-7 mol/L。

圖3  基于微通道中原位制備有序納米基底的微流控SERS芯片^［50-53］

Fig.3  Microfluidic SERS chip based on in-situ preparation of ordered nano-substrate in microfluidic channel^{［42-43，45-46］}

飛秒激光技術(shù)是另一種可用于在微流控通道中原位制備三維復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)襯底的更新穎、強(qiáng)大的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)主要是可以在微流控通道的任何位置精確而靈活地形成各種圖案的納米結(jié)構(gòu)。Xu等^［53］將銀鹽溶液注入芯片的微通道，利用飛秒激光脈沖聚焦于所需位置，將Ag⁺還原制備得到銀納米板，如圖3（c）。后來(lái)，他們課題組^［54］用相同的方法制作了銀微花陣列，如圖3（d），用于原位監(jiān)測(cè)4-硝基苯酚（4-NP）還原反應(yīng)，對(duì)其還原產(chǎn)物4-氨基苯酚（4-AP）實(shí)現(xiàn)了監(jiān)測(cè)。Xie等^［55］利用激光熱效應(yīng)催化原位制備得到高度可控、靈敏的3D Ag@ZnO 納米簇SERS增強(qiáng)基底，由于納米簇完全在激光光斑范圍內(nèi)生長(zhǎng)，因此通過(guò)移動(dòng)激光束可實(shí)現(xiàn)對(duì)三維Ag@ZnO納米簇結(jié)構(gòu)位置的編程控制。

在微通道中原位制備SERS基底可使SERS檢測(cè)模式與微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)完美結(jié)合，使整個(gè)分析芯片具有多功能一體化和整體集成化的特性。原位制備SERS基底的微流控SERS系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更可控、更靈活的納米結(jié)構(gòu)基底制備，提供固定的熱點(diǎn)，使樣本的SERS信號(hào)具有更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，檢測(cè)靈敏度也更高。并且固定的微納米結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步修飾改性，在生化樣本的檢測(cè)靈敏度和選擇性提升方面顯示出強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。但是這種SERS基底的集成模式對(duì)納米微結(jié)構(gòu)制備技術(shù)要求較高，同時(shí)芯片的清洗難度大，難以重復(fù)利用。

致病菌濃度在實(shí)際生化樣本中通常很低^［18］，因此對(duì)致病菌進(jìn)行分離富集并減少實(shí)際樣品中的雜質(zhì)干擾，進(jìn)而獲得可靠的致病菌指紋圖譜是進(jìn)行后續(xù)光譜分析與處理的前提。微流控SERS結(jié)合了微流控的微型、高效、自動(dòng)化和SERS的高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，可以在微流控芯片上進(jìn)行細(xì)菌分離、富集等預(yù)處理，然后進(jìn)行高靈敏度的SERS檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)致病菌的快速檢測(cè)識(shí)別。微流控芯片中細(xì)菌富集方法可以分為兩種，分別是被動(dòng)分離富集（過(guò)濾、慣性微流等^［63-64］）及主動(dòng)分離富集（離心沉降、介電電泳、光微流控、磁分離富集等^［65-67］）。

被動(dòng)分離富集是指無(wú)外加能量而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分離富集，當(dāng)前最成熟的方法是多孔膜過(guò)濾法。圖4為用于細(xì)菌分離富集和檢測(cè)的微流控SERS芯片^［68-70］。Krafft等^［68］設(shè)計(jì)了一種利用納米孔膜實(shí)現(xiàn)細(xì)菌富集和SERS檢測(cè)的三維微流控芯片，如圖4（a），其由納米多孔膜連接的兩個(gè)垂直微通道組成，樣品在多孔膜上被電驅(qū)動(dòng)而流動(dòng)，將待測(cè)細(xì)菌和AgNP簇在多孔膜上捕獲、濃縮并進(jìn)行原位SERS檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了飲用水中大腸桿菌（2.47×10⁸ Cells/mL）和臺(tái)灣假單胞菌（3.8×10⁷ Cells/mL的快速檢測(cè)。Chang等^［69］設(shè)計(jì)了集成膜過(guò)濾和SERS增強(qiáng)基底的微流控系統(tǒng)，如圖4（b），在芯片上進(jìn)行了大腸桿菌的富集、代謝物收集和原位SERS測(cè)量，對(duì)大腸桿菌的最低檢出限為10³ CFU/mL，比離心純化過(guò)程降低了4個(gè)數(shù)量級(jí)。盡管基于過(guò)濾膜的微流控芯片制備比較簡(jiǎn)單，但是卻存在吞吐量較低、不可重復(fù)使用以及對(duì)粘稠度高的生化樣本不適用的問(wèn)題^［71］。

  

  

  

圖4用于細(xì)菌分離富集和檢測(cè)的微流控SERS芯片^［68-70］

Fig.4Microfluidic SERS chip for bacteria separated， concentrated and detection^［68-70］

主動(dòng)分離富集是指通過(guò)外加能量，如外加電場(chǎng)、磁場(chǎng)、激光操縱、聲表面波等實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分離富集。Cheng等人^{［70，72-73］}研制了多種DEP微流控SERS芯片對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離、富集和SERS檢測(cè)。他們通過(guò)在同心圓微流控器件的中心電極上制作納米Au，如圖4（c），在外加電壓下可從人體血液中快速提取稀有病原菌，并使其富集于芯片SERS增強(qiáng)基底位置上進(jìn)行SERS檢測(cè)，利用獲取的SERS光譜成功識(shí)別出了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌，三種菌的的檢出限分別為3×10³、1×10⁴和5×10³ CFU/mL^［70］。Witkowska等人^［74］利用磁分離微流控芯片將牙齦卟啉單胞菌從復(fù)雜樣本中分離出來(lái)，獲得了更好的牙齦卟啉單胞菌SERS信號(hào)。

微流控SERS芯片能夠提供一種高靈敏度及可重復(fù)性的檢測(cè)條件^{［67，75］}，同時(shí)集成微流控SERS平臺(tái)可以避免光譜干擾，提高細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度，因此將SERS和微流體器件結(jié)合是實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)、可重復(fù)性測(cè)量及良好定義空間檢測(cè)區(qū)域的理想平臺(tái)^［37］。當(dāng)前致病菌主要依賴于SERS標(biāo)簽（SERS-Tag）進(jìn)行定量檢測(cè)。

Madiyar等^［77］報(bào)道了一種DEP微流控SERS芯片，通過(guò)在微流控芯片底部嵌入垂直排列的碳納米纖維電極陣列，將SESR-Tag標(biāo)記的大腸桿菌捕獲和濃縮到200 μm×200 μm區(qū)域上進(jìn)行SERS檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至210 CFU/mL，線性范圍為5~10⁹ CFU/mL。Shi等^［79］設(shè)計(jì)了一種基于SERS的橫向流動(dòng)免疫分析法的生物傳感器用于快速檢測(cè)生物樣品中的大腸桿菌O157∶H7。通過(guò)制備經(jīng)兩層拉曼報(bào)告分子DTNB和單克隆抗體修飾的金殼二氧化硅核納米球結(jié)構(gòu)作為SERS-Tag，與大腸桿菌O157∶H7有效結(jié)合后，在測(cè)試紙上形成三明治免疫復(fù)合物。通過(guò)測(cè)量DTNB的特征峰強(qiáng)度，可以輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157∶H7的定量檢測(cè)，對(duì)PBS溶液中的大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)限低至50 Cells/mL，對(duì)自來(lái)水、牛奶、人尿、生菜提取物和牛肉等生物樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢出限為100 Cells/mL。Catala等^［78］設(shè)計(jì)了一種用于快速超靈敏定量檢測(cè)人體體液中金黃色葡萄球菌的微流控芯片，通過(guò)檢測(cè)經(jīng)抗體或適配體功能化的SERS-Tag的報(bào)告分子MBA在1 078 cm^-1處的拉曼峰的強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿液、血液、胸膜積液及腹水中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，濃度低于15 CFU/mL。

由于致病微生物主要由拉曼散射截面較小的生物分子構(gòu)成，拉曼活性較低，并且SERS基底與致病菌的表面接觸有限，采集的SERS光譜不能全面地反映致病菌的指紋信息。因此，細(xì)菌檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性還有待提高。SERS 直接檢測(cè)在復(fù)雜體系中極易受到干擾信息的影響，因此提高檢測(cè)方法的選擇性是 SERS 技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際復(fù)雜檢測(cè)體系的關(guān)鍵。同時(shí)，由于細(xì)菌大小只有0.5~1.0 μm，很難將金屬納米粒子引進(jìn)如此小的細(xì)菌中，所以，到目前為止SERS只實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌表面細(xì)胞壁的探測(cè)^［79］。如何利用SERS檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，認(rèn)識(shí)并獲取更多致病菌細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分等信息，也將成為研究者們關(guān)注的課題。